Name: isolation and characterization of the natural microbiota of the model nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-08-17T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

אנו מכירים בתמיכה כספית מקרן המדע הגרמנית (פרויקטים A1.1 ו- A1.2 של מרכז המחקר השיתופי 1182 על מקורם ותפקודם של מטאאורגניזמים). אנו מודים לחברי מעבדת שולנבורג על עצתם ותמיכתם.

1. הכנת מאגרים ומדיה
<ol><li>הכן את מאגר ה-S על-ידי הוספת 5.85 גרם של NaCl, 1.123 גרם של K 2 HPO 4, 5.926 גרם של KH 2 PO4, ו-1 L של H2O שעבר דה-יוניזציה לבקבוקון ואוטוקלאב למשך 20 דקות ב-121 °C.</li>
	<li>הכינו מדיום צמיג על ידי הוספת S-buffer המכיל 1.2% (w/v) הידרוקסימתיל צלולוז (החומר הגורם לצמ?...

<ol>
	<li>Schulenburg, H., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+biotic+environment+of+Caenorhabditis+elegans.">The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).</li><li>Petersen, C., Dirksen, P., Prahl, S., Strathmann, E. A., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+Caenorhabditis+elegans+across+1.5+years+in+selected+North+German+locations:+the+importance+of+substrate+type,+abiotic+parameters,+and+Caenorhabditis+competitors.">The prevalence of Caenorhabditis elegans across 1.5 years in selected North German locations: the importance of substrate type, abiotic parameters, and Caenorhabditis competitors.</a> BMC Ecology. 14 (1), 4 (2014).</li><li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Travelling+at+a+slug's+pace:+possible+invertebrate+vectors+of+Caenorhabditis+nematodes.">Travelling at a slug's pace: possible invertebrate vectors of Caenorhabditis nematodes.</a> BMC Ecology. 15 (1), 19 (2015).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+assembly+of+the+native+C.+elegans+microbiome+is+influenced+by+time,+substrate+and+individual+bacterial+taxa.">Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate and individual bacterial taxa.</a> Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+repertoire+contained+within+the+native+microbiota+of+the+model+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans.</a> The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2019).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+effects+of+C.+elegans+protective+natural+microbiota+on+host+physiology.">Exploring effects of C. elegans protective natural microbiota on host physiology.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 775728 (2022).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Watson, E., MacNeil, L. T., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+metabolic+and+gene+regulatory+networks+modulates+the+C.+elegans+dietary+response.">Integration of metabolic and gene regulatory networks modulates the C. elegans dietary response.</a> Cell. 153 (1), 253-266 (2013).</li><li>Watson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+systems+biology+uncovers+metabolites+affecting+C.+elegans+gene+expression+and+life+history+traits.">Interspecies systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits.</a> Cell. 156 (4), 759-770 (2014).</li><li>MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+developmental+acceleration+independent+of+TOR+and+insulin+in+C.+elegans.">Diet-induced developmental acceleration independent of TOR and insulin in C. elegans.</a> Cell. 153 (1), 240-252 (2013).</li><li>O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. -. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurotransmitter+produced+by+gut+bacteria+modulates+host+sensory+behaviour.">A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour.</a> Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).</li><li>Snoek, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-parent+recombinant+inbred+line+population+of+C.+elegans+allows+identification+of+novel+QTLs+for+complex+life+history+traits.">A multi-parent recombinant inbred line population of C. elegans allows identification of novel QTLs for complex life history traits.</a> BMC Biology. 17 (1), 24 (2019).</li><li>Avery, L., Shtonda, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+transport+in+the+C.+elegans+pharynx.">Food transport in the C. elegans pharynx.</a> Journal of Experimental Biology. 206 (14), 2441-2457 (2003).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+delicate+balance+between+bacterial+iron+and+reactive+oxygen+species+supports+optimal+C.+elegans+development.">A delicate balance between bacterial iron and reactive oxygen species supports optimal C. elegans development.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (3), 400-411 (2019).</li><li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+life+in+compost:+temporal+and+spatial+variation+of+North+German+Caenorhabditis+elegans+populations.">Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations.</a> Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).</li><li>F&#233;lix, M. -. A., Duveau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+and+habitat+sharing+of+natural+populations+of+Caenorhabditis+elegans+and+C.+briggsae.">Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae.</a> BMC Biology. 10 (1), 59 (2012).</li><li>Barri&#232;re, A., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+and+linkage+disequilibrium+in+natural+Caenorhabditis+elegans+populations.">Temporal dynamics and linkage disequilibrium in natural Caenorhabditis elegans populations.</a> Genetics. 176 (2), 999-1011 (2007).</li><li>Dolgin, E. S., F&#233;lix, M. -. A., Cutter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hakuna+Nematoda:+genetic+and+phenotypic+diversity+in+African+isolates+of+Caenorhabditis+elegans+and+C.+briggsae.">Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae.</a> Heredity. 100 (3), 304-315 (2008).</li><li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+animal+models+for+microbiome+research.">Simple animal models for microbiome research.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 764-775 (2019).</li><li>Barri&#232;re, A., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+C.+elegans+and+related+nematodes.">Isolation of C. elegans and related nematodes.</a> WormBook. , 1-19 (2014).</li><li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study.">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+adaptation+and+spatiotemporal+patterns+of+genetic+diversity+revealed+by+repeated+sampling+of+Caenorhabditis+elegans+across+the+Hawaiian+Islands.">Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands.</a> Molecular Ecology. 31 (8), 2327-2347 (2022).</li><li>Haber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+history+of+Caenorhabditis+elegans+inferred+from+microsatellites:+Evidence+for+spatial+and+temporal+genetic+differentiation+and+the+occurrence+of+outbreeding.">Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: Evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding.</a> Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2004).</li><li>Watson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+network+rewiring+of+propionate+flux+compensates+vitamin+B12+deficiency+in+C.+elegans.">Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans.</a> eLife. 5, 17670 (2016).</li></ol>

