Name: determining the thermodynamic and kinetic association of a dna aptamer and tetracycline using isothermal titration calorimetry
Uploaded: 2022-08-23T13:45:00
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Diese Forschung wurde durch die Forschungs- und Entwicklungsfinanzierung von Aptagen LLC unterstützt.

HINWEIS: Abbildung 2 zeigt die Hauptschritte des ITC-Experiments zur Bestimmung der thermodynamischen und kinetischen Assoziation eines DNA-Aptamers und Tetracyclins.
1. Vorbereitung der Proben
HINWEIS: Proben für ITC müssen im selben Puffer für Aptamer und Ligand vorbereitet werden, um eine Wärmefreisetzung durch das Mischen verschiedener Puffer aus der Probenzelle und der Spritze zu vermeiden. Dies wird typischerwei...

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	<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptasensors+for+environmental+monitoring+of+contaminants+in+water+and+soil.">Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil.</a> Current Opinion in Environmental Science &amp; Health. 10, 9-21 (2019).</li><li>Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aptamer+discovery+and+technology.">Analysis of aptamer discovery and technology.</a> Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).</li><li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SELEX--A+(r)evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands.">SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).</li><li>Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+kinetics+by+isothermal+titration+calorimetry:+Allostery,+inhibition,+and+dynamics.">Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).</li><li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands.">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).</li><li>Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+aptamers+specific+for+antibiotics+tetracyclines.">Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).</li><li>Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+aptasensor+for+tetracycline+detection.">Electrochemical aptasensor for tetracycline detection.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+indirect+competitive+assay-based+aptasensor+for+highly+sensitive+detection+of+tetracycline+residue+in+honey.">Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+colorimetric+aptasensor+using+gold+nanoparticle+for+a+highly+sensitive+and+specific+detection+of+oxytetracycline.">A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).</li><li>Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+photosensitisation+processes+by+an+RNA+aptamer.">Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer.</a> Scientific Reports. 7, 43272 (2017).</li><li>Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+and+thermodynamics+of+2',5'+RNA+intercalation.">Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).</li><li>Sigurskjold, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exact+analysis+of+competition+ligand+binding+by+displacement+isothermal+titration+calorimetry.">Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).</li><li>Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt-mediated+two-site+ligand+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.">Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).</li><li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+value+of+c:+Can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry.">On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).</li><li>Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+reactions+for+the+amplification+of+oligonucleotides.">Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).</li></ol>

Die hier vorgestellte Methode wurde gemäß den Anweisungen von TA Instruments modifiziert und reicht aus, um die Bindungsaffinität und Thermodynamik vieler ausgewählter Aptamere und Targets in unserem Zentrum zu bestimmen. Zu den entscheidenden Schritten dieses Verfahrens gehören der Austausch des Puffers, um ein Ziel zu haben, das dem Liganden entspricht, das Ausführen von Proben mit geeigneten Parametern und das Finden des geeigneten Bindungsanpassungsmodells zur Analyse der Daten. Die kontinuierliche Aufzeichnung...

