Name: determining the thermodynamic and kinetic association of a dna aptamer and tetracycline using isothermal titration calorimetry
Uploaded: 2022-08-23T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door de Research and Development Funding van Aptagen LLC.

OPMERKING: Figuur 2 toont de belangrijkste stappen van het ITC-experiment voor het bepalen van de thermodynamische en kinetische associatie van een DNA-aptamer en tetracycline.
1. Bereiding van monsters
OPMERKING: Monsters voor ITC moeten in dezelfde buffer worden bereid voor zowel het aptamer als het ligand om warmteafgifte te voorkomen die wordt veroorzaakt door het mengen van verschillende buffers uit de monstercel en ...

<ol>
	<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptasensors+for+environmental+monitoring+of+contaminants+in+water+and+soil.">Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil.</a> Current Opinion in Environmental Science &amp; Health. 10, 9-21 (2019).</li><li>Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aptamer+discovery+and+technology.">Analysis of aptamer discovery and technology.</a> Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).</li><li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SELEX--A+(r)evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands.">SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).</li><li>Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+kinetics+by+isothermal+titration+calorimetry:+Allostery,+inhibition,+and+dynamics.">Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).</li><li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands.">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).</li><li>Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+aptamers+specific+for+antibiotics+tetracyclines.">Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).</li><li>Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+aptasensor+for+tetracycline+detection.">Electrochemical aptasensor for tetracycline detection.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+indirect+competitive+assay-based+aptasensor+for+highly+sensitive+detection+of+tetracycline+residue+in+honey.">Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+colorimetric+aptasensor+using+gold+nanoparticle+for+a+highly+sensitive+and+specific+detection+of+oxytetracycline.">A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).</li><li>Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+photosensitisation+processes+by+an+RNA+aptamer.">Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer.</a> Scientific Reports. 7, 43272 (2017).</li><li>Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+and+thermodynamics+of+2',5'+RNA+intercalation.">Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).</li><li>Sigurskjold, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exact+analysis+of+competition+ligand+binding+by+displacement+isothermal+titration+calorimetry.">Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).</li><li>Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt-mediated+two-site+ligand+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.">Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).</li><li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+value+of+c:+Can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry.">On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).</li><li>Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+reactions+for+the+amplification+of+oligonucleotides.">Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).</li></ol>

De hier gepresenteerde methode is aangepast volgens de instructies van TA Instruments en is voldoende om de bindingsaffiniteit en thermodynamica van veel geselecteerde aptameren en doelen in ons centrum te bepalen. Cruciale stappen uit deze procedure zijn onder meer het uitwisselen van de buffer om een doel te hebben dat overeenkomt met het ligand, het uitvoeren van monsters met de juiste parameters en het vinden van het juiste bindingsmodel om de gegevens te analyseren. Continue registratie van warmteafgifte vereist het...