הנמטודה Caenorhabditis elegans היא אחד מאורגניזמי המודל הנחקרים ביותר במחקר ביולוגי. הוא הוצג על ידי סידני ברנר בשנות ה -60, במקור להבנת ההתפתחות והתפקוד של מערכת העצבים29. מאז, C. elegans הפך למודל רב עוצמה לחקר תהליכים בסיסיים בכל הדיסציפלינות הביולוגיות, כולל ביולוגיה התנהגותית, נ...

בטבע, C. elegans נמצא בדרך כלל בחומר צמחי רקוב, במיוחד פירות רקובים כמו תפוחים או על ערימות קומפוסט1. הוא קשור גם לפונדקאים חסרי חוליות מסוימים כמו שבלולים ועץ 2,3. בתי גידול אלה עשירים במיקרובים, אשר לא רק משמשים מזון לתולעת, אלא עשויים גם ליצור קשרים יציבים איתה. מידע על מגוון המיקרואורגניזמים הקשורים באופן טבעי פורסם רק בשנת 2016 4,5,6. מאז, מחקרים אלה ורק כמה מחקרים עדכניים יותר גילו כי C. elegans קשורה למגוון של חיידקים ופטריות, בדרך כלל כולל חיידקים מהסוג Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter, ועודכמה 6,7,8. מספר חיידקים קשורים יכולים ליישב ביציבות את מעי התולעת, אם כי לא כולם 6,9,10,11,12. הם עשויים להיות בעלי חשיבות מרכזית להבנתנו את הביולוגיה של C. elegans מכיוון שהם יכולים לספק תזונה, להגן מפני פתוגנים ואולי גורמי עקה אחרים, ולהשפיע על תכונות מרכזיות בהיסטוריית החיים כגון קצב הרבייה, התפתחות או תגובות התנהגותיות.
לדוגמה, מבודדים הקשורים באופן טבעי של הסוגים Pseudomonas, Ochrobactrum, וגם Enterobacter או Gluconobacter יכול להגן על התולעת מפני זיהום פתוגן והרג בדרכים שונות 5,6,11,13,14. בידוד ספציפי של הסוג Comamonas משפיע על התגובה התזונתית של נמטודה, התפתחות, תוחלת חיים ופוריות15,16,17. חיידקי פרובידנסיה מייצרים את הטיראמין הנוירומודולטורי ובכך מווסתים את פעילות מערכת העצבים המארחת ואת התגובות ההתנהגותיות הנובעות מכך18. קבוצה של חיידקים שונים הקשורים באופן טבעי הודגמו כמשפיעים על קצב גידול האוכלוסייה, הפוריות והתגובות ההתנהגותיות 5,6,9,11,19.
נכון להיום, המגוון והעקביות המדויקים של המיקרוביוטה המקומית C. elegans על פני בתי גידול ומיקומים גיאוגרפיים אינם מובנים במלואם, וקשרים נוספים בין התולעת למיקרובים מסביבתה עדיין נחשפים. מספר מחקרים קודמים השתמשו בזני חיידקים שבודדו מסביבת קרקע כלשהי, מבתי גידול טבעיים של C. elegans, או מניסויים במזוקוסמוס (כלומר, סביבות מבוססות מעבדה המשחזרות בתי גידול טבעיים) עם זני מעבדה של C. elegans 4,5,20. אף על פי שמחקרים אלה השיגו תובנות חדשות על השפעתם של מיקרובים על תכונות נמטודות ספציפיות (למשל, מטבוליזם של נמטודות21), הרלוונטיות של אינטראקציות אלה לביולוגיה של C. elegans בטבע אינה ברורה. לכן, כתב יד זה מתאר את השיטות לבודד ישירות C. elegans מהטבע ולבודד ולאחר מכן לאפיין את המיקרובים הקשורים באופן טבעי הן מתולעים בודדות והן מקבוצות של תולעים. השיטות המתוארות הן גרסה מעודכנת ומשופרת של ההליכים ששימשו בעבר לבידוד ואפיון של C. elegans טבעיים והמיקרוביוטה המקורית שלה 2,6,7. בהתחשב בכך ש- C. elegans נמצא באופן נרחב בחומר צמחי מתפרק ברחבי העולם (במיוחד בפירות נרקבים, באזורים ממוזגים ובסתיו)1,2,22,23,24,25, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על ידי כל מעבדה בכל פעם שיש עניין בהתייחסות ל- C. elegans תכונות למיקרובים הקשורים באופן טבעי ולכן הקשר רלוונטי יותר באופן טבעי. זה האחרון הוא חיוני להבנה מלאה של הביולוגיה של הנמטודה מכיוון שידוע ממגוון של מערכות מארחות אחרות שהמיקרוביוטה הקשורה יכולה להשפיע על מאפייני היסטוריית חיים מגוונים26, היבט שכיום מוזנח במידה רבה בריבוי המחקרים של C. elegans כמעט בכל תחומי מדעי החיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>COMSOL</td>
			<td>COMSOL</td>
			<td></td>
			<td>multiphysics simulation software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of the natural microbiota of the model nematode caenorhabditis elegans

