Name: determining the thermodynamic and kinetic association of a dna aptamer and tetracycline using isothermal titration calorimetry
Uploaded: 2022-08-23T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af forsknings- og udviklingsfinansieringen fra Aptagen LLC.

BEMÆRK: Figur 2 viser de vigtigste trin i ITC-eksperimentet til bestemmelse af den termodynamiske og kinetiske association af en DNA-aptamer og tetracyclin.
1. Forberedelse af prøver
BEMÆRK: Prøver til ITC skal fremstilles i samme buffer for både aptamer og ligand for at undgå varmefrigivelse forårsaget af blanding af forskellige buffere fra prøvecellen og sprøjten. Dette opnås typisk gennem dialyse af alle mate...

<ol>
	<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptasensors+for+environmental+monitoring+of+contaminants+in+water+and+soil.">Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil.</a> Current Opinion in Environmental Science &amp; Health. 10, 9-21 (2019).</li><li>Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aptamer+discovery+and+technology.">Analysis of aptamer discovery and technology.</a> Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).</li><li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SELEX--A+(r)evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands.">SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).</li><li>Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+kinetics+by+isothermal+titration+calorimetry:+Allostery,+inhibition,+and+dynamics.">Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).</li><li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands.">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).</li><li>Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+aptamers+specific+for+antibiotics+tetracyclines.">Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).</li><li>Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+aptasensor+for+tetracycline+detection.">Electrochemical aptasensor for tetracycline detection.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+indirect+competitive+assay-based+aptasensor+for+highly+sensitive+detection+of+tetracycline+residue+in+honey.">Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+colorimetric+aptasensor+using+gold+nanoparticle+for+a+highly+sensitive+and+specific+detection+of+oxytetracycline.">A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).</li><li>Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+photosensitisation+processes+by+an+RNA+aptamer.">Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer.</a> Scientific Reports. 7, 43272 (2017).</li><li>Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+and+thermodynamics+of+2',5'+RNA+intercalation.">Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).</li><li>Sigurskjold, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exact+analysis+of+competition+ligand+binding+by+displacement+isothermal+titration+calorimetry.">Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).</li><li>Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt-mediated+two-site+ligand+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.">Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).</li><li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+value+of+c:+Can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry.">On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).</li><li>Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+reactions+for+the+amplification+of+oligonucleotides.">Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).</li></ol>

Metoden, der præsenteres her, blev ændret i henhold til instruktion fra TA Instruments og er tilstrækkelig til at bestemme bindingsaffiniteten og termodynamikken for mange udvalgte aptamerer og mål i vores center. Afgørende trin fra denne procedure inkluderer udveksling af bufferen for at have et mål, der matcher liganden, kører prøver med korrekte parametre og finder den passende bindingstilpasningsmodel til at analysere dataene. Kontinuerlig registrering af varmefrigivelse kræver, at al støjvarme elimineres, ...

