Name: flow cytometry analysis of murine bone marrow hematopoietic stem and progenitor cells and stromal niche cells
Uploaded: 2022-09-28T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells at JoVE.com

LM wurde durch einen Zuschuss des Lady Tata Memorial Trust unterstützt. JR wurde durch ein Promotionsstipendium der Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT-Stipendium UI/BD/150833/2021). ML wurde durch ein PhD-Stipendium der FCT (FCT-Stipendium 2021.04773.BD) unterstützt. DD wurde durch Zuschüsse der American Society of Hematology, der Pablove Foundation, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) und der Portugiesischen Gesellschaft für Hämatologie unterstützt. Wir danken Dr. Catarina Meireles und Emilia Cardoso von der TRACY-Einrichtung bei i3s für die Unterstützung.

Die Tiere, die in diesem Protokoll verwendet wurden, wurden in der i3S-Tiereinrichtung unter spezifischen, erregerfreien Bedingungen in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und einer temperaturkontrollierten Umgebung untergebracht. Freier Zugang zu Standard-Nagetierfutter und Wasser wurde zur Verfügung gestellt. Alle Tiere wurden nach den Kriterien der Federation of European Laboratory Animal Science Associations für die Pflege und den Umgang mit Versuchstieren (EU-Richtlinie 2010/63/EU) artgerecht versorgt. Das an d...

<ol>
	<li>Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niches+that+regulate+stem+cells+and+hematopoiesis+in+adult+bone+marrow.">Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow.</a> Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).</li><li>Purton, L. E., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays.">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).</li><li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Asada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cytokine+contributions+of+perivascular+haematopoietic+stem+cell+niches.">Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).</li><li>Mosteo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+interface+between+the+bone+marrow+vascular+niche+and+hematopoietic+stem+cells+in+myeloid+malignancy.">The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).</li><li>Christodoulou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+native+haematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).</li><li>Itkin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+bone+marrow+blood+vessels+differentially+regulate+haematopoiesis.">Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis.</a> Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).</li><li>Kusumbe, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+modulation+of+vascular+niches+for+haematopoietic+stem+cells.">Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).</li><li>Duarte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endosteal+vascular+niche+remodeling+rescues+hematopoietic+stem+cell+loss+in+AML.">Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).</li><li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Laurenti, E., Gottgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinct+subsets+of+lineage-biased+multipotent+progenitors+control+blood+production+in+normal+and+regenerative+conditions.">Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li><li>Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+murine+multipotent+progenitor+isolation+scheme:+Establishing+a+consensus+approach+for+multipotent+progenitor+identification.">Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification.</a> Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).</li><li>Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+cells.">Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).</li><li>Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+angiogenesis+and+osteogenesis+by+a+specific+vessel+subtype+in+bone.">Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone.</a> Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).</li><li>Hawkins, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).</li><li>Akinduro, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+dynamics+of+acute+myeloid+leukaemia+and+haematopoietic+progenitors+competing+for+bone+marrow+space.">Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space.</a> Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).</li><li>Beerman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+distinct+hematopoietic+stem+cells+modulate+hematopoietic+lineage+potential+during+aging+by+a+mechanism+of+clonal+expansion.">Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).</li><li>Gomariz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+spatial+analysis+of+haematopoiesis-regulating+stromal+cells+in+the+bone+marrow+microenvironment+by+3D+microscopy.">Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy.</a> Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+factor+is+selectively+secreted+by+arterial+endothelial+cells+in+bone+marrow.">Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow.</a> Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li><li>DeFalco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-assisted+mapping+of+neural+inputs+to+a+feeding+center+in+the+hypothalamus.">Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus.</a> Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).</li><li>Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+hematopoietic+cells+develop+from+hematopoietic+stem+cells+through+Flk2/Flt3-positive+progenitor+cells.">All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).</li><li>Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hCD2-iCre+and+Vav-iCre+mediated+gene+recombination+patterns+in+murine+hematopoietic+cells.">hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells.</a> PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).</li></ol>

Während das beschriebene Protokoll einfach und leicht durchzuführen ist, sollte besonderen Wert auf bestimmte Schritte gelegt werden. Beispielsweise sollte bei der Gewinnung von gespültem BM (Schritt 5.2) das Volumen oder die Anzahl der Male, die angegeben sind, um PBS 2% FBS durch das Innere des zentralen Teils des Knochens zu passieren, nicht überschritten werden, da dies zu einer erheblichen Kontamination der gespülten Probe durch endosteale Zellpopulationen führen kann.
Änderungen a...

