Name: determining the thermodynamic and kinetic association of a dna aptamer and tetracycline using isothermal titration calorimetry
Uploaded: 2022-08-23T13:45:00
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Esta investigación fue apoyada por la financiación de investigación y desarrollo de Aptagen LLC.

NOTA: La Figura 2 muestra los pasos principales del experimento ITC para determinar la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de ADN y tetraciclina.
1. Preparación de las muestras
NOTA: Las muestras para ITC deben prepararse en el mismo tampón tanto para el aptámero como para el ligando, a fin de evitar la liberación de calor causada por la mezcla de diferentes tampones de la celda y la jeringa de la m...

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	<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+aptasensor+for+tetracycline+detection.">Electrochemical aptasensor for tetracycline detection.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+indirect+competitive+assay-based+aptasensor+for+highly+sensitive+detection+of+tetracycline+residue+in+honey.">Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+colorimetric+aptasensor+using+gold+nanoparticle+for+a+highly+sensitive+and+specific+detection+of+oxytetracycline.">A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).</li><li>Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+photosensitisation+processes+by+an+RNA+aptamer.">Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer.</a> Scientific Reports. 7, 43272 (2017).</li><li>Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+and+thermodynamics+of+2',5'+RNA+intercalation.">Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).</li><li>Sigurskjold, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exact+analysis+of+competition+ligand+binding+by+displacement+isothermal+titration+calorimetry.">Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).</li><li>Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. 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El método presentado aquí fue modificado de acuerdo con las instrucciones de TA Instruments y es suficiente para determinar la afinidad de unión y la termodinámica de muchos aptámeros y objetivos seleccionados en nuestro centro. Los pasos cruciales de este procedimiento incluyen el intercambio del tampón para tener un objetivo que coincida con el ligando, ejecutar muestras con los parámetros adecuados y encontrar el modelo de ajuste de unión apropiado para analizar los datos. El registro continuo de la liberació...

Los aptámeros son fragmentos de ssDNA o ARN seleccionados a través de un proceso de evolución con alta afinidad y especificidad de unión a las dianas deseadas1,2, que pueden funcionar como elementos de reconocimiento avanzado o anticuerpos químicos 3,4,5. Por lo tanto, la afinidad y especificidad de unión de los aptámeros a sus objetivos juegan un papel crucial en la selección y aplicación de un aptámero, y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) se ha utilizado ampliamente para estos fines de caracterización. Se han utilizado muchos enfoques para determinar la afinidad de los aptámeros, incluyendo ITC, resonancia de plasmones de superficie (SPR), titulación colorimétrica, termoforesis a microescala (MST) e interferometría de biocapa (BLI). Entre ellas, ITC es una de las últimas técnicas para determinar la asociación termodinámica y cinética de dos moléculas en la fase de solución. Este enfoque lleva a cabo una valoración continua utilizando moléculas sin etiquetas y registra el calor liberado a lo largo del tiempo sobre los eventos de unión producidos por cada valoración 6,7. A diferencia de otros métodos, ITC puede ofrecer afinidad de unión, varios sitios de unión y asociación termodinámica y cinética (Figura 1A). A partir de estos parámetros iniciales, los cambios de energía libre de Gibbs y los cambios de entropía se determinan utilizando la siguiente relación:
ΔG = ΔH-TΔS
Eso significa que ITC ofrece un perfil termodinámico completo de la interacción molecular para dilucidar los mecanismos de unión (Figura 1B). Determinar la afinidad de unión para moléculas pequeñas con un aptámero es difícil debido a los tamaños drásticamente diferentes entre el aptámero y el objetivo. Mientras tanto, ITC puede proporcionar mediciones sensibles sin etiquetar e inmovilizar moléculas, lo que proporciona un medio para mantener la estructura natural del aptámero y el objetivo durante la medición. Con los atributos mencionados, ITC se puede utilizar como el método estándar para la caracterización de la unión entre un aptámero y objetivos pequeños.
Después de la selección por parte del grupo Gu, este aptámero se integró con diferentes plataformas, incluidos biosensores electroquímicos basados en aptámeros, un ensayo competitivo de aptámero ligado a enzimas y una placa de microtitulación, que puede lograr una detección de alto rendimiento de tetraciclina 8,9,10. Sin embargo, sus características de unión no se han dilucidado lo suficientemente bien como para elegir la plataforma adecuada8; vale la pena caracterizar la unión del aptámero a la tetraciclina utilizando ITC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG 
			C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG 
			TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc</td>
			<td></td>
			<td>The sequence is adopted from Gu&#39;s research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity ITC Auto Low Volume (190 &#181;L) System Complete&#8211;Gold Cells</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>61000.901</td>
			<td>Isothermal titration calorimetry system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Avantor (VWR)</td>
			<td>E506-100ML</td>
			<td>Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Degassing Station (110/230V)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6326</td>
			<td>This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>TekNova</td>
			<td>E0375</td>
			<td>EDTA 500 mM, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices</td>
			<td>Pall Laboratory</td>
			<td>OD030C34</td>
			<td>3 kDa molecular weight cutoff concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70165</td>
			<td>Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 &#181;m filter. Autoclaved at 121 &#176;C for greater than 20 min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>labForce (a Thomas Scientific Brand)</td>
			<td>1149K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline, Hydrochoride</td>
			<td>EMD Millipore Corperation</td>
			<td>CAS64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the thermodynamic and kinetic association of a dna aptamer and tetracycline using isothermal titration calorimetry

