Name: isolation and characterization of the natural microbiota of the model nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-08-17T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Vi anerkender økonomisk støtte fra den tyske videnskabsfond (projekt A1.1 og A1.2 fra Collaborative Research Center 1182 om metaorganismers oprindelse og funktion). Vi takker medlemmerne af Schulenburg-laboratoriet for deres råd og støtte.

1. Forberedelse af buffere og medier
<ol><li>Forbered S-buffer ved at tilsætte 5,85 g NaCl, 1,123 g K 2 HPO 4,5,926 g KH2PO4 og 1 liter deioniseret H2O, til en kolbe og autoklave i 20 minutter ved 121 °C.</li>
	<li>Forbered et tyktflydende medium ved at tilsætte S-buffer indeholdende 1,2% (w / v) hydroxymethylcellulose (stoffet, der forårsager viskositet af mediet), 5 mg / ml kolesterol, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2 og 0,1% (v /...

<ol>
	<li>Schulenburg, H., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+biotic+environment+of+Caenorhabditis+elegans.">The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).</li><li>Petersen, C., Dirksen, P., Prahl, S., Strathmann, E. A., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+Caenorhabditis+elegans+across+1.5+years+in+selected+North+German+locations:+the+importance+of+substrate+type,+abiotic+parameters,+and+Caenorhabditis+competitors.">The prevalence of Caenorhabditis elegans across 1.5 years in selected North German locations: the importance of substrate type, abiotic parameters, and Caenorhabditis competitors.</a> BMC Ecology. 14 (1), 4 (2014).</li><li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Travelling+at+a+slug's+pace:+possible+invertebrate+vectors+of+Caenorhabditis+nematodes.">Travelling at a slug's pace: possible invertebrate vectors of Caenorhabditis nematodes.</a> BMC Ecology. 15 (1), 19 (2015).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+assembly+of+the+native+C.+elegans+microbiome+is+influenced+by+time,+substrate+and+individual+bacterial+taxa.">Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate and individual bacterial taxa.</a> Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+repertoire+contained+within+the+native+microbiota+of+the+model+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans.</a> The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2019).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+effects+of+C.+elegans+protective+natural+microbiota+on+host+physiology.">Exploring effects of C. elegans protective natural microbiota on host physiology.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 775728 (2022).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Watson, E., MacNeil, L. T., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+metabolic+and+gene+regulatory+networks+modulates+the+C.+elegans+dietary+response.">Integration of metabolic and gene regulatory networks modulates the C. elegans dietary response.</a> Cell. 153 (1), 253-266 (2013).</li><li>Watson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+systems+biology+uncovers+metabolites+affecting+C.+elegans+gene+expression+and+life+history+traits.">Interspecies systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits.</a> Cell. 156 (4), 759-770 (2014).</li><li>MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+developmental+acceleration+independent+of+TOR+and+insulin+in+C.+elegans.">Diet-induced developmental acceleration independent of TOR and insulin in C. elegans.</a> Cell. 153 (1), 240-252 (2013).</li><li>O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. -. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurotransmitter+produced+by+gut+bacteria+modulates+host+sensory+behaviour.">A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour.</a> Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).</li><li>Snoek, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-parent+recombinant+inbred+line+population+of+C.+elegans+allows+identification+of+novel+QTLs+for+complex+life+history+traits.">A multi-parent recombinant inbred line population of C. elegans allows identification of novel QTLs for complex life history traits.</a> BMC Biology. 17 (1), 24 (2019).</li><li>Avery, L., Shtonda, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+transport+in+the+C.+elegans+pharynx.">Food transport in the C. elegans pharynx.</a> Journal of Experimental Biology. 206 (14), 2441-2457 (2003).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+delicate+balance+between+bacterial+iron+and+reactive+oxygen+species+supports+optimal+C.+elegans+development.">A delicate balance between bacterial iron and reactive oxygen species supports optimal C. elegans development.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (3), 400-411 (2019).</li><li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+life+in+compost:+temporal+and+spatial+variation+of+North+German+Caenorhabditis+elegans+populations.">Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations.</a> Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).</li><li>F&#233;lix, M. -. A., Duveau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+and+habitat+sharing+of+natural+populations+of+Caenorhabditis+elegans+and+C.+briggsae.">Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae.</a> BMC Biology. 10 (1), 59 (2012).</li><li>Barri&#232;re, A., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+and+linkage+disequilibrium+in+natural+Caenorhabditis+elegans+populations.">Temporal dynamics and linkage disequilibrium in natural Caenorhabditis elegans populations.</a> Genetics. 176 (2), 999-1011 (2007).</li><li>Dolgin, E. S., F&#233;lix, M. -. A., Cutter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hakuna+Nematoda:+genetic+and+phenotypic+diversity+in+African+isolates+of+Caenorhabditis+elegans+and+C.+briggsae.">Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae.</a> Heredity. 100 (3), 304-315 (2008).</li><li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+animal+models+for+microbiome+research.">Simple animal models for microbiome research.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 764-775 (2019).</li><li>Barri&#232;re, A., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+C.+elegans+and+related+nematodes.">Isolation of C. elegans and related nematodes.</a> WormBook. , 1-19 (2014).</li><li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study.">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+adaptation+and+spatiotemporal+patterns+of+genetic+diversity+revealed+by+repeated+sampling+of+Caenorhabditis+elegans+across+the+Hawaiian+Islands.">Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands.</a> Molecular Ecology. 31 (8), 2327-2347 (2022).</li><li>Haber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+history+of+Caenorhabditis+elegans+inferred+from+microsatellites:+Evidence+for+spatial+and+temporal+genetic+differentiation+and+the+occurrence+of+outbreeding.">Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: Evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding.</a> Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2004).</li><li>Watson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+network+rewiring+of+propionate+flux+compensates+vitamin+B12+deficiency+in+C.+elegans.">Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans.</a> eLife. 5, 17670 (2016).</li></ol>