Die Durchflusszytometrie ist eine unschätzbare Methode zur Charakterisierung und prospektiven Isolierung von Immun- und hämatopoetischen Zellen. Es wird auch zunehmend zur Analyse von Stroma- und Epithelpopulationen verschiedener Gewebe eingesetzt. Die hämatopoetische Stammzelle (HSC) hat einzigartige Eigenschaften der Selbsterneuerung und Multipotenz. Bei erwachsenen Säugetieren befinden sich HSZ hauptsächlich im Knochenmark (BM), wo sie Ruhe- und Überlebenssignale aus der umgebenden Mikroumgebung oder Nische1 erhalten. HSCs werden formal nach funktionellen Assays2 definiert. Nichtsdestotrotz haben mehrere wegweisende Arbeiten die Nützlichkeit der Durchflusszytometrie zur Identifizierung von HSZ gezeigt. Durch die Verwendung von begrenzten Zelloberflächenmarkern ist es möglich, hämatopoetische Populationen zu unterscheiden, die stark an HSZ angereichert sind3. Die Durchflusszytometrie ist daher eine zentrale Methode im Stammzellbereich. Es wurde ausgiebig verwendet, um den Einfluss von vermeintlichen Nischenzelltypen und Nischenfaktoren auf HSZ zu bewerten. Durch die Kombination von Durchflusszytometrie mit Bildgebung und funktionellen Assays konnte gezeigt werden, dass HSZ entscheidend durch perivaskuläre mesenchymale Stammzellen (MSCs) und Endothelzellen (ECs) unterstützt werden. BM-MSCs sind eine heterogene Gruppe und haben unterschiedliche Zytokinbeiträge4, aber es ist allgemein bekannt, dass Leptinrezeptoren (LepR)+ MSCs wichtige Nischenzellen sind1. BM ECs sind ebenfalls sehr heterogen und können Teil von Sinusoiden, Arteriolen und Typ H/Übergangsgefäßensein 5. Verschiedene Studien haben den nuancierten Beitrag dieser verschiedenen ECs gezeigt. Zum Beispiel befinden sich endosteale sinusoidale ECs räumlich näher an ruhenden HSCs6, während nicht-migratorische HSCs mit geringeren Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies in der Nähe von arteriolären ECs7 lokalisiert sind. Die endosteale versus zentrale Lage von Nischen ist ebenfalls sehr wichtig. Endosteale Typ-H-Gefäße sind mit perivaskulären Stromazellen assoziiert, die mit zunehmendem Alter verloren gehen, was zum Verlust von HSZ führt8. Bei der akuten myeloischen Leukämie sind zentrale ECs erweitert, während endosteale Gefäße und endosteale HSZ verloren gehen9.
Die meisten Studien auf diesem Gebiet haben sich auf die Hämatopoese selbst und auf die extrinsische Regulation von HSZ durch die Zelle konzentriert. Es wurde jedoch zunehmend erkannt, dass es notwendig ist, die Nischen, die andere Vorläuferzellen regulieren, nämlich die multipotenten Vorläuferzellen (MPPs), besser zu charakterisieren, insbesondere wenn man bedenkt, dass sie die Haupttreiber der Hämatopoese im stationären Zustand sind10. Im Gegensatz zu einer festen hierarchischen Struktur haben neuere Studien gezeigt, dass die Hämatopoese ein Kontinuum ist, in dem sich HSZ in einem frühen Stadium zu verzerrten MPPs differenzieren11. MPPs wurden nach verschiedenen Klassifikationsschemata benannt12, aber ein kürzlich veröffentlichtes Konsensuspapier der Internationalen Gesellschaft für experimentelle Hämatologie (ISEH) schlug vor, MPPs als frühe MPPs und nach ihrer lymphoiden (MPP-Ly), megakaryozytären und erythroiden (MPP-Mk/E) und myeloischen (MPP-G/M) Bias zu unterscheiden13. Der Einsatz der Durchflusszytometrie wird entscheidend sein, um die Bedeutung von BM-Nischen für die Regulation dieser Populationen weiter zu untersuchen. Aktuelle Methoden der Durchflusszytometrie verwenden variable Gating-Strategien, um HSPCs zu differenzieren und Stromazellen, nämlich ECs, anhand inkonsistenter Marker zu identifizieren. Das Ziel der aktuellen Methode ist es, einen einfachen und reproduzierbaren Workflow der BM-Färbung zur Identifizierung von HSPC-Subpopulationen, heterogenen Gruppen von ECs und LepR+ MSCs zu präsentieren. Wir glauben, dass diese Technik, obwohl sie mit den zuvor beschriebenen Methoden vergleichbar ist (siehe z.B. Referenz 14), ein aktualisiertes und einfach zu implementierendes Protokoll für die phänotypische Analyse von hämatopoetischen Zellen in den beiden funktionellen Knochenmarkbereichen, endosteal und zentralem BM 8,15, sowie von BM-Stromanischenzellen bietet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Streptavidin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD3&#949; antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD4 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse CD8a antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse/human CD11b antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrite 2 Color Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Merck Life Science</td>
			<td>C1889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Merck Life Science</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Leptin R Biotinylated Antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>BAF497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37606</td>
			<td>DAPI reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse endomucin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-5851-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Flk2 (CD135)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-1351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) tablets</td>
			<td>Merck Life Science</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-mouse CD16/32 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer 10x</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Violet Fixable Viability Dye</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423114</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry analysis of murine bone marrow hematopoietic stem and progenitor cells and stromal niche cells

