Name: quantification of immunostained caspase-9 in retinal tissue
Uploaded: 2022-07-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 e dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) del National Institutes of Health (NIH), numero di premio F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (a CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (a AMP), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 a CMT), e il Dipartimento della Difesa Esercito/Aeronautica (da DURIP a CMT).

Questo protocollo segue la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. Gli esperimenti sui roditori sono stati approvati e monitorati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Columbia University.
1. Preparazione del tessuto retinico e criosezione
<ol><li>Eutanasia degli animali mediante somministrazione di anestesia intraperitoneale (ketamina (80-100 mg/kg) e xila...

<ol>
	<li>Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+in+cell+death,+inflammation,+and+disease.">Caspases in cell death, inflammation, and disease.</a> Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).</li><li>Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+caspase+mechanisms.">A primer on caspase mechanisms.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).</li><li>Troy, C. M., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases:+therapeutic+targets+in+neurologic+disease.">Caspases: therapeutic targets in neurologic disease.</a> Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).</li><li>Avrutsky, M. I., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9:+a+multimodal+therapeutic+target+with+diverse+cellular+expression+in+human+disease.">Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).</li><li>Fuchs, Y., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+in+animal+development+and+disease.">Programmed cell death in animal development and disease.</a> Cell. 147 (4), 742-758 (2011).</li><li>Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+retinal+vein+occlusion+mouse+model+to+limit+variability.">Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).</li><li>Tisch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-8+modulates+physiological+and+pathological+angiogenesis+during+retina+development.">Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).</li><li>Chi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB1+promotes+the+activation+of+NLRP3+and+caspase-8+inflammasomes+via+NF-kappaB+pathway+in+acute+glaucoma.">HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).</li><li>Thomas, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-2+mediates+site-specific+retinal+ganglion+cell+death+after+blunt+ocular+injury.">Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).</li><li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon/neuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke.">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li><li>London, A., Benhar, I., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retina+as+a+window+to+the+brain-from+eye+research+to+CNS+disorders.">The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).</li><li>Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epidemiology+of+retinal+vein+occlusion:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+prevalence,+incidence,+and+risk+factors.">Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors.</a> Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).</li><li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon/neuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke.">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).</li><li>Kuida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+apoptosis+and+cytochrome+c-mediated+caspase+activation+in+mice+lacking+caspase+9.">Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9.</a> Cell. 94 (3), 325-337 (1998).</li><li>Troy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+in+the+balance:+alternative+participation+of+the+caspase-2+and+-9+pathways+in+neuronal+death+induced+by+nerve+growth+factor+deprivation.">Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).</li></ol>

Le caspasi sono una famiglia multi-membro di proteasi meglio studiata per i loro ruoli nella morte cellulare e nell'infiammazione; Tuttavia, più recentemente sono state scoperte una varietà di funzioni non di morte per alcuni membri della famiglia 4,5. Gran parte della nostra comprensione della funzione delle caspasi deriva dal lavoro sulla coltura cellulare e dai dati inferenziali delle malattie umane. Mentre è apprezzato che vi sia un'induzione, attivazione ...