הנמטודה Caenorhabditis elegans אינטראקציה עם מגוון גדול של מיקרואורגניזמים בטבע. באופן כללי, C. elegans נמצא בדרך כלל בחומר צמחי רקוב, במיוחד פירות רקובים כמו תפוחים או על ערימות קומפוסט. הוא קשור גם למארחים חסרי חוליות מסוימים כגון שבלולים ועץ. בתי גידול אלה עשירים במיקרובים, המשמשים כמזון ל-C. elegans ואשר יכולים גם ליישב בהתמדה את מעי הנמטודה. נכון להיום, המגוון והעקביות המדויקים של המיקרוביוטה המקומית C. elegans על פני בתי גידול ומיקומים גיאוגרפיים אינם מובנים במלואם. במאמר זה נתאר גישה מתאימה לבידוד C. elegans מהטבע ולאפיון המיקרוביוטה של התולעים. נמטודות ניתן לבודד בקלות מחומר קומפוסט, תפוחים נרקבים, שבלולים, או למשוך על ידי הנחת תפוחים על ערימות קומפוסט. זמן הפריים טיים למציאת C. elegans בחצי הכדור הצפוני הוא מספטמבר עד נובמבר. ניתן לשטוף תולעים מחומר המצע שנאסף על ידי טבילת המצע בתמיסת חיץ, ולאחר מכן איסוף נמטודות והעברתן למדיום גידול נמטודות או מאגר PCR לניתוח לאחר מכן. אנו ממחישים עוד יותר כיצד ניתן להשתמש בדגימות כדי לבודד ולטהר את המיקרואורגניזמים הקשורים לתולעים ולעבד תולעים עבור ניתוח RNA ריבוזומלי 16S של הרכב קהילת המיקרוביוטה. באופן כללי, השיטות המתוארות עשויות לעורר מחקר חדש על אפיון המיקרוביוטה של C. elegans על פני בתי גידול ומיקומים גיאוגרפיים, ובכך לסייע בהשגת הבנה מקיפה של המגוון והיציבות של המיקרוביוטה של הנמטודה כבסיס למחקר פונקציונלי עתידי.

