Name: quantification of immunostained caspase-9 in retinal tissue
Uploaded: 2022-07-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) bidrag DGE - 1644869 och National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) från National Institutes of Health (NIH), prisnummer F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (till CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (till AMP), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 till CMT) och försvarsdepartementets armé/flygvapen (DURIP till CMT).

Detta protokoll följer Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalande för användning av djur i oftalmisk och synforskning. Gnagarförsök godkändes och övervakades av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Columbia University.
1. Beredning av näthinnevävnad och kryosektion
<ol><li>Avliva djuren genom administrering av intraperitoneal anestesi (ketamin (80-100 mg/kg) och xylazin (5-10 mg/kg)) och perfusa mössen som utsätts för...

<ol>
	<li>Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+in+cell+death,+inflammation,+and+disease.">Caspases in cell death, inflammation, and disease.</a> Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).</li><li>Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+caspase+mechanisms.">A primer on caspase mechanisms.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).</li><li>Troy, C. M., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases:+therapeutic+targets+in+neurologic+disease.">Caspases: therapeutic targets in neurologic disease.</a> Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).</li><li>Avrutsky, M. I., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9:+a+multimodal+therapeutic+target+with+diverse+cellular+expression+in+human+disease.">Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).</li><li>Fuchs, Y., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+in+animal+development+and+disease.">Programmed cell death in animal development and disease.</a> Cell. 147 (4), 742-758 (2011).</li><li>Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+caspases+in+the+nervous+system:+implications+for+functions+in+health+and+disease.">Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).</li><li>Avrutsky, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+activation+of+caspase-9+promotes+neurovascular+injury+in+retinal+vein+occlusion.">Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion.</a> Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).</li><li>Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+retinal+vein+occlusion+mouse+model+to+limit+variability.">Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).</li><li>Tisch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-8+modulates+physiological+and+pathological+angiogenesis+during+retina+development.">Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).</li><li>Chi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB1+promotes+the+activation+of+NLRP3+and+caspase-8+inflammasomes+via+NF-kappaB+pathway+in+acute+glaucoma.">HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).</li><li>Thomas, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-2+mediates+site-specific+retinal+ganglion+cell+death+after+blunt+ocular+injury.">Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).</li><li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon/neuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke.">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li><li>London, A., Benhar, I., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retina+as+a+window+to+the+brain-from+eye+research+to+CNS+disorders.">The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).</li><li>Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epidemiology+of+retinal+vein+occlusion:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+prevalence,+incidence,+and+risk+factors.">Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors.</a> Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).</li><li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon/neuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke.">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).</li><li>Kuida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+apoptosis+and+cytochrome+c-mediated+caspase+activation+in+mice+lacking+caspase+9.">Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9.</a> Cell. 94 (3), 325-337 (1998).</li><li>Troy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+in+the+balance:+alternative+participation+of+the+caspase-2+and+-9+pathways+in+neuronal+death+induced+by+nerve+growth+factor+deprivation.">Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).</li></ol>

Kaspaser är en flerledad familj av proteaser som bäst studeras för sina roller i celldöd och inflammation; på senare tid har dock en mängd olika icke-dödsfunktioner avslöjats för vissa familjemedlemmar 4,5. Mycket av vår förståelse av caspasfunktionen härrör från arbete i cellodling och från inferentiella data från mänsklig sjukdom. Även om det uppskattas att det finns avvikande induktion, aktivering eller inaktivering av kaspaser vid sjukdom, ...

