Name: determining the thermodynamic and kinetic association of a dna aptamer and tetracycline using isothermal titration calorimetry
Uploaded: 2022-08-23T13:45:00
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この研究は、Aptagen LLCの研究開発資金によって支援されました。

注: 図2 は、DNAアプタマーとテトラサイクリンの熱力学的および速度論的会合を決定するためのITC実験の主なステップを示しています。
1. サンプルの調製
注:ITCのサンプルは、サンプルセルとシリンジからの異なるバッファーの混合による熱放出を避けるために、アプタマーとリガンドの両方で同じバッファーで調製?...

<ol>
	<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptasensors+for+environmental+monitoring+of+contaminants+in+water+and+soil.">Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil.</a> Current Opinion in Environmental Science &amp; Health. 10, 9-21 (2019).</li><li>Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aptamer+discovery+and+technology.">Analysis of aptamer discovery and technology.</a> Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).</li><li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SELEX--A+(r)evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands.">SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).</li><li>Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+aptamers+specific+for+antibiotics+tetracyclines.">Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).</li><li>Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+aptasensor+for+tetracycline+detection.">Electrochemical aptasensor for tetracycline detection.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+indirect+competitive+assay-based+aptasensor+for+highly+sensitive+detection+of+tetracycline+residue+in+honey.">Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+colorimetric+aptasensor+using+gold+nanoparticle+for+a+highly+sensitive+and+specific+detection+of+oxytetracycline.">A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).</li><li>Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+photosensitisation+processes+by+an+RNA+aptamer.">Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer.</a> Scientific Reports. 7, 43272 (2017).</li><li>Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+and+thermodynamics+of+2',5'+RNA+intercalation.">Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).</li><li>Sigurskjold, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exact+analysis+of+competition+ligand+binding+by+displacement+isothermal+titration+calorimetry.">Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).</li><li>Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt-mediated+two-site+ligand+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.">Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).</li><li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+value+of+c:+Can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry.">On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).</li><li>Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+reactions+for+the+amplification+of+oligonucleotides.">Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).</li></ol>

ここで紹介する方法は、TA Instrumentsの指示に従って変更されており、当センターで選択された多くのアプタマーとターゲットの結合親和性と熱力学を決定するのに十分です。この手順の重要なステップには、リガンドに一致するターゲットを持つようにバッファーを交換すること、適切なパラメータでサンプルを実行すること、およびデータを分析するための適切な結合フィッティングモデ?...

アプタマーは、所望の標的1,2に対する高い結合親和性および特異性を有する進化過程を通じて選択されたssDNAまたはRNA断片であり、これは高度な認識要素または化学抗体として働き得る3,4,5。したがって、アプタマーの標的への結合親和性と特異性は、アプタマーの選択と適用において重要な役割を果たし、等温滴定熱量測定(ITC)はこれらの特性評価の目的で広く使用されています。ITC、表面プラズモン共鳴(SPR)、比色滴定、マイクロスケール熱泳動(MST)、バイオレイヤー干渉法(BLI)など、アプタマーの親和性を決定するために多くのアプローチが使用されてきました。その中で、ITCは、溶液相における2つの分子の熱力学的および速度論的会合を決定するための最新の技術の1つです。このアプローチは、ラベルフリー分子を用いて連続滴定を行い、各滴定によって生じる結合事象に対して経時的に放出された熱を記録する6,7。他の方法とは異なり、ITCは結合親和性、いくつかの結合部位、および熱力学的および速度論的会合を提供することができます(図1A)。これらの初期パラメータから、ギブズの自由エネルギー変化とエントロピー変化は、次の関係を使用して決定されます。
ΔG = ΔH-TΔS
つまり、ITCは分子間相互作用の完全な熱力学的プロファイルを提供し、結合メカニズムを解明します(図1B)。アプタマーと低分子の結合親和性の決定は、アプタマーとターゲットのサイズが大きく異なるため困難です。一方、ITCは分子を標識したり固定化したりすることなく高感度な測定が可能で、測定中にアプタマーやターゲットの自然な構造を保つことができます。上記の特性により、ITCは、アプタマーと小さなターゲットとの間の結合の特性評価のための標準的な方法として使用できます。
Guグループによる選択後、このアプタマーは、電気化学的アプタマーベースのバイオセンサー、競合する酵素結合アプタマーアッセイ、テトラサイクリン8,9,10のハイスループット検出を達成できるマイクロタイタープレートなど、さまざまなプラットフォームと統合されました。しかしながら、その結合特性は、適切なプラットフォームを選択するのに十分なほど十分に解明されていない8;ITCを用いてアプタマーのテトラサイクリンへの結合を特徴付ける価値がある。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG 
			C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG 
			TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc</td>
			<td></td>
			<td>The sequence is adopted from Gu&#39;s research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity ITC Auto Low Volume (190 &#181;L) System Complete&#8211;Gold Cells</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>61000.901</td>
			<td>Isothermal titration calorimetry system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Avantor (VWR)</td>
			<td>E506-100ML</td>
			<td>Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Degassing Station (110/230V)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6326</td>
			<td>This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>TekNova</td>
			<td>E0375</td>
			<td>EDTA 500 mM, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices</td>
			<td>Pall Laboratory</td>
			<td>OD030C34</td>
			<td>3 kDa molecular weight cutoff concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70165</td>
			<td>Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 &#181;m filter. Autoclaved at 121 &#176;C for greater than 20 min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>labForce (a Thomas Scientific Brand)</td>
			<td>1149K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline, Hydrochoride</td>
			<td>EMD Millipore Corperation</td>
			<td>CAS64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the thermodynamic and kinetic association of a dna aptamer and tetracycline using isothermal titration calorimetry