Aptamere er ssDNA- eller RNA-fragmenter udvalgt gennem en evolutionsproces med høj bindingsaffinitet og specificitet til de ønskede mål 1,2, som kan fungere som avancerede genkendelseselementer eller kemiske antistoffer 3,4,5. Således spiller aptamers bindingsaffinitet og specificitet til deres mål en afgørende rolle i udvælgelsen og anvendelsen af en aptamer, og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) er blevet anvendt i vid udstrækning til disse karakteriseringsformål. Mange tilgange er blevet brugt til at bestemme affiniteten af aptamerer, herunder ITC, overfladeplasmonresonans (SPR), kolorimetrisk titrering, mikroskala termoforese (MST) og Bio-Layer Interferometri (BLI). Blandt dem er ITC en af de nyeste teknikker til bestemmelse af den termodynamiske og kinetiske forening af to molekyler i opløsningsfasen. Denne fremgangsmåde udfører kontinuerlig titrering ved hjælp af etiketfrie molekyler og registrerer frigivet varme over tid ved bindingshændelserne produceret af hver titrering 6,7. I modsætning til andre metoder kan ITC tilbyde bindingsaffinitet, flere bindingssteder og termodynamisk og kinetisk association (figur 1A). Fra disse indledende parametre bestemmes Gibbs frie energiændringer og entropiændringer ved hjælp af følgende forhold:
ΔG = ΔH-TΔS
Det betyder, at ITC tilbyder en komplet termodynamisk profil af den molekylære interaktion for at belyse bindingsmekanismerne (figur 1B). Det er vanskeligt at bestemme bindingsaffiniteten for små molekyler med en aptamer på grund af de drastisk forskellige størrelser mellem aptamer og mål. I mellemtiden kan ITC levere følsom måling uden mærkning og immobilisering af molekyler, hvilket giver et middel til at bevare den naturlige struktur af aptameren og målet under måling. Med de nævnte attributter kan ITC bruges som standardmetode til karakterisering af binding mellem en aptamer og små mål.
Efter udvælgelse af Gu-gruppen blev denne aptamer integreret med forskellige platforme, herunder elektrokemiske aptamerbaserede biosensorer, et konkurrencedygtigt enzymbundet aptamerassay og en mikrotiterplade, som kan opnå detektion af tetracyclin 8,9,10 med høj kapacitet. Dens bindende egenskaber er imidlertid ikke blevet belyst godt nok til at vælge den rigtige platform8; det er værd at karakterisere bindingen af aptameren til tetracyclin ved hjælp af ITC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG 
			C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG 
			TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc</td>
			<td></td>
			<td>The sequence is adopted from Gu&#39;s research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity ITC Auto Low Volume (190 &#181;L) System Complete&#8211;Gold Cells</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>61000.901</td>
			<td>Isothermal titration calorimetry system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Avantor (VWR)</td>
			<td>E506-100ML</td>
			<td>Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Degassing Station (110/230V)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6326</td>
			<td>This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>TekNova</td>
			<td>E0375</td>
			<td>EDTA 500 mM, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices</td>
			<td>Pall Laboratory</td>
			<td>OD030C34</td>
			<td>3 kDa molecular weight cutoff concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70165</td>
			<td>Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 &#181;m filter. Autoclaved at 121 &#176;C for greater than 20 min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>labForce (a Thomas Scientific Brand)</td>
			<td>1149K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline, Hydrochoride</td>
			<td>EMD Millipore Corperation</td>
			<td>CAS64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the thermodynamic and kinetic association of a dna aptamer and tetracycline using isothermal titration calorimetry

Bestemmelsen af bindende affinitet og adfærd mellem en aptamer og dens mål er det mest afgørende trin i valg og brug af en aptamer til anvendelse. På grund af de drastiske forskelle mellem aptameren og små molekyler skal forskere lægge stor vægt på at karakterisere deres bindingsegenskaber. Isotermisk titreringskalorimetri (ITC) er en kraftfuld tilgang til dette formål. ITC går ud over bestemmelse af disassociationskonstanter (Kd) og kan tilvejebringe entalpiændringer og bindende støkiometri af interaktionen mellem to molekyler i opløsningsfasen. Denne tilgang udfører kontinuerlig titrering ved hjælp af etiketfrie molekyler og registrerer frigivet varme over tid ved bindingshændelserne produceret af hver titrering, så processen følsomt kan måle bindingen mellem makromolekyler og deres små mål. Heri introducerer artiklen en trin-for-trin procedure for ITC-måling af en udvalgt aptamer med et lille mål, tetracyclin. Dette eksempel beviser teknikkens alsidighed og dens potentiale til andre applikationer.

ITC tilvejebringer en nøjagtig disassociationskonstant (Kd), bindingsstøkiometrien og de termodynamiske parametre for tomolekyleinteraktioner6. I dette eksempel binder aptameren valgt af Kim et al.9,11 til tetracyclin med bindingsaffiniteter på K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Interessant nok blev denne binding bestemt ved hjælp af ligevægtsfiltreringsmetoden og en rapporteret K...

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry at JoVE.com

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

Den nuværende protokol beskriver brugen af isotermisk titreringskalorimetri (ITC) til at analysere sammenhængen og dissociationskinetikken af bindingen mellem en DNA-aptamer og tetracyclin, herunder prøveforberedelse, løbende standarder og prøver og fortolkning af de resulterende data.

Bestemmelse af den termodynamiske og kinetiske forening af en DNA-aptamer og tetracyclin ved hjælp af isotermisk titreringskalorimetri