Nematoden Caenorhabditis elegans er en af de mest intensivt studerede modelorganismer inden for biologisk forskning. Det blev introduceret af Sydney Brenner i 1960'erne, oprindeligt for at forstå nervesystemets udvikling og funktion29. Siden da er C. elegans blevet en stærk model til at studere grundlæggende processer på tværs af alle biologiske discipliner, herunder adfærdsbiologi, neurobiologi, aldring, evolutionær biologi, cellebiologi, udviklingsbiologi og immunologi. ...

I naturen findes C. elegans almindeligvis i rådne plantestoffer, især rådne frugter som æbler eller på kompostbunker1. Det er også forbundet med visse hvirvelløse værter såsom snegle og træløg 2,3. Disse levesteder er rige på mikrober, som ikke kun tjener som mad til ormen, men kan også danne stabile foreninger med den. Oplysninger om mangfoldigheden af naturligt associerede mikroorganismer blev først offentliggjort i 2016 4,5,6. Siden da har disse og kun få nyere undersøgelser afsløret, at C. elegans er forbundet med en række bakterier og svampe, oftest inklusive bakterier af slægten Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter og flere andre 6,7,8. Flere tilknyttede bakterier kan stabilt kolonisere ormens tarm, men ikke alle 6,9,10,11,12. De vil sandsynligvis være af afgørende betydning for vores forståelse af C. elegans biologi, fordi de kan give ernæring, beskytte mod patogener og muligvis andre stressfaktorer og påvirke centrale livshistorietræk såsom reproduktionshastighed, udvikling eller adfærdsmæssige reaktioner.
Som et eksempel kan naturligt associerede isolater af slægterne Pseudomonas, Ochrobactrum og også Enterobacter eller Gluconobacter beskytte ormen mod patogeninfektion og dræbe på forskellige måder 5,6,11,13,14. Et specifikt isolat af slægten Comamonas påvirker nematode kostrespons, udvikling, levetid og fertilitet15,16,17. Providencia-bakterier producerer neuromodulatoren tyramin og modulerer derved værtsnervesystemets aktivitet og deraf følgende adfærdsmæssige reaktioner18. Et sæt forskellige naturligt associerede bakterier viste sig at påvirke befolkningstilvækst, fertilitet og adfærdsmæssige reaktioner 5,6,9,11,19.
Til dato er den nøjagtige mangfoldighed og konsistens af den indfødte C. elegans mikrobiota på tværs af levesteder og geografiske placeringer ikke fuldt ud forstået, og yderligere sammenhænge mellem ormen og mikrober fra dens miljø mangler stadig at blive afdækket. Flere tidligere undersøgelser anvendte bakteriestammer isoleret fra noget jordmiljø, naturlige C. elegans levesteder eller fra mesokosmoseksperimenter (dvs. laboratoriebaserede miljøer, der genskaber naturlige levesteder) med C. elegans laboratoriestammer 4,5,20. Selvom disse undersøgelser opnåede ny indsigt i mikrobernes indflydelse på specifikke nematodeegenskaber (f.eks. Nematodemetabolisme21), er relevansen af disse interaktioner for C. elegans biologi i naturen uklar. Derfor beskriver dette manuskript metoderne til direkte at isolere C. elegans fra