Name: determining the thermodynamic and kinetic association of a dna aptamer and tetracycline using isothermal titration calorimetry
Uploaded: 2022-08-23T13:45:00
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Esta pesquisa foi apoiada pelo Financiamento de Pesquisa e Desenvolvimento da Aptagen LLC.

NOTA: A Figura 2 mostra as principais etapas do experimento ITC para determinar a associação termodinâmica e cinética de um aptâmero de DNA e tetraciclina.
1. Preparação das amostras
NOTA: As amostras para ITC têm de ser preparadas no mesmo tampão para o aptâmero e o ligante, a fim de evitar a libertação de calor causada pela mistura de diferentes tampões da célula e da seringa da amostra. Isto é tipicament...

<ol>
	<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+aptasensor+for+tetracycline+detection.">Electrochemical aptasensor for tetracycline detection.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+indirect+competitive+assay-based+aptasensor+for+highly+sensitive+detection+of+tetracycline+residue+in+honey.">Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+colorimetric+aptasensor+using+gold+nanoparticle+for+a+highly+sensitive+and+specific+detection+of+oxytetracycline.">A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).</li><li>Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+photosensitisation+processes+by+an+RNA+aptamer.">Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer.</a> Scientific Reports. 7, 43272 (2017).</li><li>Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+and+thermodynamics+of+2',5'+RNA+intercalation.">Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).</li><li>Sigurskjold, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exact+analysis+of+competition+ligand+binding+by+displacement+isothermal+titration+calorimetry.">Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).</li><li>Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. 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O método aqui apresentado foi modificado de acordo com as instruções da TA Instruments e é suficiente para determinar a afinidade de ligação e termodinâmica de muitos aptâmeros e alvos selecionados em nosso centro. As etapas cruciais desse procedimento incluem a troca do buffer para ter um alvo correspondente ao ligante, a execução de amostras com parâmetros adequados e a localização do modelo de ajuste de ligação apropriado para analisar os dados. O registro contínuo da liberação de calor requer a elim...

Aptamers são fragmentos de ssDNA ou RNA selecionados através de um processo evolutivo com alta afinidade de ligação e especificidade aos alvos desejados1,2, que podem funcionar como elementos avançados de reconhecimento ou anticorpos químicos 3,4,5. Assim, a afinidade de ligação e especificidade dos aptâmeros aos seus alvos desempenham um papel crucial na seleção e aplicação de um aptâmero, e a Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) tem sido amplamente utilizada para esses fins de caracterização. Muitas abordagens têm sido usadas para determinar a afinidade dos aptâmeros, incluindo ITC, ressonância plasmônica de superfície (SPR), titulação colorimétrica, termoforese em microescala (MST) e interferometria de biocamada (BLI). Entre elas, a TIC é uma das mais recentes técnicas para determinar a associação termodinâmica e cinética de duas moléculas na fase de solução. Essa abordagem realiza titulação contínua utilizando moléculas livres de rótulo e registra calor liberado ao longo do tempo sobre os eventos de ligação produzidos por cada titulação 6,7. Ao contrário de outros métodos, o ITC pode oferecer afinidade de ligação, vários sítios de ligação e associação termodinâmica e cinética (Figura 1A). A partir desses parâmetros iniciais, as mudanças de energia livre de Gibbs e as mudanças de entropia são determinadas usando a seguinte relação:
ΔG = ΔH-TΔS
Isso significa que o ITC oferece um perfil termodinâmico completo da interação molecular para elucidar os mecanismos de ligação (Figura 1B). Determinar a afinidade de ligação para pequenas moléculas com um aptâmero é difícil devido aos tamanhos drasticamente diferentes entre o aptâmero e o alvo. Enquanto isso, o ITC pode fornecer medição sensível sem rotular e imobilizar moléculas, o que fornece um meio de manter a estrutura natural do aptâmero e do alvo durante a medição. Com os atributos mencionados, o ITC pode ser usado como o método padrão para a caracterização da ligação entre um aptâmero e pequenos alvos.
Após a seleção pelo grupo Gu, este aptâmero foi integrado com diferentes plataformas, incluindo biossensores eletroquímicos à base de aptâmeros, um ensaio de aptâmero ligado a enzimas competitivas e uma placa de microtitulação, que pode alcançar a detecção de alto rendimento de tetraciclina 8,9,10. No entanto, suas características vinculantes não foram elucidadas o suficiente para escolher a plataforma adequada8; vale a pena caracterizar a ligação do aptâmero à tetraciclina usando ITC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG 
			C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG 
			TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc</td>
			<td></td>
			<td>The sequence is adopted from Gu&#39;s research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity ITC Auto Low Volume (190 &#181;L) System Complete&#8211;Gold Cells</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>61000.901</td>
			<td>Isothermal titration calorimetry system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Avantor (VWR)</td>
			<td>E506-100ML</td>
			<td>Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Degassing Station (110/230V)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6326</td>
			<td>This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>TekNova</td>
			<td>E0375</td>
			<td>EDTA 500 mM, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices</td>
			<td>Pall Laboratory</td>
			<td>OD030C34</td>
			<td>3 kDa molecular weight cutoff concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70165</td>
			<td>Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 &#181;m filter. Autoclaved at 121 &#176;C for greater than 20 min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>labForce (a Thomas Scientific Brand)</td>
			<td>1149K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline, Hydrochoride</td>
			<td>EMD Millipore Corperation</td>
			<td>CAS64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the thermodynamic and kinetic association of a dna aptamer and tetracycline using isothermal titration calorimetry