Aptamere sind ssDNA- oder RNA-Fragmente, die durch einen Evolutionsprozess mit hoher Bindungsaffinität und Spezifität zu den gewünschten Zielen 1,2 selektiert werden, die als fortgeschrittene Erkennungselemente oder chemische Antikörper 3,4,5 wirken können. Daher spielen die Bindungsaffinität und Spezifität von Aptameren an ihre Ziele eine entscheidende Rolle bei der Auswahl und Anwendung eines Aptamers, und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) wurde für diese Charakterisierungszwecke häufig verwendet. Viele Ansätze wurden verwendet, um die Affinität von Aptameren zu bestimmen, einschließlich ITC, Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), kolorimetrische Titration, mikroskalige Thermophorese (MST) und Bio-Schichtinterferometrie (BLI). Unter ihnen ist ITC eine der neuesten Techniken, um die thermodynamische und kinetische Assoziation von zwei Molekülen in der Lösungsphase zu bestimmen. Dieser Ansatz führt eine kontinuierliche Titration unter Verwendung markierungsfreier Moleküle durch und zeichnet die im Laufe der Zeit freigesetzte Wärme bei den bei jeder Titration erzeugten Bindungsereignissen auf 6,7. Im Gegensatz zu anderen Methoden kann ITC Bindungsaffinität, mehrere Bindungsstellen sowie thermodynamische und kinetische Assoziationen bieten (Abbildung 1A). Aus diesen Anfangsparametern werden die Gibbs-Änderungen der freien Energie und die Entropieänderungen unter Verwendung der folgenden Beziehung bestimmt:
ΔG = ΔH-TΔS
Das bedeutet, dass ITC ein vollständiges thermodynamisches Profil der molekularen Wechselwirkung bietet, um die Bindungsmechanismen aufzuklären (Abbildung 1B). Die Bestimmung der Bindungsaffinität für kleine Moleküle mit einem Aptamer ist aufgrund der drastisch unterschiedlichen Größen zwischen Aptamer und Target schwierig. In der Zwischenzeit kann ITC empfindliche Messungen ohne Markierung und Immobilisierung von Molekülen durchführen, was ein Mittel bietet, die natürliche Struktur des Aptamers und des Ziels während der Messung beizubehalten. Mit den genannten Attributen kann ITC als Standardmethode zur Charakterisierung der Bindung zwischen einem Aptamer und kleinen Targets verwendet werden.
Nach der Auswahl durch die Gu-Gruppe wurde dieses Aptamer in verschiedene Plattformen integriert, darunter elektrochemische Aptamer-basierte Biosensoren, ein kompetitiver enzymgebundener Aptamer-Assay und eine Mikrotiterplatte, die einen Hochdurchsatznachweis von Tetracyclin 8,9,10 erreichen kann. Seine Bindungseigenschaften sind jedoch nicht gut genug aufgeklärt, um die richtige Plattform8 zu wählen; Es lohnt sich, die Bindung des Aptamers an das Tetracyclin mittels ITC zu charakterisieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG 
			C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG 
			TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc</td>
			<td></td>
			<td>The sequence is adopted from Gu&#39;s research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity ITC Auto Low Volume (190 &#181;L) System Complete&#8211;Gold Cells</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>61000.901</td>
			<td>Isothermal titration calorimetry system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Avantor (VWR)</td>
			<td>E506-100ML</td>
			<td>Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Degassing Station (110/230V)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6326</td>
			<td>This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>TekNova</td>
			<td>E0375</td>
			<td>EDTA 500 mM, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices</td>
			<td>Pall Laboratory</td>
			<td>OD030C34</td>
			<td>3 kDa molecular weight cutoff concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70165</td>
			<td>Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 &#181;m filter. Autoclaved at 121 &#176;C for greater than 20 min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>labForce (a Thomas Scientific Brand)</td>
			<td>1149K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline, Hydrochoride</td>
			<td>EMD Millipore Corperation</td>
			<td>CAS64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the thermodynamic and kinetic association of a dna aptamer and tetracycline using isothermal titration calorimetry

Die Bestimmung der Bindungsaffinität und des Bindungsverhaltens zwischen einem Aptamer und seinem Ziel ist der wichtigste Schritt bei der Auswahl und Verwendung eines Aptamers für die Anwendung. Aufgrund der drastischen Unterschiede zwischen dem Aptamer und kleinen Molekülen müssen Wissenschaftler viel Aufwand betreiben, um ihre Bindungseigenschaften zu charakterisieren. Die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist ein leistungsfähiger Ansatz für diesen Zweck. ITC geht über die Bestimmung von Dissoziationskonstanten (Kd) hinaus und kann die Enthalpieänderungen und die Bindungsstöchiometrie der Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen in der Lösungsphase liefern. Dieser Ansatz führt eine kontinuierliche Titration mit markierungsfreien Molekülen durch und zeichnet die im Laufe der Zeit freigesetzte Wärme bei den Bindungsereignissen auf, die bei jeder Titration erzeugt werden, so dass der Prozess die Bindung zwischen Makromolekülen und ihren kleinen Zielen empfindlich messen kann. Hier stellt der Artikel ein schrittweises Verfahren der ITC-Messung eines ausgewählten Aptamers mit einem kleinen Ziel, Tetracyclin, vor. Dieses Beispiel beweist die Vielseitigkeit der Technik und ihr Potenzial für andere Anwendungen.

ITC liefert eine genaue Dissoziationskonstante (Kd), die Bindungsstöchiometrie und die thermodynamischen Parameter von Zwei-Molekül-Wechselwirkungen6. In diesem Beispiel bindet das von Kim et al.9,11 ausgewählte Aptamer an Tetracyclin mit Bindungsaffinitäten von K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Interessanterweise wurde diese Bindung mit der Gleichgewichtsfiltrationsmethode und ei...

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Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) zur Analyse der Assoziation und Dissoziationskinetik der Bindung zwischen einem DNA-Aptamer und Tetracyclin, einschließlich Probenvorbereitung, Ausführung von Standards und Proben und Interpretation der resultierenden Daten.

Bestimmung der thermodynamischen und kinetischen Assoziation eines DNA-Aptamers und Tetracyclins mittels isothermer Titrationskalorimetrie