naturen og til at isolere og efterfølgende karakterisere de naturligt associerede mikrober fra både enkelte orme og grupper af orme. De beskrevne metoder er en opdateret og forbedret version af de procedurer, der tidligere blev anvendt til isolering og karakterisering af naturlige C. elegans og dets oprindelige mikrobiota 2,6,7. I betragtning af at C. elegans i vid udstrækning findes i nedbrydning af plantemateriale over hele kloden (især i rådne frugter, tempererede regioner og om efteråret)1,2,22,23,24,25, kan denne protokol anvendes af ethvert laboratorium, når der er interesse for at relatere C. elegans træk til naturligt associerede mikrober og dermed en mere naturligt relevant kontekst. Sidstnævnte er afgørende for en fuld forståelse af nematodens biologi, fordi det er kendt fra en mangfoldighed af andre værtssystemer, at den tilknyttede mikrobiota kan påvirke forskellige livshistoriekarakteristika26, et aspekt, der i øjeblikket stort set overses i de mange C. elegans-undersøgelser på tværs af næsten alle biovidenskabelige discipliner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>COMSOL</td>
			<td>COMSOL</td>
			<td></td>
			<td>multiphysics simulation software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of the natural microbiota of the model nematode caenorhabditis elegans

Nematoden Caenorhabditis elegans interagerer med en stor mangfoldighed af mikroorganismer i naturen. Generelt findes C. elegans almindeligvis i rådne plantestoffer, især rådne frugter som æbler eller på kompostbunker. Det er også forbundet med visse hvirvelløse værter såsom snegle og træløg. Disse levesteder er rige på mikrober, der tjener som mad til C. elegans , og som også vedvarende kan kolonisere nematodetarmen. Til dato er den nøjagtige mangfoldighed og konsistens af den indfødte C. elegans mikrobiota på tværs af levesteder og geografiske placeringer ikke fuldt ud forstået. Her beskriver vi en passende tilgang til isolering af C. elegans fra naturen og karakterisering af ormens mikrobiota. Nematoder kan let isoleres fra kompostmateriale, rådne æbler, snegle eller tiltrækkes ved at placere æbler på kompostbunker. Den bedste tid til at finde C. elegans på den nordlige halvkugle er fra september til november. Orme kan vaskes ud af opsamlet substratmateriale ved at nedsænke substratet i bufferopløsning efterfulgt af opsamling af nematoder og deres overførsel til nematodevækstmedium eller PCR-buffer til efterfølgende analyse. Vi illustrerer yderligere, hvordan prøverne kan bruges til at isolere og rense de ormassocierede mikroorganismer og til at behandle orme til 16S ribosomal RNA-analyse af mikrobiota-samfundssammensætning. Samlet set kan de beskrevne metoder stimulere ny forskning i karakteriseringen af C. elegans mikrobiota på tværs af levesteder og geografiske placeringer og derved bidrage til at opnå en omfattende forståelse af mangfoldigheden og stabiliteten af nematodens mikrobiota som grundlag for fremtidig funktionel forskning.

