Name: flow cytometry analysis of murine bone marrow hematopoietic stem and progenitor cells and stromal niche cells
Uploaded: 2022-09-28T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells at JoVE.com

LM blev støttet af et tilskud fra Lady Tata Memorial Trust. JR blev støttet af et ph.d.-stipendium fra Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT-stipendium UI/BD/150833/2021). ML blev støttet af et ph.d.-stipendium fra FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD blev støttet af tilskud fra American Society of Hematology, Pablove Foundation, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) og Portuguese Society of Hematology. Vi takker støtten fra Dr. Catarina Meireles og Emilia Cardoso fra Tracy-anlægget på i3s.

De dyr, der anvendes i denne protokol, blev anbragt på i3S-dyreanlægget under specifikke patogenfrie forhold i en 12 timers lys-mørk cyklus og temperaturkontrolleret miljø. Fri adgang til standard gnaver chow og vand blev leveret. Alle dyrene modtog human pleje i henhold til de kriterier, der er skitseret af Federation of European Laboratory Animal Science Associations for pleje og håndtering af forsøgsdyr (EU-direktiv 2010/63/EU). Den eksperimentelle procedure udført på dyrene (eutanasi) blev godkendt af i3S Ani...

<ol>
	<li>Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niches+that+regulate+stem+cells+and+hematopoiesis+in+adult+bone+marrow.">Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow.</a> Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).</li><li>Purton, L. E., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays.">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).</li><li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Asada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cytokine+contributions+of+perivascular+haematopoietic+stem+cell+niches.">Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).</li><li>Mosteo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+interface+between+the+bone+marrow+vascular+niche+and+hematopoietic+stem+cells+in+myeloid+malignancy.">The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).</li><li>Christodoulou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+native+haematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).</li><li>Itkin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+bone+marrow+blood+vessels+differentially+regulate+haematopoiesis.">Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis.</a> Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).</li><li>Kusumbe, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+modulation+of+vascular+niches+for+haematopoietic+stem+cells.">Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).</li><li>Duarte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endosteal+vascular+niche+remodeling+rescues+hematopoietic+stem+cell+loss+in+AML.">Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).</li><li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Laurenti, E., Gottgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinct+subsets+of+lineage-biased+multipotent+progenitors+control+blood+production+in+normal+and+regenerative+conditions.">Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li><li>Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+murine+multipotent+progenitor+isolation+scheme:+Establishing+a+consensus+approach+for+multipotent+progenitor+identification.">Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification.</a> Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).</li><li>Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+cells.">Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).</li><li>Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+angiogenesis+and+osteogenesis+by+a+specific+vessel+subtype+in+bone.">Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone.</a> Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).</li><li>Hawkins, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).</li><li>Akinduro, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+dynamics+of+acute+myeloid+leukaemia+and+haematopoietic+progenitors+competing+for+bone+marrow+space.">Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space.</a> Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).</li><li>Beerman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinct+hematopoietic+stem+cells+modulate+hematopoietic+lineage+potential+during+aging+by+a+mechanism+of+clonal+expansion.">Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).</li><li>Gomariz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+spatial+analysis+of+haematopoiesis-regulating+stromal+cells+in+the+bone+marrow+microenvironment+by+3D+microscopy.">Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy.</a> Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+factor+is+selectively+secreted+by+arterial+endothelial+cells+in+bone+marrow.">Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow.</a> Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li><li>DeFalco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-assisted+mapping+of+neural+inputs+to+a+feeding+center+in+the+hypothalamus.">Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus.</a> Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).</li><li>Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+hematopoietic+cells+develop+from+hematopoietic+stem+cells+through+Flk2/Flt3-positive+progenitor+cells.">All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).</li><li>Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hCD2-iCre+and+Vav-iCre+mediated+gene+recombination+patterns+in+murine+hematopoietic+cells.">hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells.</a> PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).</li></ol>

Mens den beskrevne protokol er enkel og nem at udføre, bør der lægges særlig vægt på specifikke trin. For eksempel, når der opnås skyllet BM (trin 5.2), bør volumen eller antal gange, der er angivet for at passere PBS 2% FBS gennem indersiden af den centrale del af knoglen, ikke overskrides, da dette kan resultere i signifikant kontaminering af den skyllede prøve med endosteale cellepopulationer.
Ændringer i protokollen kan foretages for at lette dens udførelse af efterforskeren. V...