Aptameren zijn ssDNA- of RNA-fragmenten geselecteerd via een evolutieproces met een hoge bindingsaffiniteit en specificiteit voor de gewenste doelen 1,2, die kunnen werken als geavanceerde herkenningselementen of chemische antilichamen 3,4,5. De bindingsaffiniteit en specificiteit van aptameren aan hun doelen spelen dus een cruciale rol bij de selectie en toepassing van een aptamer, en isotherme titratiecalorimetrie (ITC) is op grote schaal gebruikt voor deze karakteriseringsdoeleinden. Veel benaderingen zijn gebruikt om de affiniteit van aptameren te bepalen, waaronder ITC, oppervlakteplasmonresonantie (SPR), colorimetrische titratie, thermoforese op microschaal (MST) en Bio-Layer Interferometry (BLI). Onder hen is ITC een van de nieuwste technieken om de thermodynamische en kinetische associatie van twee moleculen in de oplossingsfase te bepalen. Deze benadering voert continue titratie uit met behulp van labelvrije moleculen en registreert de vrijgekomen warmte in de loop van de tijd bij de bindingsgebeurtenissen die door elke titratie worden geproduceerd 6,7. In tegenstelling tot andere methoden kan ITC bindingsaffiniteit, verschillende bindingsplaatsen en thermodynamische en kinetische associatie bieden (figuur 1A). Op basis van deze initiële parameters worden de Gibbs vrije energieveranderingen en entropieveranderingen bepaald met behulp van de volgende relatie:
ΔG = ΔH-TΔS
Dat betekent dat ITC een compleet thermodynamisch profiel van de moleculaire interactie biedt om de bindingsmechanismen op te helderen (figuur 1B). Het bepalen van de bindingsaffiniteit voor kleine moleculen met een aptamer is moeilijk vanwege de drastisch verschillende groottes tussen aptamer en target. Ondertussen kan ITC gevoelige metingen uitvoeren zonder moleculen te labelen en te immobiliseren, wat een middel biedt om de natuurlijke structuur van het aptamer en het doel tijdens de meting te behouden. Met de genoemde attributen kan ITC worden gebruikt als de standaardmethode voor de karakterisering van binding tussen een aptamer en kleine doelen.
Na selectie door de Gu-groep werd deze aptamer geïntegreerd met verschillende platforms, waaronder elektrochemische op aptamer gebaseerde biosensoren, een competitieve enzymgebonden aptamer-assay en een microtiterplaat, die detectie met hoge doorvoer van tetracycline 8,9,10 kan bereiken. De bindingseigenschappen zijn echter niet goed genoeg opgehelderd om het juiste platform te kiezen8; het is de moeite waard om de binding van het aptamer aan het tetracycline te karakteriseren met behulp van ITC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG 
			C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG 
			TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc</td>
			<td></td>
			<td>The sequence is adopted from Gu&#39;s research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity ITC Auto Low Volume (190 &#181;L) System Complete&#8211;Gold Cells</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>61000.901</td>
			<td>Isothermal titration calorimetry system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Avantor (VWR)</td>
			<td>E506-100ML</td>
			<td>Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Degassing Station (110/230V)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6326</td>
			<td>This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>TekNova</td>
			<td>E0375</td>
			<td>EDTA 500 mM, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices</td>
			<td>Pall Laboratory</td>
			<td>OD030C34</td>
			<td>3 kDa molecular weight cutoff concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70165</td>
			<td>Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 &#181;m filter. Autoclaved at 121 &#176;C for greater than 20 min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>labForce (a Thomas Scientific Brand)</td>
			<td>1149K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline, Hydrochoride</td>
			<td>EMD Millipore Corperation</td>
			<td>CAS64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the thermodynamic and kinetic association of a dna aptamer and tetracycline using isothermal titration calorimetry

De bepaling van bindingsaffiniteit en gedrag tussen een aptamer en zijn doel is de meest cruciale stap bij het selecteren en gebruiken van een aptamer voor toepassing. Vanwege de drastische verschillen tussen het aptamer en kleine moleculen, moeten wetenschappers veel moeite doen om hun bindende eigenschappen te karakteriseren. Isothermische titratiecalorimetrie (ITC) is hiervoor een krachtige aanpak. ITC gaat verder dan het bepalen van disassociatieconstanten (Kd) en kan de enthalpieveranderingen en bindende stoichiometrie van de interactie tussen twee moleculen in de oplossingsfase leveren. Deze benadering voert continue titratie uit met behulp van labelvrije moleculen en registreert de vrijgekomen warmte in de loop van de tijd bij de bindingsgebeurtenissen die door elke titratie worden geproduceerd, zodat het proces de binding tussen macromoleculen en hun kleine doelen gevoelig kan meten. Hierin introduceert het artikel een stapsgewijze procedure van de ITC-meting van een geselecteerde aptamer met een klein doelwit, tetracycline. Dit voorbeeld bewijst de veelzijdigheid van de techniek en het potentieel ervan voor andere toepassingen.

ITC biedt een nauwkeurige disassociatieconstante (Kd), de bindingsstoichiometrie en de thermodynamische parameters van interacties met twee moleculen6. In dit voorbeeld bindt de aptamer geselecteerd door Kim et al.9,11 aan tetracycline met bindingsaffiniteiten van Kd 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Interessant is dat deze binding werd bepaald met behulp van de evenwichtsfiltratiemethode...

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry at JoVE.com

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

Het huidige protocol beschrijft het gebruik van isotherme titratiecalorimetrie (ITC) om de associatie en dissociatiekinetiek van de binding tussen een DNA-aptamer en tetracycline te analyseren, inclusief monstervoorbereiding, lopende normen en monsters, en het interpreteren van de resulterende gegevens.

Het bepalen van de thermodynamische en kinetische associatie van een DNA-aptamer en tetracycline met behulp van isothermische titratiecalorimetrie