Caspaserna är en familj av proteaser som reglerar utvecklingscelldöd, immunsvar och avvikande celldöd vid sjukdom 1,2. Även om det är välkänt att medlemmar av caspase-familjen induceras i en mängd olika neurodegenerativa sjukdomar, är det mer utmanande att förstå vilken kaspase som driver sjukdomspatologi3. Sådana studier kräver verktyg för att identifiera, karakterisera och validera funktionen hos enskilda caspase-familjemedlemmar. Att analysera de relevanta individuella kaspaserna är viktigt både ur mekanistisk och terapeutisk synvinkel, eftersom litteraturen har flera studier som ger bevis på de olika rollerna hos caspaser 4,5. Således, om målet är att rikta in sig på en kaspas i en sjukdom för en terapeutisk fördel, är det viktigt att ha specifik inriktning på den relevanta familjemedlemmen / medlemmarna. Traditionella tekniker för att detektera caspasnivåer i vävnad inkluderar western blotting och enzymatiska och fluorometriska metoder 3,6. Ingen av dessa åtgärder möjliggör dock cellspecifik detektion av kaspasnivåer, och i vissa scenarier kan klyvda kaspaser ofta inte detekteras med traditionella proteinanalysåtgärder. Det är känt att kaspaser kan spela olika apoptotiska och icke-apoptotiska roller i samma vävnad7, därför behövs noggrann karakterisering av cellspecifika caspasnivåer för korrekt förståelse av utvecklings- och sjukdomsvägar.
Denna studie visar kaspasaktivering och funktion i en modell av neurovaskulär hypoxi-ischemi - retinal venocklusion (RVO)7,8. I en komplex vävnad som näthinnan finns det flera celltyper som kan påverkas av hypoxi-ischemi inducerad i RVO, inklusive gliaceller, neuroner och vaskulatur7. I den vuxna musens näthinna finns det mycket lite uttryck av caspaser som är uppenbara i frisk vävnad, mätt med immunhistokemi (IHC)7, men så är inte fallet under utveckling9 eller i modeller av näthinnesjukdom10,11. IHC är en teknik som är väl etablerad inom biomedicinsk forskning och har möjliggjort validering av sjukdomar och patologiska mål, identifiering av nya roller genom rumslig lokalisering och kvantifiering av proteiner. I de fall där klyvda caspasprodukter inte kan detekteras genom western blot- eller fluorometrisk analys, inte heller den specifika cellplaceringen av distinkta caspaser eller förhör av caspase-signalvägar genom lokalisering, bör IHC användas.
För att bestämma caspase(s) funktionellt relevant i RVO användes IHC med validerade antikroppar för caspaser och cellulära markörer. De tidigare studierna som utförts i labbet visade att caspase-9 snabbt aktiverades i en modell av ischemisk stroke och hämning av caspase-9 med en mycket specifik hämmare skyddad från neuronal dysfunktion och död12. Eftersom näthinnan är en del av centrala nervsystemet (CNS) fungerar det som ett modellsystem för att fråga och ytterligare undersöka rollen av caspase-9 vid neurovaskulära skador13. För detta ändamål användes musmodellen av RVO för att studera den cellspecifika platsen och fördelningen av caspase-9 och dess implikation i neurovaskulär skada. RVO är en vanlig orsak till blindhet hos vuxna i arbetsför ålder som beror på kärlskada14. Det visade sig att caspase-9 uttrycktes på ett icke-apoptotiskt sätt i endotelceller, men inte i neuroner.
Som vävnad har näthinnan fördelen att den visualiseras som antingen en flatmount, vilket möjliggör uppskattning av kärlnätverken, eller som tvärsnitt, vilket belyser de neuronala retinala skikten. Kvantifiering av caspaseproteinuttryck i tvärsnitt ger sammanhang, angående vilket kaspase som är potentiellt kritiskt i retinal neuronal anslutning och synfunktion genom att identifiera lokaliseringen av caspase (er) i näthinnan. Efter identifiering och validering uppnås inriktning på den kaspas av intresse med hjälp av inducerbar cellspecifik radering av det identifierade caspaset. För potentiella terapeutiska undersökningar testades relevansen av de kaspaser av intresse med hjälp av specifika verktyg för att hämma det aktiverade caspaset. För caspase-9 användes en cell permeant mycket selektiv hämmare 7,15, Pen1-XBIR3. För denna rapport användes 2 månader gammal, manlig C57BL / 6J-stam och tamoxifeninducerbar endotelkaspas-9 knockout (iEC Casp9KO) stam med en C57BL / 6J-bakgrund. Dessa djur exponerades för musmodellen av RVO och C57BL/6J behandlades med den selektiva caspase-9-hämmaren Pen1-XBir3. Den beskrivna metoden kan tillämpas på andra sjukdomsmodeller i centrala och perifera system 7,15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-Caspase-7 488</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB-56529AF488</td>
			<td>use at 1:150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cl-Caspase-9</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9505-S</td>
			<td>use at 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD31</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td>use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Spinning Disc Microscope</td>
			<td>Biovision</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI 2.3.0</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluormount G</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-187-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice</td>
			<td>lab generated</td>
			<td></td>
			<td>see Avrutsky 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin (594, 649)</td>
			<td>Vector</td>
			<td>DL-1207</td>
			<td>use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine Hydrochloride</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-0702-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump&#160;</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen1-XBir3</td>
			<td>lab generated</td>
			<td></td>
			<td>see Avrutsky 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9.1</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-a-View 4.0</td>
			<td>Visitron Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDCL 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of immunostained caspase-9 in retinal tissue