Flowcytometri er en uvurderlig metode til at karakterisere og prospektivt isolere immun- og hæmatopoietiske celler. Det bruges også i stigende grad til at analysere stromale og epitelpopulationer af forskellige væv. Den hæmatopoietiske stamcelle (HSC) har unikke egenskaber ved selvfornyelse og multipotens. Hos voksne pattedyr befinder HSC'er sig primært i knoglemarven (BM), hvor de modtager hvile- og overlevelsessignaler fra det omgivende mikromiljø eller niche1. HSC'er defineres formelt i henhold til funktionelle assays2. Ikke desto mindre har flere skelsættende papirer vist nytten af flowcytometri til at identificere HSC'er. Gennem brug af begrænsede celleoverflademarkører er det muligt at skelne hæmatopoietiske populationer, der er højt beriget i HSC'er3. Flowcytometri er derfor en central metode i stamcellefeltet. Det er blevet brugt i vid udstrækning til at evaluere virkningen af formodede nichecelletyper og nichefaktorer på HSC'er. Ved at kombinere flowcytometri med billeddannelse og funktionelle assays har det vist sig, at HSC'er understøttes kritisk af perivaskulære mesenkymale stamceller (MSC'er) og endotelceller (EC'er). BM MSC'er er en heterogen gruppe og har forskellige cytokinbidrag4, men det er veletableret, at leptinreceptor (LepR) + MSC'er er nøglenicheceller1. BM EC'er er også meget heterogene og kan være en del af sinusoider, arterioler og type H / overgangsbeholdere5. Forskellige undersøgelser har vist disse forskellige EC'ers nuancerede bidrag. For eksempel er endosteale sinusformede EC'er rumligt tættere på hvilende HSC'er6, mens ikke-vandrende HSC'er med lavere niveauer af reaktive iltarter er placeret nær arteriolære EC'er7. Den endosteale versus centrale placering af nicher er også meget vigtig. Endosteal type H-kar er forbundet med perivaskulære stromale celler, der går tabt med aldring, hvilket fører til tab af HSC'er8. Ved akut myeloid leukæmi udvides centrale EC'er, mens endosteale kar og endosteale HSC'er går tabt9.
De fleste undersøgelser på området har fokuseret på selve hæmatopoiesen og på cellens ydre regulering af HSC'er. Det er imidlertid i stigende grad blevet anerkendt, at der er behov for bedre at karakterisere de nicher, der regulerer andre forfædre, nemlig multipotente forfædre (MPP'er), især i betragtning af at de er de vigtigste drivkræfter for hæmatopoiesis i steady state10. I modsætning til en fast hierarkisk struktur har nylige undersøgelser vist, at hæmatopoiesis er et kontinuum, hvor HSC'er differentierer sig til forudindtagede MPP'er på et tidligt stadium11. MPP'er er blevet opkaldt efter forskellige klassificeringsordninger12, men et nyligt konsensuspapir fra International Society for Experimental Hematology (ISEH) foreslog, at MPP'er skulle diskrimineres som tidlige MPP'er og i henhold til deres lymfoide (MPP-Ly), megakaryocytiske og erythroid (MPP-Mk / E) og myeloide (MPP-G / M) bias13. Brugen af flowcytometri vil være afgørende for yderligere at studere betydningen af BM-nicher i reguleringen af disse populationer. Nuværende flowcytometrimetoder bruger variable gating-strategier til at differentiere HSPC'er og identificere stromale celler, nemlig EC'er, ved hjælp af inkonsekvente markører. Målet med den nuværende metode er at præsentere en enkel og reproducerbar arbejdsgang for BM-farvning for at identificere HSPC-subpopulationer, heterogene grupper af EC'er og LepR + MSC'er. Vi mener, at denne teknik, selvom den er sammenlignelig med tidligere rapporterede metoder (se for eksempel reference 14), giver en opdateret og let at implementere protokol til fænotypisk analyse af hæmatopoietiske celler i de to funktionelle marvområder, endosteal og central BM 8,15 samt BM stromale nicheceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD3&#949; antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD4 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD8a antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse/human CD11b antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrite 2 Color Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Merck Life Science</td>
			<td>C1889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Merck Life Science</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Leptin R Biotinylated Antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>BAF497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37606</td>
			<td>DAPI reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse endomucin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-5851-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Flk2 (CD135)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-1351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) tablets</td>
			<td>Merck Life Science</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-mouse CD16/32 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer 10x</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Violet Fixable Viability Dye</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423114</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry analysis of murine bone marrow hematopoietic stem and progenitor cells and stromal niche cells