La determinación de la afinidad y el comportamiento de unión entre un aptámero y su objetivo es el paso más crucial en la selección y el uso de un aptámero para su aplicación. Debido a las drásticas diferencias entre el aptámero y las moléculas pequeñas, los científicos deben esforzarse mucho en caracterizar sus propiedades de unión. La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es un enfoque poderoso para este propósito. ITC va más allá de determinar constantes de disociación (Kd) y puede proporcionar los cambios de entalpía y la estequiometría de unión de la interacción entre dos moléculas en la fase de solución. Este enfoque lleva a cabo una valoración continua utilizando moléculas sin etiquetas y registra el calor liberado a lo largo del tiempo sobre los eventos de unión producidos por cada valoración, por lo que el proceso puede medir con sensibilidad la unión entre macromoléculas y sus pequeños objetivos. Aquí, el artículo presenta un procedimiento paso a paso de la medición ITC de un aptámero seleccionado con un objetivo pequeño, la tetraciclina. Este ejemplo demuestra la versatilidad de la técnica y su potencial para otras aplicaciones.

ITC proporciona una constante de disociación precisa (Kd), la estequiometría de unión y los parámetros termodinámicos de las interacciones de dos moléculas6. En este ejemplo, el aptámero seleccionado por Kim et al.9,11 se une a la tetraciclina con afinidades de unión de K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Curiosamente, esta unión se determinó utilizando el método de filtraci...

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Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

El presente protocolo describe el uso de la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) para analizar la cinética de asociación y disociación de la unión entre un aptámero de ADN y tetraciclina, incluida la preparación de muestras, los patrones de ejecución y las muestras, y la interpretación de los datos resultantes.

Determinación de la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de ADN y tetraciclina mediante calorimetría de titulación isotérmica