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Denne protokol giver forskere mulighed for at bestemme aptamers bindingsaffiniteter mod mål, der er fri i opløsning, samtidig med at de giver indsigt i bindingsmekanismen. Fordi ITC måler ændringer i varme på grund af binding, behøver hverken aptamer eller ligand at blive mærket eller funktionaliseret, som det ville være tilfældet for teknikker som SPR. Nye brugere skal være meget opmærksomme på at matche buffere på tværs af alle bindende komponenter.Derudover skal du være opmærksom på, at teknikken har høje prøvekrav, der kan være vanskelige at opfylde for større ligander såsom proteiner. Til at begynde med aktiveres membranen i dialysekolonnen, fyldes med PBS-buffer, ækvilibreres i 10 minutter ved stuetemperatur og centrifugeres ved 5.000 gange G i 15 minutter. Fjern bufferen og læg 500 mikroliter aptamerprøver i kolonnen.Centrifuge ved 5.000 gange G og gentag den fire gange for at udveksle den oprindelige buffer til PBS. Saml den dialyserede DNA-aptamer ved hjælp af en pipette, og overfør den til det nye 1,5 milliliter rør. Saml den sidste gennemstrømningsbuffer for at opløse tetracyclin.Sørg for, at bufferen til eksperimentet i sprøjten svarer til bufferen i referencecellen. Aptamerkoncentrationen bestemmes igen ved hjælp af et UV-synligt spektrometer. Brug den sidste udvekslingsbuffer til at justere koncentrationen til 40-mikromolær tetracyclin og to-mikromolær aptamer.Fold DNA-aptameren ved at opvarme ved 90 grader Celsius i 10 minutter, afkøle ved fire grader Celsius i 10 minutter og derefter vende tilbage til stuetemperatur i 20 minutter. Afgas den foldede aptamer og dialyserede tetracyklin ved hjælp af en afgasningsstation eller vakuumpumpe i 25 minutter for at eliminere opløste gasser. Efter oprydning og bekræftelse af maskinens renlighed skal du teste maskinens nøjagtighed med et standardsæt, der inkluderer EDTA og calciumchlorid ved hjælp af standardprogrammet og efter instruktionerne fra producenten.Konfigurer de kørende parametre. Kontroller de nødvendige mængder ved hjælp af en kørende programberegner. Med denne løbende parameter udføres ITC-måling med 230 mikroliter 40-mikromolær tetracyclin i ITC-sprøjten og 485 mikroliter to-mikromolær aptamer i ITC-prøvecellen ved hjælp af ITC.Læg de dialyserede tetracyklinsprøjteplader og den foldede aptamer i prøvecellen, undgå bobler ved hjælp af en pipette. Begynd at køre ITC-instrumentet ved at klikke på Start-knappen på softwaren. Åbn dataanalysesoftwaren ved at dobbeltklikke for at begynde at analysere dataene.Åbn stien til de gemte rådata for at kende tendensen til binding. Åbn fanen Modellering, og brug forskellige bindingsmodeller til at finde den bedste pasform til datakurven. Derefter beregner softwaren automatisk ITC-termogrammet og forskellige termodynamiske parametre, herunder entalpi, entropi, fri energi, ligevægtsbindingskonstant og støkiometri.Indsaml de termodynamiske parametre, der bestemmes ud fra dataene og tilpasningsmodeloplysningerne. Opret en rapport med billeder af ITC-termogrammet og forskellige termodynamiske parametre. Aptameren valgt af Kim, et al binder til tetracyclin med bindende affiniteter af disassociation konstant en lig med 13 mikromolar og disassociation konstant to er lig med 53 nanomolar.Tilpasningsmodellen og støkiometrien fra ITC afspejler, at aptameren binder til tetracyklin gennem et 2: 1 bindingsforhold med den sekventielle bindingsmodel. De termodynamiske parametre bestemt ved ITC-måling for sted to indikerede, at entalpi, der overvinder relativt signifikant entropisk tab, driver den stærke binding. Den entalpidrevne binding med entropitab vedrører nukleinsyrekonformationelle ændringer, som er blevet rapporteret som bindingsadfærd mellem RNA og et lille molekyle.Aptamer og ligand skal være i samme buffer. Aptameren skal foldes igen, hvis den udvikles med refolding, og prøver skal afgasses. Ved at tage fat på disse overvejelser sikres det, at kun aptamer-ligand-interaktioner bidrager til det målte signal.På grund af størrelsen af aptamermålet kan en passende opfølgningsmetode være mikroskala termoforese for at bekræfte den målte bindingsaffinitetsfri i opløsning.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Kortlægning af bindingssted en aptamer på ATP Brug mikroskala Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differentialscanningskalometri - en metode til vurdering den termiske stabilitet og Kropsbygning af protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Multiplex isotermisk forstærkning baseret diagnostiske Platform til at opdage Zika, Chikungunya og Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Bestemmelse, hvis DNA farves med en Cyanine farvestof kan fordøjes med restriktionsenzymer

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrering ELISA som en metode til at bestemme dissociationskonstant Receptor Ligand interaktion

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlæsning og DNA reparation analyse ved hjælp af Single Nucleotide udvidelse og MALDI-TOF-massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein oprensning og kinetisk analyse via ilt elektrode til at studere DesB Dioxygenase aktivitet og hæmning

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...