Knoglemarven (BM) er det bløde væv, der findes i knogler, hvor hæmatopoiesis, den proces, hvorved nye blodlegemer genereres, primært forekommer. Som sådan indeholder den hæmatopoietiske stam- og stamceller (HSPC'er) samt understøtter stromale celler, der bidrager til vedligeholdelse og regulering af HSPC'er. Hæmatologiske og andre BM-lidelser forstyrrer hæmatopoiesis ved at påvirke hæmatopoietiske celler direkte og / eller gennem ændring af BM-nichen. Her beskriver vi en metode til at studere hæmatopoiesis i sundhed og malignitet gennem fænotypisk analyse af murine BM HSPC'er og stromale nichepopulationer ved flowcytometri. Vores metode beskriver de nødvendige trin til at berige BM-celler i endosteale og centrale BM-fraktioner samt de passende gating-strategier til at identificere de to nøglenichecelletyper, der er involveret i HSPC-regulering, endotelceller og mesenkymale stamceller. Den fænotypiske analyse, der foreslås her, kan kombineres med musemutanter, sygdomsmodeller og funktionelle assays for at karakterisere HSPC-rummet og dets niche.

Repræsentative plots af flowcytometrianalyse af HSC'er og MPP'er i en sund ung voksen C57Bl/6-mus er vist i figur 1. Gating strategien følger den seneste harmoniseringsnomenklatur foreslået af ISEH13. Når man analyserer virkningen af en forstyrrelse, såsom infektion eller kræft, er det vigtigt at bruge en kontrolmus som reference for normale porte. FMO-kontroller (fluorescens-minus-one) kan være særligt nyttige til at afgrænse grænserne for portene, men det ...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells at JoVE.com

Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells

Her beskriver vi en simpel protokol til isolering og farvning af murinknoglemarvsceller til fænotype hæmopoietiske stam- og stamceller sammen med de understøttende nicheendotel- og mesenkymale stamceller. En metode til at berige celler placeret i endosteale og centrale knoglemarvsområder er også inkluderet.

Flowcytometrianalyse af murinknoglemarv, hæmatopoietisk stam- og stamceller og stromale nicheceller

The bone marrow (BM) is the soft tissue found within bones where hematopoiesis, the process by which new blood cells are generated, primarily occurs. As ...