הנמטודה C. elegans נמצאת לעתים קרובות בפירות מתפרקים, כגון תפוחים, וגם בדגימות קומפוסט. בצפון גרמניה, C. elegans כמו גם מינים מולדים (במיוחד C. remanei אך גם C. briggsae) נמצאים בעיקר מספטמבר עד2 בנובמבר. הנמטודות נמצאות לרוב בחומר צמחי מתפרק, במיוחד פירות נרקבים כמו תפוחים או ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans הוא אחד ממיני המודל העיקריים בביולוגיה, אך כמעט כל המחקר מתבצע בהיעדר מיקרובים הקשורים אליו באופן טבעי. השיטות המתוארות כאן יסייעו לשפר את הבנתנו את מגוון המיקרובים הקשורים כבסיס למחקר פונקציונלי עתידי של C. elegans.

בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

פרוטוקול זה מאפשר תובנות חדשות על המיקרוביוטה הטבעית של C.elegans. במקביל, ניתן להשתמש במיקרובים המבודדים בניסויי מעבדה מבוקרים כדי לאפיין אינטראקציות בין מיקרוביוטה למארח ואת הביולוגיה של C.elegans. פרוטוקול זה מתמקד בבידוד מיקרובים הקשורים ל-C.elegans בטבע, ולכן הם המפתח להבנת הביולוגיה של מארח מודל חשוב זה בהקשר טבעי יותר.זה יהיה מועיל להכיר את המראה של Caenorhabditis לעומת נמטודות אחרות. צנרת תחת היקף הניתוח יכולה להיות בתחילה מאתגרת, אך תרגול יעזור. התחילו באיסוף דגימות סביבתיות כמו קומפוסט או פירות רקובים בשקיות פלסטיק נפרדות, צינורות או מיכלים נקיים.פזרו באופן שווה את חלקי הדגימות הסביבתיות שנאספו בצלחת פטרי סטרילית ריקה באורך תשעה סנטימטרים והוסיפו כ-20 מיליליטר של מדיום צמיג סטרילי כדי לכסות את הדגימה במדיום. תחת מיקרוסקופ הניתוח, חפש נמטודות Caenorhabditis בהתאם להנחיות לבידוד Caenorhabditis elegans ונמטודות קשורות. באמצעות פיפטה של 20 עד 100 מיקרוליטר, לאסוף את הכמות הקטנה ביותר האפשרית של נוזל המכיל את נמטודות Caenorhabditis מהצלחת ולהעביר אותו לצלחת פטרי שלושה סנטימטרים המכילה אחד עד שלושה מיליליטר של M9T סטרילי.כדי לבסס אוכלוסיית תולעים, ניתן להעביר את התולעים הבודדות לצלחת עם מדיום גידול נמטודה או NGM. כדי לשטוף את הנמטודות ולהסיר את המיקרובים הנמצאים מחוץ לנמטודות, דגרו אותם ב-M9T למשך 10 עד 15 דקות. הוציאו את הכמות הקטנה ביותר האפשרית של נוזל המכיל את הנמטודות והעבירו אותו לצלחת פטרי סטרילית חדשה באורך שלושה סנטימטרים המכילה מיליליטר אחד עד שלושה מיליליטר של M9T טרי.לזיהוי בלתי משוחד של מיקרובים הקשורים לנמטודה, הכינו צלחת 96 באר עם כשלושה חרוזים סטריליים בקוטר מילימטר אחד והוסיפו תערובת של 19.5 מיקרוליטר של חיץ PCR ו-0.5 מיקרוליטר של פרוטאינאז K לכל באר. מעבירים נמטודה שטופה אחת לכל באר עם כמה שפחות נוזלים. לשבור את הנמטודות המועברות באמצעות הומוגנייזר חרוז במשך שלוש דקות ב 30 הרץ צנטריפוגה את הצלחות או צינורות ב 8, 000 G במשך 10 שניות בטמפרטורת החדר כדי לקבל את הנוזל לתחתית.כדי לזהות C.elegans, חממו את הדגימות במחזור PCR למשך שעה אחת בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס ו-15 דקות ב-95 מעלות צלזיוס כדי לבודד דנ"א של נמטודות בודדות, או השתמשו בערכות מסחריות כדי לבודד דנ"א של אוכלוסיות תולעים. הקפיאו את הדנ"א המבודד בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. השתמש בדנ"א ובזוג הפריימרים NLP 30 קדימה ו- NLP 30 לאחור ולייצר מוצר PCR של זוג בסיסים 154.