A determinação da afinidade de ligação e do comportamento entre um aptâmero e seu alvo é o passo mais crucial na seleção e uso de um aptâmero para aplicação. Devido às diferenças drásticas entre o aptâmero e as pequenas moléculas, os cientistas precisam se esforçar muito para caracterizar suas propriedades de ligação. A Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) é uma abordagem poderosa para esse fim. O ITC vai além da determinação de constantes de dissociação (Kd) e pode fornecer as alterações de entalpia e estequiometria de ligação da interação entre duas moléculas na fase de solução. Essa abordagem conduz a titulação contínua usando moléculas livres de rótulo e registra o calor liberado ao longo do tempo sobre os eventos de ligação produzidos por cada titulação, de modo que o processo possa medir sensivelmente a ligação entre as macromoléculas e seus pequenos alvos. Aqui, o artigo introduz um procedimento passo-a-passo da medição ITC de um aptâmero selecionado com um pequeno alvo, a tetraciclina. Este exemplo comprova a versatilidade da técnica e seu potencial para outras aplicações.

A ITC fornece uma constante de dissociação precisa (Kd), a estequiometria de ligação e os parâmetros termodinâmicos das interações de duas moléculas6. Neste exemplo, o aptâmero selecionado por Kim et al.9,11 liga-se à tetraciclina com afinidades de ligação de K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Curiosamente, essa ligação foi determinada usando o método de filtração de ...

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Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

O presente protocolo descreve o uso da Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) para analisar a cinética de associação e dissociação da ligação entre um aptâmero de DNA e tetraciclina, incluindo a preparação de amostras, padrões de corrida e amostras, e a interpretação dos dados resultantes.

Determinando a associação termodinâmica e cinética de um aptamer de DNA e tetraciclina usando calorimetria de titulação isotérmica