Das Knochenmark (BM) ist das Weichgewebe in den Knochen, in dem hauptsächlich die Hämatopoese stattfindet, der Prozess, durch den neue Blutzellen gebildet werden. Als solches enthält es hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) sowie unterstützende Stromazellen, die zur Aufrechterhaltung und Regulierung von HSPCs beitragen. Hämatologische und andere BM-Erkrankungen stören die Hämatopoese, indem sie hämatopoetische Zellen direkt und/oder durch die Veränderung der BM-Nische betreffen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Untersuchung der Hämatopoese in Gesundheit und Malignität durch die phänotypische Analyse von murinen BM-HSPCs und stromalen Nischenpopulationen mittels Durchflusszytometrie. Unsere Methode beschreibt die erforderlichen Schritte zur Anreicherung von BM-Zellen in endostealen und zentralen BM-Fraktionen sowie die geeigneten Gating-Strategien zur Identifizierung der beiden wichtigsten Nischenzelltypen, die an der HSPC-Regulation beteiligt sind, Endothelzellen und mesenchymale Stammzellen. Die hier vorgeschlagene phänotypische Analyse kann mit Mausmutanten, Krankheitsmodellen und funktionellen Assays kombiniert werden, um das HSPC-Kompartiment und seine Nische zu charakterisieren.

Repräsentative Diagramme der durchflusszytometrischen Analyse von HSCs und MPPs in einer gesunden C57Bl/6-Maus eines jungen Erwachsenen sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Gating-Strategie folgt der neuesten harmonisierenden Nomenklatur, die von der ISEH13 vorgeschlagen wurde. Bei der Analyse der Auswirkungen einer Störung, wie z. B. einer Infektion oder einer Krebserkrankung, ist es wichtig, eine Kontrollmaus als Referenz für normale Gates zu verwenden. Fluoresze...

