Name: quantification of immunostained caspase-9 in retinal tissue
Uploaded: 2022-07-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı (NSF-GRFP) hibe DGE - 1644869 ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS), ödül numarası F99NS124180 NIH NINDS Çeşitlilik İhtisas F99 (CKCO'ya), Ulusal Göz Enstitüsü (NEI) 5T32EY013933 (AMP'ye), Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (RO1 NS081333, R03 NS099920'den CMT'ye) ve Savunma Bakanlığı Ordu/Hava Kuvvetleri (DURIP'ten CMT'ye).

Bu protokol, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) oftalmik ve görme araştırmalarında hayvanların kullanımı için yaptığı açıklamayı takip eder. Kemirgen deneyleri, Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve izlenmiştir.
1. Retina dokusunun hazırlanması ve kriyoseksiyon
<ol><li>İntraperitoneal anestezi (ketamin (80-100 mg / kg) ve ksilazin (5-10 mg / kg)) uygulayarak hayvan...

<ol>
	<li>Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+in+cell+death,+inflammation,+and+disease.">Caspases in cell death, inflammation, and disease.</a> Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).</li><li>Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+caspase+mechanisms.">A primer on caspase mechanisms.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).</li><li>Troy, C. M., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases:+therapeutic+targets+in+neurologic+disease.">Caspases: therapeutic targets in neurologic disease.</a> Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).</li><li>Avrutsky, M. I., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9:+a+multimodal+therapeutic+target+with+diverse+cellular+expression+in+human+disease.">Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).</li><li>Fuchs, Y., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+in+animal+development+and+disease.">Programmed cell death in animal development and disease.</a> Cell. 147 (4), 742-758 (2011).</li><li>Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+caspases+in+the+nervous+system:+implications+for+functions+in+health+and+disease.">Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).</li><li>Avrutsky, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+activation+of+caspase-9+promotes+neurovascular+injury+in+retinal+vein+occlusion.">Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion.</a> Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).</li><li>Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+retinal+vein+occlusion+mouse+model+to+limit+variability.">Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).</li><li>Tisch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-8+modulates+physiological+and+pathological+angiogenesis+during+retina+development.">Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).</li><li>Chi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB1+promotes+the+activation+of+NLRP3+and+caspase-8+inflammasomes+via+NF-kappaB+pathway+in+acute+glaucoma.">HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).</li><li>Thomas, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-2+mediates+site-specific+retinal+ganglion+cell+death+after+blunt+ocular+injury.">Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).</li><li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon/neuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke.">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li><li>London, A., Benhar, I., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retina+as+a+window+to+the+brain-from+eye+research+to+CNS+disorders.">The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).</li><li>Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epidemiology+of+retinal+vein+occlusion:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+prevalence,+incidence,+and+risk+factors.">Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors.</a> Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).</li><li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon/neuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke.">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).</li><li>Kuida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+apoptosis+and+cytochrome+c-mediated+caspase+activation+in+mice+lacking+caspase+9.">Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9.</a> Cell. 94 (3), 325-337 (1998).</li><li>Troy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+in+the+balance:+alternative+participation+of+the+caspase-2+and+-9+pathways+in+neuronal+death+induced+by+nerve+growth+factor+deprivation.">Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).</li></ol>

Kaspazlar, hücre ölümü ve inflamasyondaki rolleri için en iyi şekilde çalışılan çok üyeli bir proteaz ailesidir; Bununla birlikte, daha yakın zamanlarda, bazı aile üyeleri için çeşitli ölüm dışı işlevler ortaya çıkarılmıştır 4,5. Kaspaz fonksiyonu hakkındaki anlayışımızın çoğu, hücre kültüründeki çalışmalardan ve insan hastalığından elde edilen çıkarımsal verilerden kaynaklanmaktadır. Hastalıkta kaspazların an...