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Este protocolo permite que os pesquisadores determinem as afinidades de ligação dos aptâmeros contra alvos livres de solução, ao mesmo tempo em que fornecem informações sobre o mecanismo de ligação. Como o ITC mede as mudanças no calor devido à ligação, nem o aptâmero nem o ligante precisam ser rotulados ou funcionalizados, como seria o caso de técnicas como o SPR. Novos usuários devem prestar muita atenção aos buffers correspondentes em todos os componentes de ligação.Além disso, esteja ciente de que a técnica tem altos requisitos de amostra que podem ser difíceis de atender para ligantes maiores, como proteínas. Para começar, ative a membrana da coluna de diálise, preencha com tampão PBS, equilibre-se por 10 minutos à temperatura ambiente e centrifuga-se a 5.000 vezes G por 15 minutos. Remova o tampão e carregue 500 microlitros de amostras de aptâmero na coluna.Centrifugar a 5.000 vezes G e repeti-lo quatro vezes para trocar o buffer original por PBS. Colete o aptâmero de DNA dialisado usando uma pipeta e transfira-o para o novo tubo de 1,5 mililitro. Recolha o último tampão de fluxo para dissolver a tetraciclina.Certifique-se de que o buffer para o experimento na seringa corresponde ao buffer na célula de referência. Determine a concentração de aptâmero novamente usando um espectrômetro UV-visível. Use o último tampão de troca para ajustar a concentração para tetraciclina de 40 micromolares e aptâmero de dois micromolares.Dobre o aptâmero de DNA aquecendo a 90 graus Celsius por 10 minutos, resfriando a quatro graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, retornando à temperatura ambiente por 20 minutos. Desgaseifique o aptâmero dobrado e a tetraciclina dialisada usando uma estação de desgaseificação ou bomba de vácuo por 25 minutos para eliminar os gases dissolvidos. Depois de limpar e confirmar a limpeza da máquina, teste a precisão da máquina com um kit padrão que inclui EDTA e cloreto de cálcio usando o programa padrão e seguindo as instruções do fabricante.Configure os parâmetros em execução. Verifique os volumes necessários usando uma calculadora de programa em execução. Com este parâmetro de execução, realize a medição de ITC com 230 microlitros de tetraciclina de 40 micromolares na seringa ITC e 485 microlitros de aptâmero de dois micromolares na célula de amostra de ITC usando o ITC.Carregue as placas de seringa de tetraciclina dialisada e o aptâmero dobrado na célula da amostra, evitando bolhas, utilizando uma pipeta. Comece a executar o instrumento ITC clicando no botão Iniciar no software. Abra o software de análise de dados clicando duas vezes para começar a analisar os dados.Abra o caminho dos dados brutos salvos para saber a tendência de vinculação. Abra a guia Modelagem e use modelos de vinculação diferentes para encontrar o melhor ajuste para a curva de dados. Em seguida, o software calcula automaticamente o termograma ITC e vários parâmetros termodinâmicos, incluindo entalpia, entropia, energia livre, constante de ligação de equilíbrio e estequiometria.Colete os parâmetros termodinâmicos determinados a partir dos dados e informações do modelo de ajuste. Crie um relatório incluindo imagens do termograma ITC e vários parâmetros termodinâmicos. O aptâmero selecionado por Kim, et al liga-se à tetraciclina com afinidades de ligação de constante de dissociação uma igual a 13 micromolares e constante de dissociação duas igual a 53 nanomolares.O modelo de ajuste e a estequiometria do ITC refletem que o aptâmero se liga à tetraciclina através de uma relação de ligação de 2:1 com o modelo de ligação sequencial. Os parâmetros termodinâmicos determinados pela medição ITC para o local dois indicaram que a superação da entalpia relativamente significativa impulsiona a forte ligação. A ligação impulsionada pela entalpia com perda de entropia refere-se a alterações conformacionais do ácido nucleico, que foram relatadas como comportamentos de ligação entre o RNA e uma pequena molécula.O aptâmero e o ligante devem estar no mesmo tampão. O aptâmero deve ser redobrado se desenvolvido com redobramento, e as amostras devem ser desgaseificadas. Abordar essas considerações garantirá que apenas as interações aptâmero-ligante contribuam para o sinal medido.Devido ao tamanho do alvo do aptâmero, um método de acompanhamento apropriado poderia ser a termoforese em microescala para confirmar a afinidade de ligação medida livre em solução.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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