Nematoden C. elegans findes ofte i nedbrydende frugter, såsom æbler, og også kompostprøver. I Nordtyskland findes C. elegans såvel som congeneriske arter (især C. remanei, men også C. briggsae) hovedsageligt fra september til2. november. Nematoderne findes oftest i nedbrydende plantemateriale, især rådne frugter som æbler eller pærer, og også kompost, især materiale, der viser en høj nedbrydningskvalitet. Frugt- og kompostprøverne kan tages ind i ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans er en af de vigtigste modelarter inden for biologi, men næsten al forskning udføres i mangel af dets naturligt associerede mikrober. De metoder, der er beskrevet her, vil bidrage til at forbedre vores forståelse af mangfoldigheden af tilknyttede mikrober som grundlag for fremtidig funktionel C. elegans-forskning.

Isolering og karakterisering af den naturlige mikrobiota af modellen Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Denne protokol giver ny indsigt i C.elegans naturlige mikrobiota. Samtidig kan de isolerede mikrober bruges i kontrollerede laboratorieforsøg til at karakterisere mikrobiota-værtsinteraktioner og C.elegans biologi. Denne protokol fokuserer på at isolere mikrober forbundet med C.elegans i naturen, som derfor er nøglen til at forstå biologien hos denne vigtige modelvært i en mere naturlig sammenhæng.Det vil være nyttigt at være bekendt med udseendet af Caenorhabditis sammenlignet med andre nematoder. Pipettering under dissekeringsomfanget kan i første omgang være udfordrende, men øvelse vil være nyttig. Begynd med at indsamle miljøprøverne som kompost eller rådne frugter i separate plastposer, rør eller rene beholdere.Jævnt fordelt stykkerne af de indsamlede miljøprøver i en steril ni centimeter tom petriskål og tilsæt ca. 20 ml sterilt tyktflydende medium for at dække prøven med mediet. Under dissekeringsmikroskopet skal du søge efter Caenorhabditis nematoder efter retningslinjerne for isolering af Caenorhabditis elegans og relaterede nematoder. Ved hjælp af en 20 til 100 mikroliter pipette opsamles den mindst mulige mængde væske indeholdende Caenorhabditis nematoder fra pladen og overfører den til den tre centimeter petriskål, der indeholder en til tre milliliter steril M9T.For at etablere en ormpopulation kan de enkelte orme overføres til en plade med et nematodevækstmedium eller NGM. For at vaske nematoderne og fjerne mikroberne uden for nematoderne, inkuberes dem i M9T i 10 til 15 minutter. Pipetter den mindst mulige mængde væske, der indeholder nematoderne, og overfør den til en ny steril tre centimeter petriskål indeholdende en til tre milliliter frisk M9T.For upartisk identifikation af nematodeassocierede mikrober fremstilles en 96 brøndplade med ca. tre sterile perler med en millimeter diameter og tilsættes en blanding af 19,5 mikroliter PCR-buffer og 0,5 mikroliter proteinase K pr. Brønd. Overfør en enkelt vasket nematode til hver brønd med så lidt væske som muligt. Opbryd de overførte nematoder ved hjælp af en perlehomogenisator i tre minutter ved 30 hertz og centrifuge pladerne eller rørene ved 8.000 G i 10 sekunder ved stuetemperatur for at få væsken til bunden.For at identificere C.elegans opvarmes prøverne i en PCR-cyklist i en time ved 50 grader Celsius og 15 minutter ved 95 grader Celsius for at isolere DNA fra individuelle nematoder eller bruge kommercielle kits til at isolere DNA fra ormepopulationer. Frys det isolerede DNA ved minus 20 grader Celsius til langtidsopbevaring. Brug DNA'et og primerparret NLP 30 fremad og NLP 30 omvendt og fremstil et 154 basispar PCR-produkt.For at isolere bakterierne skal du forberede en 96-brøndplade med cirka tre sterile perler på en millimeter, 20 mikroliter