Le caspasi sono una famiglia di proteasi che regolano la morte cellulare dello sviluppo, le risposte immunitarie e la morte cellulare aberrante nella malattia 1,2. Mentre è ben noto che i membri della famiglia delle caspasi sono indotti in una varietà di malattie neurodegenerative, capire quale caspasi guida la patologia della malattia è più difficile3. Tali studi richiedono strumenti per identificare, caratterizzare e convalidare la funzione dei singoli membri della famiglia delle caspasi. L'analisi delle singole caspasi rilevanti è importante sia da un punto di vista meccanicistico che terapeutico, poiché la letteratura ha molteplici studi che forniscono prove dei diversi ruoli delle caspasi 4,5. Pertanto, se l'obiettivo è quello di indirizzare una caspasi in una malattia per un beneficio terapeutico, è fondamentale avere un targeting specifico dei membri della famiglia rilevanti. Le tecniche tradizionali per rilevare i livelli di caspasi nei tessuti includono western blotting e approcci enzimatici e fluorometrici 3,6. Tuttavia, nessuna di queste misure consente il rilevamento specifico delle cellule dei livelli di caspasi e, in alcuni scenari, le caspasi scisse spesso non possono essere rilevate dalle tradizionali misure di analisi delle proteine. È noto che le caspasi possono svolgere diversi ruoli apoptotici e non apoptotici nello stesso tessuto7, pertanto è necessaria un'attenta caratterizzazione dei livelli di caspasi cellulo-specifici per una comprensione accurata dei percorsi di sviluppo e malattia.
Questo studio mostra l'attivazione e la funzione delle caspasi in un modello di ipossia neurovascolare-ischemia - occlusione venosa retinica (RVO)7,8. In un tessuto complesso come la retina, ci sono più tipi di cellule che possono essere influenzate dall'ipossia-ischemia indotta nella RVO, comprese le cellule gliali, i neuroni e la vascolarizzazione7. Nella retina del topo adulto, c'è pochissima espressione di caspasi evidente nel tessuto sano, misurata dall'immunoistochimica (IHC)7, ma questo non è il caso durante lo sviluppo9 o nei modelli di malattia retinica10,11. L'IHC è una tecnica ben consolidata nella ricerca biomedica che ha permesso la validazione di bersagli patologici e patologici, l'identificazione di nuovi ruoli attraverso la localizzazione spaziale e la quantificazione delle proteine. Nei casi in cui i prodotti di caspasi scissa non possono essere rilevati mediante western blot o analisi fluorometrica, né la posizione cellulare specifica di caspasi distinte o l'interrogazione delle vie di segnalazione della caspasi attraverso la localizzazione, allora IHC dovrebbe essere utilizzato.
Al fine di determinare le caspasi funzionalmente rilevanti nella RVO, IHC è stato utilizzato con anticorpi convalidati per caspasi e marcatori cellulari. Gli studi precedenti condotti in laboratorio hanno dimostrato che la caspasi-9 è stata rapidamente attivata in un modello di ictus ischemico e inibizione della caspasi-9 con un inibitore altamente specifico protetto dalla disfunzione neuronale e dalla morte12. Poiché la retina fa parte del sistema nervoso centrale (SNC), funge da sistema modello per interrogare e studiare ulteriormente il ruolo della caspasi-9 nelle lesioni neurovascolari13. A tal fine, il modello murino di RVO è stato utilizzato per studiare la posizione e la distribuzione specifiche delle cellule della caspasi-9 e la sua implicazione nel danno neurovascolare. RVO è una causa comune di cecità negli adulti in età lavorativa che deriva da lesioni vascolari14. È stato scoperto che la caspasi-9 era espressa in modo non apoptotico nelle cellule endoteliali, ma non nei neuroni.
Come tessuto, la retina ha il vantaggio di essere visualizzata come un flatmount, che consente l'apprezzamento delle reti vascolari, o come sezioni trasversali, che evidenzia gli strati retinici neuronali. La quantificazione dell'espressione della proteina caspasi nelle sezioni trasversali fornisce il contesto per quanto riguarda quale caspasi è potenzialmente critica nella connettività neuronale retinica e nella funzione di visione identificando la localizzazione delle caspasi nella retina. Dopo l'identificazione e la convalida, il targeting della caspasi di interesse viene ottenuto utilizzando la delezione inducibile cellulo-specifica della caspasi identificata. Per potenziali indagini terapeutiche, la rilevanza delle caspasi di interesse è stata testata utilizzando strumenti specifici per inibire la caspasi attivata. Per la caspasi-9 una cellula comprendeva inibitore altamente selettivo 7,15, Pen1-XBIR3 è stato utilizzato. Per questo rapporto, sono stati utilizzati ceppi C57BL/6J maschili di 2 mesi e ceppo knockout endoteliale inducibile da tamoxifene-9 (iEC Casp9KO) con sfondo C57BL/6J. Questi animali sono stati esposti al modello murino di RVO e C57BL/6J sono stati trattati con l'inibitore selettivo della caspasi-9, Pen1-XBir3. La metodologia descritta può essere applicata ad altri modelli di malattia nei sistemi centrale e periferico 7,15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-Caspase-7 488</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB-56529AF488</td>
			<td>use at 1:150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cl-Caspase-9</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9505-S</td>
			<td>use at 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD31</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td>use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Spinning Disc Microscope</td>
			<td>Biovision</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI 2.3.0</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluormount G</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-187-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice</td>
			<td>lab generated</td>
			<td></td>
			<td>see Avrutsky 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin (594, 649)</td>
			<td>Vector</td>
			<td>DL-1207</td>
			<td>use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine Hydrochloride</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-0702-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump&#160;</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen1-XBir3</td>
			<td>lab generated</td>
			<td></td>
			<td>see Avrutsky 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9.1</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-a-View 4.0</td>
			<td>Visitron Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDCL 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of immunostained caspase-9 in retinal tissue

La famiglia delle caspasi è nota per mediare molti percorsi cellulari oltre la morte cellulare, tra cui la differenziazione cellulare, il pathfinding assonale e la proliferazione. Dall'identificazione della famiglia delle proteasi di morte cellulare, c'è stata una ricerca di strumenti per identificare ed espandere la funzione di specifici membri della famiglia negli stati di sviluppo, salute e malattia. Tuttavia, molti degli strumenti di caspasi attualmente disponibili in commercio che sono ampiamente utilizzati non sono specifici per la caspasi mirata. In questo rapporto, delineiamo l'approccio che abbiamo utilizzato per identificare, convalidare e indirizzare la caspasi-9 nel sistema nervoso utilizzando un nuovo inibitore e approcci genetici con letture immunoistochimiche. In particolare, abbiamo utilizzato il tessuto neuronale retinico come modello per identificare e convalidare la presenza e la funzione delle caspasi. Questo approccio consente l'interrogazione delle funzioni apoptotiche e non apoptotiche specifiche della caspasi-9 del tipo cellulare e può essere applicato ad altri tessuti complessi e caspasi di interesse. Comprendere le funzioni delle caspasi può aiutare ad ampliare le attuali conoscenze in biologia cellulare e può anche essere vantaggioso per identificare potenziali bersagli terapeutici a causa del loro coinvolgimento nella malattia.