כדי לבודד את החיידקים, הכינו צלחת בת 96 בארות עם כשלושה חרוזים סטריליים של מילימטר אחד, 20 מיקרוליטרים של חיץ M9 לכל באר, ופיפטה נמטודה אחת שטופה לכל באר עם כמה שפחות נוזלים. שברו את הנמטודות כפי שהודגם לפני השימוש בהומוגנייזר חרוזים, ולאחר מכן צנטריפוגה קצרה של הצלחת כדי להביא את הנוזל לתחתית. לאחר שתסיימו, אספו את המתלים ודללו אותו באופן סדרתי ביחס של אחד עד 10.צלחת עד 100 מיקרוליטר של המתלה המדולל על לוחות אגר של תשעה סנטימטרים. לאחר מכן לדגור את הצלחות ב 15 עד 20 מעלות צלזיוס במשך 24 עד 48 שעות. כדי להשיג את תרבית החיידקים הטהורה, בחרו מושבה אחת מצלחת הדגירה באמצעות לולאה סטרילית או קיסם ופזרו אותה על צלחת אגר חדשה המכילה את אותו מדיום אגר המשמש במהלך הטיהור.הקפידו להשתמש רק ב-1/3 מהצלחת. לאחר מכן עקרו לולאה הניתנת לשימוש חוזר או השתמשו בלולאה סטרילית חדשה וגררו אותה דרך הפס הראשון כדי ליצור פס שני על חלק נוסף של 1/3 מלוח הדגימה. חזור עליו על ידי גרירת לולאה דרך הפס השני ויצירת הפס השלישי כדי להשיג את צמיחת המושבה הבודדת.לדגור את הצלחת באותם תנאי גידול המשמשים לבידוד, ובמידת הצורך, לחזור על שלב הטיהור. לגדל את המושבות הטהורות במדיום נוזלי באמצעות אותה טמפרטורה ותנאי גדילה. לאחר מכן, אפיינו את החיידקים על ידי חילוץ הדנ"א החיידקי מתרביות נוזליות טהורות המגבירות את הרנ"א הריבוזומלי 16S באמצעות 27 פריימרים הפוכים קדימה ו-1495 וביצוע ה-PCR כמתואר בטקסט.כאשר דגימות הפירות והקומפוסט שנאספו חולקו בצלחות פטרי ושקעו במדיום נוזלי או צמיג, זה גרם לתולעים לעזוב את חומר המצע ולשחות אל פני השטח של המדיום. המיקרובים בודדו כמושבות בודדות טהורות, והטיהור מילא תפקיד חיוני מכיוון שחלק מהחיידקים הקשורים ל-C.elegans יכולים ליצור ביופילמים או לצבור בקלות, וכתוצאה מכך נוצרו תרביות מרובות מינים. ה-PCR באמצעות פריימרים ספציפיים של C.elegans, כלומר NLP 30 קדימה ו-NLP 30 לאחור, הביא להגברה של מכפלת זוג בסיסים של 154 עבור C.elegans.הדנ"א שבודד מתולעים בודדות הביא לרצועות PCR חלשות, ואילו מיצוי דנ"א מאוכלוסיות התולעים שכללו לפחות 50 תולעים הניב כמות גדולה יותר ופסים ברורים יותר. ההצלחה של C.elegans ספציפי PCR אושרה על ידי הרצת הדנ"א של זן מעבדה כלומר N2 כבקרה חיובית בו זמנית עם הדנ"א של הנמטודות המבודדות חיידקים נמצאים בכל מקום. לפיכך, חיוני לעבוד בתנאים סטריליים כדי להבטיח כי אותם חיידקים מבודדים קשורים באמת עם התולעת בטבע.המיקרובים המבודדים יכולים לשמש לחקר אינטראקציות בין מיקרוביוטה לפונדקאי או את תפקידם של מיקרובים בביולוגיה של המארח, לדוגמה, הזדקנות, התפתחות או חסינות בניסויי מעבדה מבוקרים. מיקרובים המבודדים בטכניקה זו משמשים כיום את קהילת C.elegans כדי לשפר את ההבנה של מגוון המיקרוביוטה על כושר המארח או תפקידם של מיקרובים על חסינות.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

פרופיל איזוטופים יציבים של שטף מטבולית מתווך בשלב פיתוח למבוגרים Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

בידוד ערפדים של נוזלים מתאיים<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

אוסף, בידוד והעשרה של חיידקים המתרחשים באופן טבעי מMagnetotactic הסביבה

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

טיפוח<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; ב בשלושה ממדים במעבדה

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...