Familjen av kaspaser är känd för att förmedla många cellulära vägar bortom celldöd, inklusive celldifferentiering, axonal pathfinding och proliferation. Sedan identifieringen av familjen celldödsproteaser har det sökts efter verktyg för att identifiera och utöka funktionen hos specifika familjemedlemmar i utvecklings-, hälso- och sjukdomstillstånd. Många av de för närvarande kommersiellt tillgängliga caspaseverktygen som används i stor utsträckning är dock inte specifika för den riktade caspasen. I denna rapport avgränsar vi det tillvägagångssätt vi har använt för att identifiera, validera och rikta in oss på caspase-9 i nervsystemet med hjälp av en ny hämmare och genetiska metoder med immunohistokemiska avläsningar. Specifikt använde vi retinal neuronal vävnad som en modell för att identifiera och validera närvaron och funktionen av caspaser. Detta tillvägagångssätt möjliggör förhör av celltypspecifika apoptotiska och icke-apoptotiska caspase-9-funktioner och kan tillämpas på andra komplexa vävnader och caspaser av intresse. Att förstå kaspasernas funktioner kan bidra till att utöka nuvarande kunskap inom cellbiologi, och kan också vara fördelaktigt för att identifiera potentiella terapeutiska mål på grund av deras engagemang i sjukdom.

Det beskrivna protokollet tillåter användaren att analysera och kvantifiera caspase-9-nivåer i retinalvävnaden. Dessutom presenterar den verktyg för att ytterligare identifiera, validera och specifikt rikta in sig på caspase-9 och nedströms substrat. De sammanfattade stegen möjliggör kvantifierbar analys av caspasnivåer och cellulär specificitet i fluorescerande fotomikrografer. Alla figurer visar representativa fotomikrografer och kvantifiering av de angivna caspasnivåerna i den totala näthinnan, endotelcel...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue at JoVE.com

Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue

Här presenteras ett detaljerat immunhistokemiprotokoll för att identifiera, validera och rikta in sig på funktionellt relevanta caspaser i komplexa vävnader.

Kvantifiering av immunstained Caspase-9 i retinal vävnad

The family of caspases is known to mediate many cellular pathways beyond cell death, including cell differentiation, axonal pathfinding, and ...