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Este protocolo permite a los investigadores determinar las afinidades de unión de los aptámeros contra objetivos libres en solución, al tiempo que proporciona información sobre el mecanismo de unión. Debido a que ITC mide los cambios en el calor debido a la unión, ni el aptámero ni el ligando necesitan ser etiquetados o funcionalizados, como sería el caso de técnicas como SPR. Los nuevos usuarios deben prestar mucha atención a los búferes coincidentes en todos los componentes de enlace.Además, tenga en cuenta que la técnica tiene altos requisitos de muestra que pueden ser difíciles de cumplir para ligandos más grandes, como las proteínas. Para comenzar, active la membrana de la columna de diálisis, llene con tampón PBS, equilibre durante 10 minutos a temperatura ambiente y centrifugue a 5, 000 veces G durante 15 minutos. Retire el tampón y cargue 500 microlitros de muestras de aptámeros en la columna.Centrifugar a 5.000 veces G y repetirlo cuatro veces para cambiar el búfer original por PBS. Recoja el aptámero de ADN dializado con una pipeta y transfiéralo al nuevo tubo de 1,5 mililitros. Recoja el último tampón de flujo para disolver la tetraciclina.Asegúrese de que el tampón del experimento en la jeringa coincida con el tampón de la celda de referencia. Determine de nuevo la concentración del aptámero utilizando un espectrómetro UV-visible. Utilice el último tampón de intercambio para ajustar la concentración a tetraciclina 40 micromolares y aptámero de dos micromolares.Doble el aptámero de ADN calentando a 90 grados centígrados durante 10 minutos, enfriando a cuatro grados centígrados durante 10 minutos y luego volviendo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Desgasifique el aptámero plegado y la tetraciclina dializada utilizando una estación de desgasificación o una bomba de vacío durante 25 minutos para eliminar los gases disueltos. Después de limpiar y confirmar la limpieza de la máquina, pruebe la precisión de la máquina con un kit estándar que incluya EDTA y cloruro de calcio utilizando el programa predeterminado y siguiendo las instrucciones del fabricante.Configure los parámetros de ejecución. Compruebe los volúmenes necesarios utilizando una calculadora de programas en ejecución. Con este parámetro de ejecución, realice la medición ITC con 230 microlitros de tetraciclina 40 micromolares en la jeringa ITC y 485 microlitros de aptámero de dos micromolares en la celda de muestra ITC utilizando el ITC.Cargue las placas de jeringa de tetraciclina dializada y el aptámero plegado en la celda de muestra, evitando burbujas, utilizando una pipeta. Comience a ejecutar el instrumento ITC haciendo clic en el botón Inicio del software. Abra el software de análisis de datos haciendo doble clic para comenzar a analizar los datos.Abra la ruta de los datos sin procesar guardados para conocer la tendencia de vincular. Abra la pestaña Modelado y utilice diferentes modelos de enlace para encontrar el que mejor se ajuste a la curva de datos. Luego, el software calcula automáticamente el termograma ITC y varios parámetros termodinámicos, incluyendo entalpía, entropía, energía libre, constante de unión de equilibrio y estequiometría.Recopile los parámetros termodinámicos determinados a partir de los datos y la información del modelo de ajuste. Cree un informe que incluya imágenes del termograma ITC y varios parámetros termodinámicos. El aptámero seleccionado por Kim, et al se une a la tetraciclina con afinidades de unión de la constante de disociación uno es igual a 13 micromolar y la constante de disociación dos es igual a 53 nanomolar.El modelo de ajuste y la estequiometría de ITC reflejan que el aptámero se une a la tetraciclina a través de una relación de unión de 2:1 con el modelo de unión secuencial. Los parámetros termodinámicos determinados por la medición ITC para el sitio dos indicaron que la entalpía que supera la pérdida entrópica relativamente significativa impulsa la unión fuerte. La unión impulsada por entalpía con pérdida de entropía se relaciona con cambios conformacionales de ácidos nucleicos, que se han reportado como comportamientos de unión entre el ARN y una molécula pequeña.El aptámero y el ligando deben estar en el mismo tampón. El aptámero debe volver a plegarse si se desarrolla con repliegue, y las muestras deben desgasificarse. Abordar estas consideraciones asegurará que solo las interacciones aptámero-ligando contribuyan a la señal medida.Debido al tamaño del objetivo del aptámero, un método de seguimiento apropiado podría ser la termoforesis a microescala para confirmar la afinidad de unión medida libre en solución.

Research

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