アプタマーとその標的との間の結合親和性と挙動の決定は、適用するアプタマーを選択して使用する上で最も重要なステップです。アプタマーと低分子の間には劇的な違いがあるため、科学者はそれらの結合特性の特性評価に多大な努力を払う必要があります。等温滴定熱量測定(ITC)は、この目的のための強力なアプローチです。ITCは、解離定数(Kk)の決定を超えて、溶液相における2つの分子間の相互作用のエンタルピー変化と結合化学量論を提供することができます。このアプローチは、ラベルフリー分子を使用して連続滴定を行い、各滴定によって生成される結合イベントで時間の経過とともに放出された熱を記録するため、このプロセスでは高分子とその小さなターゲット間の結合を高感度に測定できます。ここでは、小さな標的であるテトラサイクリンを用いて選択されたアプタマーのITC測定の段階的な手順を紹介します。この例は、この手法の汎用性と他のアプリケーションへの可能性を証明しています。

ITCは、正確な解離定数(Kd)、結合化学量論、および2分子相互作用の熱力学的パラメータを提供します6。この例では、Kimら9,11によって選択されたアプタマーは、Kd 1 = 13 μM、K d 2 = 53 nMの結合親和性でテトラサイクリンに結合します。興味深いことに、この結合は平衡ろ過法および63.3nMの?...

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Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

本プロトコルは、等温滴定熱量測定(ITC)を使用して、DNAアプタマーとテトラサイクリンの間の結合の会合および解離速度論を分析し、サンプル調製、標準およびサンプルの実行、および結果のデータの解釈を含むことを説明しています。

等温滴定熱量測定を用いたDNAアプタマーとテトラサイクリンの熱力学的および速度論的会合の決定(英語)

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

このプロトコルにより、研究者は溶液中に遊離した標的に対するアプタマーの結合親和性を決定できると同時に、結合のメカニズムについての洞察を得ることができます。ITCは結合による熱変化を測定するため、SPRなどの技術のようにアプタマーやリガンドを標識したり機能化したりする必要はありません。新しいユーザーは、すべてのバインド コンポーネント間でバッファーを一致させることに細心の注意を払う必要があります。さらに、この手法には高いサンプル要件があり、タンパク質などの大きなリガンドでは満たすのが難しい場合があることに注意してください。はじめに、透析カラムの膜を活性化し、PBSバッファーで満たし、室温で10分間平衡化し、5, 000倍Gで15分間遠心分離します。バッファーを除去し、500マイクロリットルのアプタマーサンプルをカラムにロードします。5, 000倍のGで遠心分離し、それを4回繰り返して、元のバッファーをPBSに交換します。透析したDNAアプタマーをピペットで回収し、新しい1.5ミリリットルチューブに移します。最後のフロースルーバッファーを収集して、テトラサイクリンを溶解します。シリンジ内の実験用のバッファーが参照セル内のバッファーと一致することを確認します。紫外可視分光計を用いて再度アプタマー濃度を測定します。最後の交換バッファーを使用して、濃度を40マイクロモルのテトラサイクリンと2マイクロモルのアプタマーに調整します。DNAアプタマーを90°Cで10分間加熱し、4°Cで10分間冷却した後、室温に20分間戻します。折り畳まれたアプタマーと透析テトラサイクリンを脱気ステーションまたは真空ポンプで25分間脱気し、溶存ガスを除去します。機械をクリーンアップして清浄度を確認した後、デフォルトのプログラムを使用し、製造元の指示に従って、EDTAと塩化カルシウムを含む標準キットで機械の精度をテストします。実行パラメータを設定します。実行中のプログラム計算機を使用して、必要なボリュームを確認します。この実行パラメータを使用して、ITCシリンジ内の230マイクロリットルの40マイクロモルテトラサイクリンとITCサンプルセル内の485マイクロリットルの2マイクロモルアプタマーを使用してITC測定を実行します。透析したテトラサイクリンシリンジプレートと折り畳まれたアプタマーを、ピペットを使用して気泡を避けてサンプルセルにロードします。ソフトウェアの[スタート]ボタンをクリックして、ITC機器の実行を開始します。ダブルクリックしてデータ分析ソフトウェアを開き、データの分析を開始します。保存した生データのパスを開いて、バインドの傾向を確認します。モデリングタブを開き、さまざまなバインドモデルを使用して、データ曲線に最適なものを見つけます。次に、ソフトウェアはITCサーモグラムと、エンタルピー、エントロピー、自由エネルギー、平衡結合定数、化学量論などのさまざまな熱力学的パラメータを自動的に計算します。データとフィットモデル情報から決定された熱力学的パラメータを収集します。ITCサーモグラムの写真とさまざまな熱力学パラメータを含むレポートを作成します。Kimらによって選択されたアプタマーは、解離定数1が13マイクロモルに等しく、解離定数2が53ナノモルに等しい結合親和性を有するテトラサイクリンに結合する。ITCのフィッティングモデルと化学量論は、アプタマーがシーケンシャル結合モデルとの2:1の結合比でテトラサイクリンに結合することを反映しています。サイト2のITC測定によって決定された熱力学的パラメータは、比較的有意なエントロピー損失を克服するエンタルピーが強い結合を促進することを示しました。エントロピー損失を伴うエンタルピー駆動結合は、RNAと低分子間の結合挙動として報告されている核酸立体構造変化に関連しています。アプタマーとリガンドは同じバッファーに入っている必要があります。アプタマーは、リフォールディングで現像する場合はリフォールドし、サンプルは脱気する必要があります。これらの考慮事項に対処することで、アプタマー-リガンド相互作用のみが測定シグナルに寄与することが保証されます。アプタマーターゲットのサイズにより、適切なフォローアップ方法は、溶液中で測定された結合親和性フリーを確認するためのマイクロスケールの熱泳動である可能性があります。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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