Kaspazlar, hastalık 1,2'de gelişimsel hücre ölümünü, immün yanıtları ve anormal hücre ölümünü düzenleyen bir proteaz ailesidir. Kaspaz ailesinin üyelerinin çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda indüklendiği iyi bilinmekle birlikte, hangi kaspazın hastalık patolojisini yönlendirdiğini anlamak daha zordur3. Bu tür çalışmalar, bireysel kaspaz ailesi üyelerinin işlevini tanımlamak, karakterize etmek ve doğrulamak için araçlar gerektirir. İlgili bireysel kaspazların ayrıştırılması hem mekanik hem de terapötik açıdan önemlidir, çünkü literatürde kaspazların farklı rollerine dair kanıtlar sağlayan çok sayıda çalışma vardır 4,5. Bu nedenle, amaç terapötik bir fayda için bir hastalıkta bir kaspazı hedeflemekse, ilgili aile üyelerinin spesifik olarak hedeflenmesi kritik öneme sahiptir. Dokudaki kaspaz düzeylerini saptamak için kullanılan geleneksel teknikler arasında batı lekelenmesi ve enzimatik ve florometrik yaklaşımlaryer almaktadır 3,6. Bununla birlikte, bu önlemlerin hiçbiri kaspaz seviyelerinin hücreye özgü tespitine izin vermez ve bazı senaryolarda, parçalanmış kaspazlar genellikle geleneksel protein analizi önlemleri ile tespit edilemez. Kaspazların aynı dokuda farklı apoptotik ve apoptotik olmayan roller oynayabileceği bilinmektedir7, bu nedenle gelişimsel ve hastalık yolaklarının doğru anlaşılması için hücreye özgü kaspaz düzeylerinin dikkatli bir şekilde karakterize edilmesi gerekmektedir.
Bu çalışmada nörovasküler hipoksi-iskemi - retinal ven tıkanıklığı (RVO)7,8 modelinde kaspaz aktivasyonu ve fonksiyonu gösterilmiştir. Retina gibi karmaşık bir dokuda, glial hücreler, nöronlar ve vaskülatür7 dahil olmak üzere RVO'da indüklenen hipoksi-iskemiden etkilenebilecek birden fazla hücre tipi vardır. Yetişkin fare retinasında, immünohistokimya (IHC)7 ile ölçüldüğü gibi, sağlıklı dokuda belirgin olan çok az kaspaz ekspresyonu vardır, ancak gelişim9 sırasında veya retina hastalığı10,11 modellerinde durum böyle değildir. IHC, biyomedikal araştırmalarda iyi kurulmuş ve hastalık ve patolojik hedeflerin doğrulanmasına, mekansal lokalizasyon yoluyla yeni rollerin tanımlanmasına ve proteinlerin nicelleştirilmesine izin veren bir tekniktir. Parçalanmış kaspaz ürünlerinin batı lekesi veya florometrik analiz ile tespit edilemediği durumlarda, farklı kaspazların spesifik hücre lokalizasyonu veya lokalizasyon yoluyla kaspaz sinyal yollarının sorgulanması durumunda, IHC kullanılmalıdır.
RVO'da fonksiyonel olarak ilişkili kaspaz (lar) ı belirlemek için, IHC, kaspazlar ve hücresel belirteçler için doğrulanmış antikorlarla birlikte kullanıldı. Laboratuvarda yapılan önceki çalışmalar, kaspaz-9'un bir iskemik inme modelinde ve nöronal disfonksiyon ve ölümden korunan oldukça spesifik bir inhibitör ile kaspaz-9'un inhibisyonunda hızla aktive olduğunu göstermiştir12. Retina, merkezi sinir sisteminin (CNS) bir parçası olduğundan, nörovasküler yaralanmalarda kaspaz-9'un rolünü sorgulamak ve daha fazla araştırmak için bir model sistem olarak hizmet eder13. Bu amaçla, RVO'nun fare modeli, kaspaz-9'un hücreye özgü yerini ve dağılımını ve nörovasküler hasardaki etkisini incelemek için kullanıldı. RVO, çalışan yaşlı erişkinlerde vasküler yaralanmadan kaynaklanan körlüğün yaygın bir nedenidir14. Kaspaz-9'un endotel hücrelerinde apoptotik olmayan bir şekilde eksprese edildiği, ancak nöronlarda eksprese edilmediği bulundu.
Bir doku olarak, retina, vasküler ağların takdir edilmesini sağlayan düz bir montaj veya nöronal retinal tabakaları vurgulayan kesitler olarak görselleştirilme avantajına sahiptir. Enine kesitlerde kaspaz proteini ekspresyonunun nicelleştirilmesi, retinadaki kaspaz (lar) ın lokalizasyonunu tanımlayarak retinal nöronal bağlantı ve görme fonksiyonunda hangi kaspazın potansiyel olarak kritik olduğu konusunda bağlam sağlar. Tanımlama ve validasyondan sonra, tanımlanan kaspazın indüklenebilir hücreye özgü delesyonu kullanılarak ilgilenilen kaspazın hedeflenmesi sağlanır. Potansiyel terapötik sorular için, aktif kaspazı inhibe etmek için özel araçlar kullanılarak ilgilenilen kaspazların alaka düzeyi test edildi. Kaspaz-9 için yüksek seçici inhibitör 7,15 pervane edilen bir hücre, Pen1-XBIR3 kullanıldı. Bu yazıda 2 aylık erkek C57BL/6J suşu ve C57BL/6J arka planlı tamoksifen kaynaklı endotelyal kaspaz-9 nakavt (iEC Casp9KO) suşu kullanıldı. Bu hayvanlar RVO'nun fare modeline maruz bırakıldı ve C57BL / 6J, kaspaz-9 seçici inhibitörü Pen1-XBir3 ile tedavi edildi. Tanımlanan metodoloji, merkezi ve periferik sistemlerdeki diğer hastalık modellerine uygulanabilir 7,15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-Caspase-7 488</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB-56529AF488</td>
			<td>use at 1:150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cl-Caspase-9</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9505-S</td>
			<td>use at 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD31</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td>use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Spinning Disc Microscope</td>
			<td>Biovision</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI 2.3.0</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluormount G</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-187-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice</td>
			<td>lab generated</td>
			<td></td>
			<td>see Avrutsky 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin (594, 649)</td>
			<td>Vector</td>
			<td>DL-1207</td>
			<td>use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine Hydrochloride</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-0702-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump&#160;</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen1-XBir3</td>
			<td>lab generated</td>
			<td></td>
			<td>see Avrutsky 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9.1</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-a-View 4.0</td>
			<td>Visitron Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDCL 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of immunostained caspase-9 in retinal tissue