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Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells

In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Färbung von murinen Knochenmarkzellen zum Phänotyp hämopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen zusammen mit den unterstützenden endothelialen und mesenchymalen Stammzellen der Nische. Eine Methode zur Anreicherung von Zellen, die sich im endostealen und zentralen Knochenmarkbereich befinden, ist ebenfalls enthalten.

Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen

The bone marrow (BM) is the soft tissue found within bones where hematopoiesis, the process by which new blood cells are generated, primarily occurs. As ...

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die phänotypische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des Knochenmarks sowie von Knochenmarkstromazellen. Es kann verwendet werden, um Störungen dieser Populationen in verschiedenen Umgebungen zu untersuchen. Im Vergleich zu anderen bisher beschriebenen Methoden ermöglicht diese Technik die phänotypische Analyse von hämatopoetischen Zellen, insbesondere in den beiden funktionellen Markbereichen, endostealem und zentralem Knochenmark, sowie Knochenmarkstromazellen.Legen Sie das eingeschläferte Tier zunächst mit dem Bauch nach oben auf eine Petrischale und besprühen Sie es mit 70%igem Ethanol. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt über dem Bauch und ziehen Sie die Haut bis zu den Knöcheln weg. Greifen Sie eines der Beine und schneiden Sie es unten ab, um es mit einer Schere vom Tier zu trennen.Entfernen Sie dann den Fuß vom Bein, indem Sie am Knöchel schneiden, und legen Sie das Bein in eiskaltes PBS 2%FBS. Als nächstes greifst du den Hüftknochen mit einer Pinzette und schneidest ihn mit einer Schere dahinter, um ihn vom Tier zu trennen. Legen Sie den Hüftknochen in eiskaltes PBS 2%FBS.Nachdem Sie das Bein und den Hüftknochen in eine Petrischale gelegt haben, reinigen Sie die Knochen mit einem sterilen Skalpell. Trennen Sie dann Schien- und Oberschenkelknochen, indem Sie mit dem Skalpell am Knie schneiden und die sauberen Knochen in eiskaltes PBS 2%FBS legen. Legen Sie den Oberschenkelknochen oder das Schienbein in einen Mörser mit eiskaltem PBS 2%FBS und zerdrücken Sie den Knochen, indem Sie ihn mit dem Stößel vorsichtig gegen die Wand des Mörsers drücken.Als nächstes pipettieren Sie die resultierende Zellsuspension mit einer 10-Milliliter-Pipette auf und ab, um sie zu homogenisieren und durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb, das auf das Röhrchen gelegt wird, in ein 50-Milliliter-Röhrchen zu überführen. Spülen Sie den Mörtel mit etwas mehr PBS 2%FBS ab und füllen Sie die Lösung in dasselbe 50-Milliliter-Röhrchen durch dasselbe 40-Mikrometer-Zellensieb. Zentrifugieren Sie das 50-Milliliter-Röhrchen bei 500 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.Nach dem Verwerfen des Überstandes wird das Zellpellet in fünf Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer bei Raumtemperatur durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Nach einer zweiminütigen Inkubation bei Raumtemperatur werden 15 Milliliter PBS 2%FBS hinzugefügt und das 50-Milliliter-Röhrchen zentrifugiert. Wenn das Zellpellet nicht rötlich aussieht, entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern PBS 2%FBS und übertragen Sie die Zellsuspension zur Färbung in eine Vertiefung einer 96-Well-V-Bodenplatte.Nachdem Sie den Knochen wie zuvor gezeigt zerkleinert haben, schneiden Sie die Spitze einer P1000-Pipette mit einer Schere ab und füllen Sie damit den gesamten Inhalt des Mörtels in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Anschließend wird das 50-Milliliter-Röhrchen bei 500 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter Kollagenase IV und dieser Dispase-II-Lösung.Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius für 40 Minuten. Füllen Sie das Röhrchen auf 25 Milliliter mit PBS 2%FBS auf und wirbeln Sie es aus. Anschließend wird der Inhalt durch ein 100-Mikrometer-Zellensieb in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen umgefüllt.Geben Sie dann 15 Milliliter PBS 2%FBS in das alte 50-Milliliter-Röhrchen und überführen Sie die Lösung durch das 100-Mikrometer-Zellensieb in das neue 50-Milliliter-Röhrchen. Nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstandes wird das Zellpellet in fünf Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer resuspendiert, indem man mit einer Pipette mehrmals auf und ab pipettiert. Nach der zweiminütigen Inkubation bei Raumtemperatur 15 Milliliter PBS 2%FBS zugeben.Zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut, und wenn das Zellpellet nach dem Verwerfen des Überstandes nicht rötlich aussieht, resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern PBS 2%FBS und übertragen Sie die Zellsuspension zur Färbung in eine Vertiefung einer 96-Well-V-Bodenplatte. Anschließend wird die Platte bei 500 G drei Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Legen Sie den Oberschenkelknochen auf eine Petrischale und schneiden Sie die Knochenenden mit einem sterilen Skalpell ab.Spülen Sie dann den zentralen Teil des Knochens, indem Sie 100 Mikroliter PBS 2%FBS einmal von jeder Seite mit einer 0,5-Milliliter-Insulinspritze ohne Totvolumen durch das Innere des Knochens führen und die Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter PBS 2%FBS auffangen. Anschließend wird die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt, das als gespültes Knochenmark bezeichnet wird und vier Milliliter PBS 2%FBS enthält. Zerstoßen Sie die Enden des Knochens in einem Mörser mit eiskaltem PBS 2%FBS, indem Sie sie mit dem Stößel vorsichtig gegen die Wand des Mörsers drücken.Sobald die Zellsuspension homogenisiert ist, wird sie durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt, das als zerkleinertes Knochenmark gekennzeichnet ist. Zum Schluss spülen Sie den Mörtel mit etwas mehr PBS 2%FBS aus und geben Sie die Lösung in dasselbe Röhrchen. Die Durchflusszytometrie von hämatopoetischen Stammzellen und multipotenten Vorläuferzellen wurde im gesamten Knochenmark einer gesunden jungen erwachsenen C57BL6J-Maus durchgeführt.Bei der Analyse von Stromazellen, Endothelzellen und mesenchymalen Stammzellen im gesamten Knochenmark können mesenchymale Stammzellen anhand der Leptinrezeptorexpression und Endothelzellen anhand der Expression von CD31 und SCA-1 identifiziert werden. Durchflusszytometrische Analyse von Endothelzellen im Gesamtknochenmark zeigt die Unterscheidung zwischen arteriolären und sinusoidalen Endothelzellen auf der Grundlage von ICAM1. Die Quantifizierung von arteriellen und sinusoidalen Knochenmarkendothelzellen im zentralen und endostealen Knochenmarkgewebe zeigt, dass arterielle Knochenmarkendothelzellen häufiger in endostealen Regionen vorkommen, während Sinusoide häufiger in zentralen Knochenmarkbereichen vorkommen.Bei der Entnahme von gespültem Knochenmark sollte das Volumen oder die Anzahl der Male, die für die Verabreichung von PBS 2%FBS durch das Innere des zentralen Teils des Knochens angegeben sind, nicht überschritten werden. Die Kombination der beschriebenen Methode mit funktionellen Assays der phänotypisch analysierten Zellpopulationen würde weitere wertvolle Informationen über die möglichen Störungen dieser Populationen liefern, die unter den untersuchten Bedingungen auftreten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die phänotypische Analyse von hämatopoetischen Zellen im endostealen und zentralen Knochenmark, so dass die Forscher Störungen der Hämatopie untersuchen können, die möglicherweise spezifisch in diesen Knochenmarkslokalisationen auftreten.

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Forschung

Biologie

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

Isolierung von Anfang hämatopoetischen Stammzellen aus Murine Dottersack und AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing von hämatopoetischen Zellen im Knochenmark

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...