Den beskrevne protokol muliggør fænotypisk analyse af knoglemarvshæmatopoietiske stam- og stamceller og knoglemarvstromale celler. Det kan bruges til at studere forstyrrelser til disse populationer i forskellige indstillinger. Sammenlignet med andre tidligere beskrevne metoder muliggør denne teknik fænotypisk analyse af hæmatopoietiske celler, specifikt i de to funktionelle marvområder, endosteal og central knoglemarv samt knoglemarvstromale celler.Til at begynde med skal du placere det aflivede dyr med maven op på en petriskål og sprøjte med 70% ethanol. Lav et snit over maven ved hjælp af en saks og træk huden helt væk til anklerne. Grib et af benene og skær i bunden for at adskille det fra dyret ved hjælp af en saks.Fjern derefter foden fra benet ved at skære i anklen og læg benet i iskold PBS 2% FBS. Tag derefter hoftebenet ved hjælp af pincet og skær bag det for at adskille det fra dyret ved hjælp af en saks. Placer hoftebenet i iskold PBS 2% FBS.Efter at have placeret benet og hoftebenet i en petriskål, skal du rengøre knoglerne ved hjælp af en steril skalpel. Derefter adskilles skinneben og lårben ved at skære ved knæet med skalpellen og placere de rene knogler i iskold PBS 2% FBS. Placer lårbenet eller skinnebenet i en mørtel med iskold PBS 2% FBS og knus knoglen ved forsigtigt at trykke den mod mørtelvæggen ved hjælp af støderen.Derefter pipetteres den resulterende cellesuspension op og ned ved hjælp af en 10 ml pipette for at homogenisere og overføre den til et 50 ml rør gennem en 40 mikrometer cellesil placeret oven på røret. Skyl mørtlen med lidt mere PBS 2% FBS og overfør opløsningen til det samme 50 ml rør gennem den samme 40 mikrometer cellesi. Centrifuger 50 ml røret ved 500 G i fem minutter ved fire grader Celsius.Efter kassering af supernatanten resuspenderes cellepelletten i fem ml RBC-lysebuffer ved stuetemperatur ved pipettering op og ned flere gange. Efter to minutters inkubation ved stuetemperatur tilsættes 15 ml PBS 2% FBS og centrifugeres 50 ml-røret. Hvis cellepillen ikke ser rødlig ud, kasseres supernatanten, pelleten resuspenderes i 200 mikroliter PBS 2% FBS og cellesuspensionen overføres til en brønd med en 96-brønds V-bundplade til farvning.Efter at have knust knoglen som tidligere vist, skal du skære spidsen af en P1000-pipette ved hjælp af en saks og bruge den til at overføre alt indholdet af mørtel til et 50 ml rør. Derefter centrifugeres 50 ml røret ved 500 G i fem minutter ved fire grader Celsius. Efter kassering af supernatanten resuspenderes pelletten i tre ml collagenase IV og denne dispase-II-opløsning.Inkuber røret ved 37 grader Celsius i 40 minutter. Fyld røret op til 25 ml med PBS 2% FBS og hvirvel til blanding. Overfør derefter indholdet til et nyt 50 ml rør gennem en 100 mikrometer cellesil.Derefter tilsættes 15 ml PBS 2% FBS til det gamle 50 ml rør og overføres opløsningen til det nye 50 ml rør gennem 100 mikrometer cellesilen. Efter centrifugering og kassering af supernatanten resuspenderes cellepelletten i fem ml RBC-lysisbuffer ved pipettering op og ned flere gange med en pipette. Efter to minutters inkubation ved stuetemperatur tilsættes 15 ml PBS 2% FBS.Centrifuger igen røret, og hvis cellepillen ikke ser rødlig ud efter kassering af supernatanten, resuspenderes pelleten i 200 mikroliter PBS 2% FBS og overføres cellesuspensionen til en brønd med en 96-brønds V-bundplade til farvning. Derefter centrifugeres pladen ved 500 G i tre minutter ved fire grader Celsius. Placer lårbenet på en petriskål og skær enderne af knoglen ved hjælp af en steril skalpel.Skyl derefter den centrale del af knoglen ved at føre 100 mikroliter PBS 2% FBS gennem indersiden af knoglen en gang fra hver side ved hjælp af en 0,5 milliliter insulinsprøjte uden dødt volumen og opsaml opløsningen i et mikrocentrifugerør indeholdende en milliliter PBS 2% FBS. Overfør derefter cellesuspensionen til et 50 ml rør mærket som skyllet knoglemarv indeholdende fire ml PBS 2% FBS. Knus enderne af knoglen i en morter med iskold PBS 2%FBS ved forsigtigt at trykke dem mod mørtelvæggen ved hjælp af støderen.Når cellesuspensionen er homogeniseret, overføres den til et 50 ml rør mærket som knust knoglemarv gennem en 40 mikrometer cellesil. Til sidst skylles mørtlen med lidt mere PBS 2% FBS og overføres opløsningen til det samme rør. Flowcytometrianalyse af hæmatopoietiske stamceller og multipotente stamfædre blev udført i total knoglemarv i en sund ung voksen C57BL6J-mus.I analysen af stromale celler, endotelceller og mesenkymale stamceller i total knoglemarv kan mesenkymale stamceller let identificeres baseret på leptinreceptorekspression, og endotelceller kan identificeres baseret på ekspressionen af CD31 og SCA-1. Flowcytometrianalyse af endotelceller i total knoglemarv, der viser diskriminationen mellem arteriolære og sinusformede endotelceller baseret på ICAM1. Kvantificeringen af arterielle og sinusformede knoglemarvsendototelceller i centralt og endostealt knoglemarvsvæv viser, at arterielle knoglemarvsendototelceller er mere rigelige i endosteale regioner, mens sinusoider er hyppigere i centrale knoglemarvsområder.Ved opnåelse af skyllet knoglemarv bør volumen eller antal gange, der er angivet for at passere PBS 2% FBS gennem indersiden af den centrale del af knoglen, ikke overskrides. Kombination af den beskrevne metode med funktionelle assays af de cellepopulationer, fænotypisk analyseret, ville give yderligere værdifuld information om de potentielle forstyrrelser for disse populationer, der forekommer under de undersøgte forhold. Den beskrevne protokol tillader fænotypisk analyse af hæmatopoietiske celler forskelligt i endosteal og central knoglemarv, hvilket gør det muligt for forskere at undersøge forstyrrelser til hæmatopier, der potentielt forekommer specifikt i disse knoglemarvssteder.

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fænotypisk analyse og isolering af murine hæmatopoietiske stamceller og Lineage-progenitorer

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion og analyse af Epithelial til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Retroviral infektion af murine embryonale stamceller Afledt embryoide kroppens celler til analyse af Hæmatopoietisk Differentiering

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analyse af Cellesuspensioner isoleret fra Solid Væv af Spectral flowcytometri

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...