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die Bindungsaffinitäten von Aptameren gegen lösungsfreie Ziele zu bestimmen und gleichzeitig Einblicke in den Bindungsmechanismus zu geben. Da ITC Wärmeänderungen aufgrund von Bindung misst, müssen weder Aptamer noch Ligand markiert oder funktionalisiert werden, wie dies bei Techniken wie SPR der Fall wäre. Neue Benutzer sollten genau darauf achten, Puffer über alle Bindungskomponenten hinweg abzugleichen.Beachten Sie außerdem, dass die Technik hohe Probenanforderungen hat, die für größere Liganden wie Proteine schwer zu erfüllen sein können. Um zu beginnen, aktivieren Sie die Membran der Dialysensäule, füllen Sie mit PBS-Puffer, baquilibrieren Sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie bei 5.000 mal G für 15 Minuten. Entfernen Sie den Puffer und laden Sie 500 Mikroliter Aptamerproben in die Säule.Zentrifugieren Sie bei 5.000 mal G und wiederholen Sie es viermal, um den ursprünglichen Puffer gegen PBS auszutauschen. Sammeln Sie das dialysierte DNA-Aptamer mit einer Pipette und überführen Sie es in das neue 1,5-Milliliter-Röhrchen. Sammeln Sie den letzten Durchflusspuffer, um Tetracyclin aufzulösen.Stellen Sie sicher, dass der Puffer für den Experiment in der Spritze mit dem Puffer in der Referenzzelle übereinstimmt. Bestimmen Sie die Aptamerkonzentration erneut mit einem UV-sichtbaren Spektrometer. Verwenden Sie den letzten Austauschpuffer, um die Konzentration auf 40-Mikromol-Tetracyclin und zweimikromolares Aptamer einzustellen.Falten Sie das DNA-Aptamer, indem Sie es 10 Minuten lang bei 90 Grad Celsius erhitzen, 10 Minuten bei vier Grad Celsius abkühlen und dann für 20 Minuten auf Raumtemperatur zurückkehren. Entgasen Sie das gefaltete Aptamer und dialysierte Tetracyclin mit einer Entgasungsstation oder Vakuumpumpe für 25 Minuten, um gelöste Gase zu entfernen. Nachdem Sie die Sauberkeit der Maschine gereinigt und bestätigt haben, testen Sie die Genauigkeit der Maschine mit einem Standardkit, das EDTA und Calciumchlorid enthält, mit dem Standardprogramm und gemäß den Anweisungen des Herstellers.Richten Sie die Ausführungsparameter ein. Überprüfen Sie die benötigten Volumes mit einem laufenden Programmrechner. Mit diesem Laufparameter führen Sie eine ITC-Messung mit 230 Mikrolitern 40-Mikromol-Tetracyclin in der ITC-Spritze und 485 Mikrolitern zweimikromolaren Aptamer in der ITC-Probenzelle unter Verwendung der ITC durch.Laden Sie die dialysierten Tetracyclin-Spritzenplatten und das gefaltete Aptamer mit einer Pipette unter Vermeidung von Blasen in die Probenzelle. Starten Sie den Betrieb des ITC-Instruments, indem Sie in der Software auf die Schaltfläche Start klicken. Öffnen Sie die Datenanalysesoftware durch Doppelklick, um mit der Analyse der Daten zu beginnen.Öffnen Sie den Pfad der gespeicherten Rohdaten, um die Tendenz der Bindung zu erfahren. Öffnen Sie die Registerkarte Modellierung, und verwenden Sie verschiedene Bindungsmodelle, um die beste Anpassung für die Datenkurve zu finden. Dann berechnet die Software automatisch das ITC-Thermogramm und verschiedene thermodynamische Parameter, einschließlich Enthalpie, Entropie, freie Energie, Gleichgewichtsbindungskonstante und Stöchiometrie.Sammeln Sie die thermodynamischen Parameter, die aus den Daten und Anpassungsmodellinformationen ermittelt werden. Erstellen Sie einen Bericht mit Bildern des ITC-Thermogramms und verschiedener thermodynamischer Parameter. Das von Kim et al. ausgewählte Aptamer bindet an Tetracyclin mit Bindungsaffinitäten der Dissoziationskonstante eins entspricht 13 Mikromolar und Dissoziationskonstante zwei entspricht 53 Nanomolaren.Das Anpassungsmodell und die Stöchiometrie von ITC zeigen, dass das Aptamer über ein Bindungsverhältnis von 2:1 an Tetracyclin mit dem sequentiellen Bindungsmodell bindet. Die thermodynamischen Parameter, die durch ITC-Messungen für Standort zwei bestimmt wurden, zeigten, dass die Enthalpie, die relativ signifikante entropische Verluste überwindet, die starke Bindung antreibt. Die enthalpiegetriebene Bindung mit Entropieverlust bezieht sich auf Nukleinsäurekonformationsänderungen, die als Bindungsverhalten zwischen RNA und einem kleinen Molekül berichtet wurden.Aptamer und Ligand müssen sich im selben Puffer befinden. Das Aptamer sollte wieder gefaltet werden, wenn es mit Refolding entwickelt wurde, und die Proben müssen entgast werden. Durch die Berücksichtigung dieser Überlegungen wird sichergestellt, dass nur Aptamer-Ligand-Wechselwirkungen zum gemessenen Signal beitragen.Aufgrund der Größe des Aptamer-Targets könnte eine geeignete Folgemethode die mikroskalige Thermophorese sein, um die gemessene Bindungsaffinität frei in Lösung zu bestätigen.

Research

JoVE Journal

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