Name: determining the thermodynamic and kinetic association of a dna aptamer and tetracycline using isothermal titration calorimetry
Uploaded: 2022-08-23T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry at JoVE.com

Questa ricerca è stata supportata dal finanziamento per la ricerca e lo sviluppo di Aptagen LLC.

NOTA: La Figura 2 mostra le fasi principali dell'esperimento ITC per determinare l'associazione termodinamica e cinetica di un aptamero del DNA e della tetraciclina.
1. Preparazione dei campioni
NOTA: I campioni per ITC devono essere preparati nello stesso tampone sia per l'aptamero che per il ligando per evitare il rilascio di calore causato dalla miscelazione di tamponi diversi dalla cella del campione e dalla siringa. ...

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	<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptasensors+for+environmental+monitoring+of+contaminants+in+water+and+soil.">Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil.</a> Current Opinion in Environmental Science &amp; Health. 10, 9-21 (2019).</li><li>Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+aptamers+specific+for+antibiotics+tetracyclines.">Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).</li><li>Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+aptasensor+for+tetracycline+detection.">Electrochemical aptasensor for tetracycline detection.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+indirect+competitive+assay-based+aptasensor+for+highly+sensitive+detection+of+tetracycline+residue+in+honey.">Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+colorimetric+aptasensor+using+gold+nanoparticle+for+a+highly+sensitive+and+specific+detection+of+oxytetracycline.">A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).</li><li>Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+photosensitisation+processes+by+an+RNA+aptamer.">Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer.</a> Scientific Reports. 7, 43272 (2017).</li><li>Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+and+thermodynamics+of+2',5'+RNA+intercalation.">Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).</li><li>Sigurskjold, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exact+analysis+of+competition+ligand+binding+by+displacement+isothermal+titration+calorimetry.">Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).</li><li>Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. 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Il metodo qui presentato è stato modificato secondo le istruzioni di TA Instruments ed è sufficiente per determinare l'affinità di legame e la termodinamica di molti aptameri e bersagli selezionati presso il nostro centro. I passaggi cruciali di questa procedura includono lo scambio del buffer per avere un target corrispondente al ligando, l'esecuzione di campioni con parametri appropriati e la ricerca del modello di adattamento di binding appropriato per analizzare i dati. La registrazione continua del rilascio di ca...

Gli aptameri sono frammenti di ssDNA o RNA selezionati attraverso un processo evolutivo con elevata affinità di legame e specificità ai bersagli desiderati 1,2, che possono funzionare come elementi di riconoscimento avanzato o anticorpi chimici 3,4,5. Pertanto, l'affinità di legame e la specificità degli aptameri ai loro bersagli svolgono un ruolo cruciale nella selezione e nell'applicazione di un aptamero e la calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è stata ampiamente utilizzata per questi scopi di caratterizzazione. Molti approcci sono stati utilizzati per determinare l'affinità degli aptameri, tra cui ITC, risonanza plasmonica di superficie (SPR), titolazione colorimetrica, termoforesi su microscala (MST) e interferometria a biostrati (BLI). Tra questi, ITC è una delle ultime tecniche per determinare l'associazione termodinamica e cinetica di due molecole nella fase di soluzione. Questo approccio conduce la titolazione continua utilizzando molecole label-free e registra il calore rilasciato nel tempo sugli eventi di legame prodotti da ciascuna titolazione 6,7. A differenza di altri metodi, ITC può offrire affinità di legame, diversi siti di legame e associazione termodinamica e cinetica (Figura 1A). Da questi parametri iniziali, le variazioni di energia libera di Gibbs e le variazioni di entropia sono determinate usando la seguente relazione:
ΔG = ΔH-TΔS
Ciò significa che ITC offre un profilo termodinamico completo dell'interazione molecolare per chiarire i meccanismi di legame (Figura 1B). Determinare l'affinità di legame per piccole molecole con un aptamero è difficile a causa delle dimensioni drasticamente diverse tra aptamero e bersaglio. Nel frattempo, ITC può fornire misurazioni sensibili senza etichettare e immobilizzare le molecole, il che fornisce un mezzo per mantenere la struttura naturale dell'aptamero e del bersaglio durante la misurazione. Con gli attributi menzionati, ITC può essere utilizzato come metodo standard per la caratterizzazione del legame tra un aptamero e piccoli bersagli.
Dopo la selezione da parte del gruppo Gu, questo aptamero è stato integrato con diverse piattaforme, tra cui biosensori elettrochimici basati su aptamero, un test aptamero enzimatico competitivo e una piastra di microtitolazione, che può ottenere un rilevamento ad alta produttività della tetraciclina 8,9,10. Tuttavia, le sue caratteristiche di legame non sono state chiarite abbastanza bene da sceglierela piattaforma 8 corretta; vale la pena caratterizzare il legame dell'aptamero alla tetraciclina usando ITC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG 
			C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG 
			TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc</td>
			<td></td>
			<td>The sequence is adopted from Gu&#39;s research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity ITC Auto Low Volume (190 &#181;L) System Complete&#8211;Gold Cells</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>61000.901</td>
			<td>Isothermal titration calorimetry system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Avantor (VWR)</td>
			<td>E506-100ML</td>
			<td>Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Degassing Station (110/230V)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6326</td>
			<td>This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>TekNova</td>
			<td>E0375</td>
			<td>EDTA 500 mM, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices</td>
			<td>Pall Laboratory</td>
			<td>OD030C34</td>
			<td>3 kDa molecular weight cutoff concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70165</td>
			<td>Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 &#181;m filter. Autoclaved at 121 &#176;C for greater than 20 min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>labForce (a Thomas Scientific Brand)</td>
			<td>1149K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline, Hydrochoride</td>
			<td>EMD Millipore Corperation</td>
			<td>CAS64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the thermodynamic and kinetic association of a dna aptamer and tetracycline using isothermal titration calorimetry