Kaspaz ailesinin, hücre farklılaşması, aksonal yol bulma ve proliferasyon dahil olmak üzere hücre ölümünün ötesinde birçok hücresel yola aracılık ettiği bilinmektedir. Hücre ölümü proteazları ailesinin tanımlanmasından bu yana, gelişim, sağlık ve hastalık durumlarında belirli aile üyelerinin işlevini tanımlamak ve genişletmek için araçlar araştırılmıştır. Bununla birlikte, şu anda yaygın olarak kullanılan ticari olarak temin edilebilen kaspaz araçlarının çoğu, hedeflenen kaspaz için spesifik değildir. Bu yazıda, sinir sistemindeki kaspaz-9'u tanımlamak, doğrulamak ve hedeflemek için kullandığımız yaklaşımı, immünohistokimyasal okumalarla yeni bir inhibitör ve genetik yaklaşımlar kullanarak tanımladık. Spesifik olarak, retinal nöronal dokuyu kaspazların varlığını ve işlevini tanımlamak ve doğrulamak için bir model olarak kullandık. Bu yaklaşım, hücre tipine özgü apoptotik ve apoptotik olmayan kaspaz-9 fonksiyonlarının sorgulanmasını sağlar ve ilgilenilen diğer karmaşık dokulara ve kaspazlara uygulanabilir. Kaspazların fonksiyonlarını anlamak, hücre biyolojisindeki mevcut bilgilerin genişletilmesine yardımcı olabilir ve ayrıca hastalığa katılımları nedeniyle potansiyel terapötik hedefleri tanımlamak için avantajlı olabilir.

Tanımlanan protokol, kullanıcının retina dokusundaki kaspaz-9 seviyelerini analiz etmesini ve ölçmesini sağlar. Ek olarak, kaspaz-9 ve aşağı akış substratlarını daha fazla tanımlamak, doğrulamak ve özellikle hedeflemek için araçlar sunar. Özetlenen adımlar, floresan fotomikrograflarda kaspaz seviyelerinin ve hücresel özgüllüğün ölçülebilir analizini sağlar. Tüm rakamlar, yaralanmamış ve 1 günlük P-RVO retina kesitlerinde toplam retina, endotel hücreleri ve nöronlarda belirtilen kaspa...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue at JoVE.com

Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue

Burada, kompleks dokulardaki fonksiyonel olarak ilgili kaspazları tanımlamak, doğrulamak ve hedeflemek için ayrıntılı bir immünohistokimya protokolü sunulmaktadır.

Retina Dokusunda İmmün Boyalı Kaspaz-9'un Miktarının Belirlenmesi

The family of caspases is known to mediate many cellular pathways beyond cell death, including cell differentiation, axonal pathfinding, and ...