Detta protokoll tillhandahåller en detaljerad immunohistokemisk metod för att identifiera, validera och rikta in sig på funktionellt relevanta kaspaser i komplexa vävnader. Den största fördelen med denna teknik är att det möjliggör förhör av celltypsspecifika apoptotiska och icke-apoptotiska caspase-9-funktioner och kan tillämpas på andra komplexa vävnader och caspaser av intresse. Att förstå funktionerna hos kaspaser kan bidra till att utöka nuvarande kunskap inom cellbiologi och kan också vara fördelaktigt för att identifiera potentiella terapeutiska mål på grund av deras engagemang i sjukdom.Börja kvantifiera kaspasnivåerna med hjälp av konfokalmikroskopibilder av färgade näthinnesektioner. Det gör du genom att dra bildfilerna med 405, 470, 555 och 640 kanaler till Fijis konsol. Klicka på flikarna bild, färg och slå samman kanaler för att tilldela färger till filerna.Komprimera sedan Z-stacken genom att klicka på bildstacken och Z-projektet. Välj projektionstyp som maximal intensitet. Öppna kanalens gränssnitt genom att klicka på bilden följt av färgkanalens verktyg.Öppna sedan gränssnittet för ljusstyrka och kontrast. För att välja parametrar per kanal, gå till kanalens flik och välj en kanal. Placera markören ovanpå bakgrunden och kommentera pixelvärdet.Placera sedan markören på den caspase-uttryckta cellen och kommentera pixelvärdet. För att testa parametrarna, gå till gränssnittet för ljusstyrka och kontrast och klicka på välj. Anslut det lägsta visade värdet eller den caspase uttryckta cellens pixelvärde.Anslut sedan det maximala visningsvärdet eller bakgrundspixelvärdet innan du klickar på okej. Välj slumpmässiga bilder från blindad vävnad och upprepa valet av parametrar per kanal för att testa parametrarna för alla kanaler. När parametrarna är inställda öppnar du bildfilerna och komprimerar Z-stacken.Lägg till parametrarna ljusstyrka och kontrast för caspasekanalen och isolektinet för den vaskulära markörkanalen. Använd punktverktyget och kvantifiera antalet positiva kärlområden med hjälp av samlokalisering av kärlmarkören med caspasuttryck som avläsning av positiva områden. Använd sedan krokar som markör för positiva neuronala områden, kvantifiera antalet positiva vaskulära områden.Kommentera värdena i ett kalkylblad per bild och beräkna medelvärdet av värdena per avsnitt. Medelvärde för sektionsvärdena, vilket kommer att vara avläsningen per öga. Protokollet identifierade den cellulära lokaliseringen av caspaserna och de neuronala retinala skikten i vilka caspaserna uttrycks.Retinaltvärsnittet möjliggjorde visualisering av retinala kärnor i retinal ganglionskiktet eller RGL, Internuclear layer eller INL, och det yttre kärnskiktet eller ONL när det färgades med krokar. I tvärsnittet uppträdde retinala blodkärl frånkopplade och separerade tillförsel av plexiformskikten mellan RGL och INL och mellan INL och ONL. Retinala tvärsnitt identifierade också den starkt reglerade caspase-9, en dag efter retinal venocklusion.Caspase-9-hämningen var effektivare för att minska neuronalt caspase-7-uttryck i endotelcells-knockoutmöss som validerade den funktionella relevansen av endotelkaspas-9. Den representativa analysen visade att hämningen av caspase-9-aktivitet farmakologiskt blockerade caspase-7-uttrycket efter retinal venocklusion. Teknikens framgång är beroende av noggrann vävnadsberedning samt IHC och mikroskopisk avbildning för att säkerställa konsistens, validitet och tillförlitlighet hos data.Denna metod skulle kunna kombineras med western blotting-analys för semikvantitativ jämförelse av caspasesignalering. Tekniken gav stegen för att undersöka effekten av ett terapeutiskt tillvägagångssätt riktat mot aktiv caspase-9 i RVO. Detta tillvägagångssätt kan också tillämpas på andra vävnader, inklusive hjärnan.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfektion av Mouse retinal ganglion celler genom att In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morfometriska Analyser av näthinnans avsnitt

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automatiserad Kvantifiering av synaptisk Fluorescens i<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissektion, kultur, och analys av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonala näthinnevävnad

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Kvantifiering av fintrådiga aktin (F-aktin) puncta i Rat kortikala Neuroner

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kvantifiering av endosom och lysosommotiliteter i odlade neuroner med användning av fluorescerande probar

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Purification of H3 and H4 Histone Proteins and the Quantification of Acetylated Histone Marks in Cells and Brain Tissue

Rening av H3 och H4 Histon proteiner och kvantifiering av acetylerade Histon märken i celler och hjärnvävnad

In all eukaryotic organisms, chromatin, the physiological template of all genetic information, is essential for heredity. Chromatin is subject to an array ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Beredning av Mouse retinal Cryo-sektioner för immunhistokemi

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Subretinal transplantation av mänsklig embryonal stamcellsderiverad näthinnevävnad i en kattmodell för stora djur

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

En hydrofobisk vävnadsrensningsmetod för råtta hjärnvävnad

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...