La determinazione dell'affinità e del comportamento di legame tra un aptamero e il suo bersaglio è il passo più cruciale nella selezione e nell'utilizzo di un aptamero per l'applicazione. A causa delle drastiche differenze tra l'aptamero e le piccole molecole, gli scienziati devono impegnarsi molto per caratterizzare le loro proprietà leganti. La calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è un approccio potente per questo scopo. L'ITC va oltre la determinazione delle costanti di dissociazione (Kd) e può fornire le variazioni di entalpia e la stechiometria di legame dell'interazione tra due molecole nella fase di soluzione. Questo approccio conduce la titolazione continua utilizzando molecole label-free e registra il calore rilasciato nel tempo sugli eventi di legame prodotti da ciascuna titolazione, in modo che il processo possa misurare sensibilmente il legame tra le macromolecole e i loro piccoli bersagli. Qui, l'articolo introduce una procedura passo-passo della misurazione ITC di un aptamero selezionato con un piccolo bersaglio, la tetraciclina. Questo esempio dimostra la versatilità della tecnica e il suo potenziale per altre applicazioni.

ITC fornisce un'accurata costante di dissociazione (Kd), la stechiometria di legame e i parametri termodinamici delle interazioni a due molecole6. In questo esempio, l'aptamero selezionato da Kim et al.9,11 si lega alla tetraciclina con affinità di legame di K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. È interessante notare che questo legame è stato determinato utilizzando il metodo di filtr...

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Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

Il presente protocollo descrive l'uso della calorimetria isotermica di titolazione (ITC) per analizzare l'associazione e la cinetica di dissociazione del legame tra un aptamero del DNA e una tetraciclina, compresa la preparazione del campione, gli standard di esecuzione e i campioni e l'interpretazione dei dati risultanti.

Determinazione dell'associazione termodinamica e cinetica di un aptamero del DNA e di una tetraciclina mediante calorimetria isotermica a titolazione