Bu protokol, kompleks dokulardaki fonksiyonel olarak ilgili kaspazları tanımlamak, doğrulamak ve hedeflemek için ayrıntılı bir immünohistokimyasal yöntem sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, hücre tipine özgü apoptotik ve apoptotik olmayan kaspaz-9 fonksiyonlarının sorgulanmasını sağlaması ve ilgilenilen diğer kompleks dokulara ve kaspazlara uygulanabilmesidir. Kaspazların fonksiyonlarını anlamak, hücre biyolojisindeki mevcut bilgilerin genişletilmesine yardımcı olabilir ve ayrıca hastalığa katılımları nedeniyle potansiyel terapötik hedefleri belirlemek için avantajlı olabilir.Lekeli retina kesitlerinin konfokal mikroskopi görüntülerini kullanarak kaspaz seviyelerini ölçmeye başlayın. Bunu yapmak için 405, 470, 555 ve 640 kanallarının görüntü dosyalarını Fiji'nin konsoluna sürükleyin. Dosyalara renk atamak için resim, renk ve kanalları birleştir sekmelerini tıklatın.Ardından, görüntü yığınını ve Z projesini tıklatarak Z yığınını sıkıştırın. Projeksiyon türünü maksimum yoğunluk olarak seçin. Resmin ardından renk kanalının aracını tıklayarak kanalın arayüzünü açın.Ardından, parlaklık ve kontrast arayüzünü açın. Kanal başına parametreleri seçmek için kanalın sekmesine gidin ve bir kanal seçin. İmleci arka planın üzerine getirin ve piksel değerine açıklama ekleyin.Ardından imleci kaspaz ifade edilen hücrenin üzerine getirin ve piksel değerine açıklama ekleyin. Parametreleri test etmek için parlaklık ve karşıtlık arabirimine gidin ve seç'i tıklatın. Görüntülenen minimum değeri veya kaspaz ifade edilen hücrenin piksel değerini takın.Ardından, Tamam'ı tıklamadan önce görüntülenen maksimum değeri veya arka plan pikseli değerini takın. Kör dokudan rastgele görüntüleri seçin ve tüm kanalların parametrelerini test etmek için kanal başına parametre seçimini tekrarlayın. Parametreler ayarlandıktan sonra, görüntü dosyalarını açın ve Z yığınını sıkıştırın.Kaspaz kanalı için parlaklık ve kontrast parametrelerini ve vasküler belirteç kanalı için izolektini ekleyin. Nokta aracını kullanın ve pozitif alanların okunması olarak vasküler belirtecin kaspaz ekspresyonu ile kolokalizasyonunu kullanarak pozitif vasküler alanların sayısını sayın. Daha sonra kancaları pozitif nöronal alanların belirteci olarak kullanarak, pozitif vasküler alanların sayısını ölçün.Resim başına e-tablodaki değerlere açıklama ekleyin ve değerlerin ortalamasını bölüme göre alın. Bölüm değerlerinin ortalaması, göz başına okuma olacaktır. Protokol, kaspazların hücresel lokalizasyonunu ve kaspazların eksprese edildiği nöronal retinal tabakaları tanımladı.Retinal kesit, retinal ganglion tabakasında veya RGL, Internuclear tabakasında veya INL'de retina çekirdeklerinin ve kancalarla boyandığında dış nükleer tabakanın veya ONL'nin görüntülenmesine izin verdi. Enine kesitte, retinal kan damarlarının bağlantısı kesilmiş ve RGL ile INL arasındaki ve INL ile ONL arasındaki pleksiform tabakaları besleyen ayrı görünüyordu. Retinal kesitler ayrıca retinal ven tıkanıklığından bir gün sonra yüksek oranda düzenlenmiş kaspaz-9'u da tanımladı.Kaspaz-9 inhibisyonu, endotel hücreli nakavt farelerde nöronal kaspaz-7 ekspresyonunu azaltmada daha etkiliydi ve bu da endotel kaspaz-9'un fonksiyonel uygunluğunu doğruladı. Temsili analiz, kaspaz-9 aktivitesinin inhibisyonunun, retinal ven tıkanıklığı sonrası kaspaz-7 ekspresyonunu farmakolojik olarak bloke ettiğini göstermiştir. Tekniğin başarısı, verilerin tutarlılığını, geçerliliğini ve güvenilirliğini sağlamak için dikkatli doku hazırlığının yanı sıra IHC ve mikroskobik görüntülemeye dayanmaktadır.Bu yöntem, kaspaz sinyallemesinin yarı kantitatif karşılaştırması için batı blotlama analizi ile birleştirilebilir. Teknik, RVO'da aktif kaspaz-9'u hedef alan terapötik bir yaklaşımın etkinliğini sorgulamak için adımlar sağlamıştır. Bu yaklaşım beyin de dahil olmak üzere diğer dokulara da uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Retina Bölüm morfometrik Analizleri

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Diseksiyon, Kültür ve Analizi<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyonik Retina Doku

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Purification of H3 and H4 Histone Proteins and the Quantification of Acetylated Histone Marks in Cells and Brain Tissue

Arıtma H3 ve H4 histon proteinleri ve Acetylated histon işaretleri hücrelerinde ve beyin dokusu miktar

In all eukaryotic organisms, chromatin, the physiological template of all genetic information, is essential for heredity. Chromatin is subject to an array ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Bir Kedi Büyük Hayvan Modelinde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Retinal Dokunun Subretinal Transplantasyonu

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...