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de bindingsaffiniteiten van aptameren te bepalen tegen doelen die vrij zijn in oplossing, terwijl ze inzicht geven in het mechanisme van binding. Omdat ITC veranderingen in warmte als gevolg van binding meet, hoeft aptamer noch ligand te worden gelabeld of gefunctionaliseerd, zoals het geval zou zijn voor technieken zoals SPR. Nieuwe gebruikers moeten goed letten op het matchen van buffers voor alle bindingscomponenten.Houd er bovendien rekening mee dat de techniek hoge monstervereisten heeft waaraan moeilijk te voldoen kan zijn voor grotere liganden zoals eiwitten. Activeer om te beginnen het membraan van de dialysekolom, vul met PBS-buffer, balanceer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer op 5.000 keer G gedurende 15 minuten. Verwijder de buffer en laad 500 microliter aptamermonsters in de kolom.Centrifugeer op 5.000 keer G en herhaal dit vier keer om de oorspronkelijke buffer te vervangen door PBS. Verzamel de gedialyseerde DNA-aptamer met behulp van een pipet en breng deze over naar de nieuwe buis van 1,5 milliliter. Verzamel de laatste doorstroombuffer om tetracycline op te lossen.Zorg ervoor dat de buffer voor het experiment in de spuit overeenkomt met de buffer in de referentiecel. Bepaal de aptamerconcentratie opnieuw met behulp van een UV-zichtbare spectrometer. Gebruik de laatste uitwisselingsbuffer om de concentratie aan te passen aan 40-micromolair tetracycline en twee-micromolaire aptamer.Vouw de DNA-aptamer door gedurende 10 minuten op 90 graden Celsius te verwarmen, gedurende 10 minuten op vier graden Celsius af te koelen en vervolgens gedurende 20 minuten terug te keren naar kamertemperatuur. Ontgas het gevouwen aptamer en het gedialyseerde tetracycline met behulp van een ontgassingsstation of vacuümpomp gedurende 25 minuten om opgeloste gassen te elimineren. Na het opruimen en bevestigen van de reinheid van de machine, test u de nauwkeurigheid van de machine met een standaardkit met EDTA en calciumchloride met behulp van het standaardprogramma en volgens de instructies van de fabrikant.Stel de actieve parameters in. Controleer de vereiste volumes met behulp van een actieve programmacalculator. Voer met deze lopende parameter ITC-metingen uit met 230 microliter 40-micromolair tetracycline in de ITC-spuit en 485 microliter aptamer van twee micromolaire in de ITC-monstercel met behulp van de ITC.Laad de gedialyseerde tetracycline spuitplaten en het gevouwen aptamer in de monstercel en vermijd bubbels met behulp van een pipet. Begin met het uitvoeren van het ITC-instrument door op de knop Start in de software te klikken. Open de data-analysesoftware door te dubbelklikken om te beginnen met het analyseren van de gegevens.Open het pad van de opgeslagen onbewerkte gegevens om de neiging tot binding te kennen. Open het tabblad Modellering en gebruik verschillende bindingsmodellen om de beste pasvorm voor de gegevenscurve te vinden. Vervolgens berekent de software automatisch het ITC-thermogram en verschillende thermodynamische parameters, waaronder enthalpie, entropie, vrije energie, evenwichtsbindingsconstante en stoichiometrie.Verzamel de thermodynamische parameters die worden bepaald op basis van de gegevens en de informatie over het montagemodel. Maak een rapport met foto's van het ITC thermogram en verschillende thermodynamische parameters. De aptamer geselecteerd door Kim, et al bindt aan tetracycline met bindingsaffiniteiten van disassociatieconstante één is gelijk aan 13 micromolair en disassociatieconstante twee is gelijk aan 53 nanomolair.Het aanpassingsmodel en de stoichiometrie van ITC weerspiegelen dat het aptamer bindt aan tetracycline door een bindingsverhouding van 2:1 met het sequentiële bindingsmodel. De thermodynamische parameters bepaald door ITC-meting voor plaats twee gaven aan dat enthalpie die relatief significant entropisch verlies overwint, de sterke binding aandrijft. De enthalpie-gedreven binding met entropieverlies heeft betrekking op nucleïnezuur conformatieveranderingen, die zijn gerapporteerd als bindingsgedrag tussen RNA en een klein molecuul.Het aptamer en ligand moeten zich in dezelfde buffer bevinden. Het aptamer moet opnieuw worden gevouwen als het wordt ontwikkeld met hervouwen en monsters moeten worden ontgast. Het aanpakken van deze overwegingen zal ervoor zorgen dat alleen aptamer-ligand interacties bijdragen aan het gemeten signaal.Vanwege de grootte van het aptamerdoel zou een geschikte follow-upmethode thermoforese op microschaal kunnen zijn om de gemeten bindingsaffiniteit vrij in oplossing te bevestigen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differentiecalorimetrie - Een methode voor het beoordelen van de thermische stabiliteit en conformatie van eiwitantigeen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Bepalen als DNA gekleurd met een Cyanine kleurstof kan worden verteerd met enzymen van de beperking

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titratie ELISA als een methode om te bepalen van de dissociatieconstante van Receptor-Ligand interactie

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaërobe EiwitReiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van de activiteit van de DesB Dioxygenase en inhibitie

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...