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Questo protocollo consente ai ricercatori di determinare le affinità di legame degli aptameri contro bersagli liberi in soluzione, fornendo al contempo informazioni sul meccanismo di legame. Poiché l'ITC misura i cambiamenti di calore dovuti al legame, né l'aptamero né il ligando devono essere etichettati o funzionalizzati, come nel caso di tecniche come SPR. I nuovi utenti devono prestare molta attenzione ai buffer corrispondenti tra tutti i componenti di associazione.Inoltre, tieni presente che la tecnica ha elevati requisiti di campionamento che possono essere difficili da soddisfare per ligandi più grandi come le proteine. Per iniziare, attivare la membrana della colonna di dialisi, riempire con tampone PBS, equilibrare per 10 minuti a temperatura ambiente e centrifugare a 5.000 volte G per 15 minuti. Rimuovere il tampone e caricare 500 microlitri di campioni di aptamero nella colonna.Centrifugare a 5.000 volte G e ripeterlo quattro volte per sostituire il buffer originale con PBS. Raccogliere l'aptamero del DNA dializzato utilizzando una pipetta e trasferirlo nel nuovo tubo da 1,5 millilitri. Raccogliere l'ultimo tampone di flusso per sciogliere la tetraciclina.Assicurarsi che il tampone per l'esperimento nella siringa corrisponda al tampone nella cella di riferimento. Determinare nuovamente la concentrazione dell'aptamero utilizzando uno spettrometro UV-visibile. Utilizzare l'ultimo tampone di scambio per regolare la concentrazione a 40 micromolari di tetraciclina e aptamero a due micromolari.Piegare l'aptamero del DNA riscaldando a 90 gradi Celsius per 10 minuti, raffreddando a quattro gradi Celsius per 10 minuti e quindi tornando a temperatura ambiente per 20 minuti. Degasare l'aptamero piegato e la tetraciclina dializzata utilizzando una stazione di degasaggio o una pompa per vuoto per 25 minuti per eliminare i gas disciolti. Dopo aver pulito e confermato la pulizia della macchina, testare l'accuratezza della macchina con un kit standard che include EDTA e cloruro di calcio utilizzando il programma predefinito e seguendo le istruzioni del produttore.Impostare i parametri di esecuzione. Controllare i volumi richiesti utilizzando un calcolatore di programmi in esecuzione. Con questo parametro di funzionamento, eseguire la misurazione ITC con 230 microlitri di tetraciclina 40-micromolare nella siringa ITC e 485 microlitri di aptamero a due micromolari nella cella campione ITC utilizzando ITC.Caricare le piastre della siringa tetraciclina dializzate e l'aptamero piegato nella cella del campione, evitando bolle, usando una pipetta. Avviare l'esecuzione dello strumento ITC facendo clic sul pulsante Start sul software. Aprire il software di analisi dei dati facendo doppio clic per avviare l'analisi dei dati.Aprire il percorso dei dati grezzi salvati per conoscere la tendenza all'associazione. Aprire la scheda Modellazione e utilizzare diversi modelli di associazione per trovare la soluzione migliore per la curva di dati. Quindi, il software calcola automaticamente il termogramma ITC e vari parametri termodinamici, tra cui entalpia, entropia, energia libera, costante di legame all'equilibrio e stechiometria.Raccogliere i parametri termodinamici determinati dai dati e dalle informazioni del modello di adattamento. Creare un report che includa immagini del termogramma ITC e vari parametri termodinamici. L'aptamero selezionato da Kim, et al si lega alla tetraciclina con affinità di legame della costante di dissociazione uno uguale a 13 micromolari e la costante di dissociazione due uguale a 53 nanomolari.Il modello di adattamento e la stechiometria di ITC riflettono che l'aptamero si lega alla tetraciclina attraverso un rapporto di legame 2: 1 con il modello di legame sequenziale. I parametri termodinamici determinati dalla misurazione ITC per il sito due hanno indicato che il superamento di una perdita entropica relativamente significativa guida il forte legame. Il legame guidato dall'entalpia con perdita di entropia si riferisce ai cambiamenti conformazionali degli acidi nucleici, che sono stati riportati come comportamenti di legame tra l'RNA e una piccola molecola.L'aptamero e il ligando devono trovarsi nello stesso buffer. L'aptamero deve essere ripiegato se sviluppato con ripiegatura e i campioni devono essere degassati. Affrontare queste considerazioni assicurerà che solo le interazioni aptamero-ligando contribuiscano al segnale misurato.A causa delle dimensioni del target aptamero, un metodo di follow-up appropriato potrebbe essere la termoforesi su microscala per confermare l'affinità di legame misurata libera in soluzione.

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