Il protocollo descritto consente all'utente di analizzare e quantificare i livelli di caspasi-9 nel tessuto retinico. Inoltre, presenta strumenti per identificare ulteriormente, convalidare e indirizzare specificamente la caspasi-9 e i substrati a valle. I passaggi riassunti consentono un'analisi quantificabile dei livelli di caspasi e della specificità cellulare nelle fotomicrografie fluorescenti. Tutte le cifre mostrano fotomicrografie rappresentative e quantificazione dei livelli di caspasi indicati nella retina tota...

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Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue

Qui è presentato un protocollo immunoistochimico dettagliato per identificare, convalidare e indirizzare le caspasi funzionalmente rilevanti nei tessuti complessi.

Quantificazione della caspasi-9 immunocolorata nel tessuto retinico

The family of caspases is known to mediate many cellular pathways beyond cell death, including cell differentiation, axonal pathfinding, and ...

Questo protocollo fornisce un metodo immunoistochimico dettagliato per identificare, convalidare e indirizzare le caspasi funzionalmente rilevanti nei tessuti complessi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'interrogazione delle funzioni di caspasi-9 apoptotiche e non apoptotiche specifiche del tipo cellulare e può essere applicato ad altri tessuti complessi e caspasi di interesse. Comprendere le funzioni delle caspasi può aiutare ad ampliare le attuali conoscenze in biologia cellulare e può anche essere vantaggioso per identificare potenziali bersagli terapeutici a causa del loro coinvolgimento nella malattia.Inizia a quantificare i livelli di caspasi usando immagini al microscopio confocale di sezioni retiniche colorate. Per fare ciò, trascina i file immagine dei canali 405, 470, 555 e 640 sulla console delle Fiji. Fare clic sulle schede immagine, colore e unisci canali per assegnare colori ai file.Quindi comprimere lo stack Z facendo clic sullo stack di immagini e sul progetto Z. Selezionare il tipo di proiezione come intensità massima. Apri l'interfaccia del canale facendo clic sull'immagine seguita dallo strumento del canale di colore.Quindi, apri l'interfaccia di luminosità e contrasto. Per selezionare i parametri per canale, vai alla scheda del canale e scegli un canale. Posiziona il cursore sopra lo sfondo e annota il valore in pixel.Quindi posizionare il cursore sulla cella caspasi espressa e annotare il valore dei pixel. Per testare i parametri, vai all'interfaccia di luminosità e contrasto e fai clic su Seleziona. Inserire il valore minimo visualizzato o il valore in pixel della cella espressa dalla caspasi.Quindi collegare il valore massimo visualizzato o il valore in pixel di sfondo prima di fare clic su OK. Scegli le immagini casuali dal tessuto in cieco e ripeti la selezione dei parametri per canale per testare i parametri per tutti i canali. Una volta impostati i parametri, aprire i file di immagine e comprimere lo stack Z.Aggiungere i parametri di luminosità e contrasto per il canale caspasi e l'isolectina per il canale marcatore vascolare. Utilizzare lo strumento puntuale e quantificare il numero di aree vascolari positive utilizzando la colocalizzazione del marcatore vascolare con espressione di caspasi come lettura delle aree positive. Quindi, utilizzando i ganci come marcatore di aree neuronali positive, quantificare il numero di aree vascolari positive.Annotare i valori su un foglio di calcolo per immagine e calcolare la media dei valori per sezione. Calcola la media dei valori delle sezioni, che saranno la lettura per occhio. Il protocollo ha identificato la localizzazione cellulare delle caspasi e degli strati retinici neuronali in cui le caspasi sono espresse.La sezione trasversale retinica ha permesso la visualizzazione dei nuclei retinici nello strato gangliare retinico o RGL, strato internucleare o INL, e lo strato nucleare esterno o ONL quando colorato con ganci. Nella sezione trasversale, i vasi sanguigni retinici apparivano scollegati e separati fornendo gli strati plessiformi tra RGL e INL e tra INL e ONL. Le sezioni trasversali retiniche hanno anche identificato la caspasi-9 altamente regolata, un giorno dopo l'occlusione venosa retinica.L'inibizione della caspasi-9 è stata più efficace nel ridurre l'espressione della caspasi-7 neuronale nei topi knockout delle cellule endoteliali che hanno convalidato la rilevanza funzionale della caspasi-9 endoteliale. L'analisi rappresentativa ha mostrato che l'inibizione dell'attività della caspasi-9 bloccava farmacologicamente l'espressione della caspasi-7 dopo l'occlusione venosa retinica. Il successo della tecnica si basa su un'attenta preparazione dei tessuti, nonché sull'IHC e sull'imaging microscopico per garantire coerenza, validità e affidabilità dei dati.Questo metodo potrebbe essere combinato con l'analisi western blotting per il confronto semi-quantitativo della segnalazione delle caspasi. La tecnica ha fornito i passaggi per interrogare l'efficacia di un approccio terapeutico mirato alla caspasi-9 attiva nella RVO. Questo approccio può essere applicato anche ad altri tessuti, incluso il cervello.

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