M9-buffer pr. Brønd og pipettere en enkelt vasket nematode til hver brønd med så lidt væske som muligt. Bryd nematoderne op som demonstreret før du bruger en perlehomogenisator, efterfulgt af kort centrifugering af pladen for at få væsken til bunden. Når du er færdig, skal du samle suspensionen og fortynde den serielt i et til 10 forhold.Plade op til 100 mikroliter af den fortyndede suspension på ni centimeter agarplader. Derefter inkuberes pladerne ved 15 til 20 grader Celsius i 24 til 48 timer. For at opnå den rene bakteriekultur skal du vælge en enkelt koloni fra den inkuberede plade ved hjælp af en steril løkke eller tandstikker og stribe den på en ny agarplade, der indeholder det samme agarmedium, der blev brugt under rensningen.Sørg for kun at bruge 1/3 af pladen. Steriliser derefter en genanvendelig løkke, eller brug en ny steril løkke, og træk den gennem den første stribe for at skabe en anden stribe på en anden 1/3 del af prøvepladen. Gentag det ved at trække en løkke gennem den anden stribe og skabe den tredje stribe for at opnå den enkelte kolonivækst.Inkuber pladen under de samme vækstbetingelser, der anvendes til isolering, og gentag om nødvendigt rensningstrinningen. Dyrk de rene kolonier i et flydende medium ved hjælp af de samme temperatur- og vækstbetingelser. Derefter karakteriseres bakterierne ved at ekstrahere bakterie-DNA'et fra rene væskekulturer, der forstærker det 16S ribosomale RNA ved hjælp af 27 fremadgående og 1495 omvendte primere og udfører PCR som beskrevet i teksten.Når de indsamlede frugt- og kompostprøver blev fordelt i petriskåle og nedsænket i et flydende eller tyktflydende medium, resulterede det i, at ormene forlod substratmaterialet og svømmede til mediets overflade. Mikroberne blev isoleret som rene enkeltkolonier, og rensningen spillede en væsentlig rolle, da nogle C.elegans-associerede bakterier kan danne biofilm eller let aggregere, hvilket resulterer i kulturer med flere arter. PCR ved hjælp af C.elegans specifikke primere, nemlig NLP 30 fremad og NLP 30 omvendt, resulterede i forstærkning af et 154 basisparprodukt til C.elegans.DNA'et isoleret fra enkelte orme resulterede i svage PCR-bånd, mens DNA-ekstraktion fra ormepopulationerne bestående af mindst 50 orme gav en større mængde og klarere bånd. Succesen med C.elegans specifikke PCR blev bekræftet ved at køre DNA fra en laboratoriestamme, nemlig N2 som en positiv kontrol samtidig med DNA'et fra de isolerede nematoder Mikrober er overalt. Derfor er det vigtigt at arbejde under sterile forhold for at sikre, at de mikrober, der er isoleret, virkelig er forbundet med ormen i naturen.De isolerede mikrober kan bruges til at studere værtsmikrobiota-interaktioner eller mikrobernes rolle på værtsbiologi, for eksempel aldring, udvikling eller immunitet i kontrollerede laboratorieforsøg. Mikrober isoleret med denne teknik bruges i øjeblikket af C.elegans-samfundet til at forbedre forståelsen af mikrobiota-mangfoldighed på værtsfitness eller mikrobernes rolle på immunitet.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grundlæggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Brug af RNA-medieret Interferens fodringsstrategien at screene for gener involveret i Body Size forordning i Nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Indsamling, Isolering og berigelse af naturligt forekommende Magnetotactic Bakterier fra Miljø

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

dyrkning af<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensioner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Brug caenorhabditis elegans til skærmen for vævsspecifikke chaperone interaktioner

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...