Name: isolation and characterization of the natural microbiota of the model nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-08-17T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

我々は、ドイツ科学財団(メタ生物の起源と機能に関する共同研究センター1182のプロジェクトA1.1及びA1.2)からの財政的支援を認める。シュレンブルク研究所のメンバーのアドバイスとサポートに感謝します。

1. バッファーと培地の調製
<ol><li>5.85 gのNaCl、1.123 gのK2HPO 4、5.926 gのKH2 PO4、および1 Lの脱イオン化H2Oをフラスコとオートクレーブに加え、121°Cで20分間、Sバッファーを調製します。</li>
	<li>1.2%(w/v)ヒドロキシメチルセルロース(培地の粘度の原因となる物質)、5 mg/mLコレステロール、1 mM MgSO4、1 mM CaCl2、および0.1%(v/v)アセト?...

<ol>
	<li>Schulenburg, H., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+biotic+environment+of+Caenorhabditis+elegans.">The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).</li><li>Petersen, C., Dirksen, P., Prahl, S., Strathmann, E. A., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+Caenorhabditis+elegans+across+1.5+years+in+selected+North+German+locations:+the+importance+of+substrate+type,+abiotic+parameters,+and+Caenorhabditis+competitors.">The prevalence of Caenorhabditis elegans across 1.5 years in selected North German locations: the importance of substrate type, abiotic parameters, and Caenorhabditis competitors.</a> BMC Ecology. 14 (1), 4 (2014).</li><li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Travelling+at+a+slug's+pace:+possible+invertebrate+vectors+of+Caenorhabditis+nematodes.">Travelling at a slug's pace: possible invertebrate vectors of Caenorhabditis nematodes.</a> BMC Ecology. 15 (1), 19 (2015).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+assembly+of+the+native+C.+elegans+microbiome+is+influenced+by+time,+substrate+and+individual+bacterial+taxa.">Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate and individual bacterial taxa.</a> Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+repertoire+contained+within+the+native+microbiota+of+the+model+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans.</a> The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2019).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+effects+of+C.+elegans+protective+natural+microbiota+on+host+physiology.">Exploring effects of C. elegans protective natural microbiota on host physiology.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 775728 (2022).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Watson, E., MacNeil, L. T., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+metabolic+and+gene+regulatory+networks+modulates+the+C.+elegans+dietary+response.">Integration of metabolic and gene regulatory networks modulates the C. elegans dietary response.</a> Cell. 153 (1), 253-266 (2013).</li><li>Watson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+systems+biology+uncovers+metabolites+affecting+C.+elegans+gene+expression+and+life+history+traits.">Interspecies systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits.</a> Cell. 156 (4), 759-770 (2014).</li><li>MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+developmental+acceleration+independent+of+TOR+and+insulin+in+C.+elegans.">Diet-induced developmental acceleration independent of TOR and insulin in C. elegans.</a> Cell. 153 (1), 240-252 (2013).</li><li>O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. -. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurotransmitter+produced+by+gut+bacteria+modulates+host+sensory+behaviour.">A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour.</a> Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).</li><li>Snoek, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-parent+recombinant+inbred+line+population+of+C.+elegans+allows+identification+of+novel+QTLs+for+complex+life+history+traits.">A multi-parent recombinant inbred line population of C. elegans allows identification of novel QTLs for complex life history traits.</a> BMC Biology. 17 (1), 24 (2019).</li><li>Avery, L., Shtonda, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+transport+in+the+C.+elegans+pharynx.">Food transport in the C. elegans pharynx.</a> Journal of Experimental Biology. 206 (14), 2441-2457 (2003).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+delicate+balance+between+bacterial+iron+and+reactive+oxygen+species+supports+optimal+C.+elegans+development.">A delicate balance between bacterial iron and reactive oxygen species supports optimal C. elegans development.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (3), 400-411 (2019).</li><li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+life+in+compost:+temporal+and+spatial+variation+of+North+German+Caenorhabditis+elegans+populations.">Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations.</a> Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).</li><li>F&#233;lix, M. -. A., Duveau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+and+habitat+sharing+of+natural+populations+of+Caenorhabditis+elegans+and+C.+briggsae.">Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae.</a> BMC Biology. 10 (1), 59 (2012).</li><li>Barri&#232;re, A., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+and+linkage+disequilibrium+in+natural+Caenorhabditis+elegans+populations.">Temporal dynamics and linkage disequilibrium in natural Caenorhabditis elegans populations.</a> Genetics. 176 (2), 999-1011 (2007).</li><li>Dolgin, E. S., F&#233;lix, M. -. A., Cutter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hakuna+Nematoda:+genetic+and+phenotypic+diversity+in+African+isolates+of+Caenorhabditis+elegans+and+C.+briggsae.">Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae.</a> Heredity. 100 (3), 304-315 (2008).</li><li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+animal+models+for+microbiome+research.">Simple animal models for microbiome research.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 764-775 (2019).</li><li>Barri&#232;re, A., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+C.+elegans+and+related+nematodes.">Isolation of C. elegans and related nematodes.</a> WormBook. , 1-19 (2014).</li><li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study.">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+adaptation+and+spatiotemporal+patterns+of+genetic+diversity+revealed+by+repeated+sampling+of+Caenorhabditis+elegans+across+the+Hawaiian+Islands.">Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands.</a> Molecular Ecology. 31 (8), 2327-2347 (2022).</li><li>Haber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+history+of+Caenorhabditis+elegans+inferred+from+microsatellites:+Evidence+for+spatial+and+temporal+genetic+differentiation+and+the+occurrence+of+outbreeding.">Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: Evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding.</a> Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2004).</li><li>Watson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+network+rewiring+of+propionate+flux+compensates+vitamin+B12+deficiency+in+C.+elegans.">Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans.</a> eLife. 5, 17670 (2016).</li></ol>

線虫カエノラブディティスエレガンスは、生物学研究で最も集中的に研究されているモデル生物の1つです。これは、もともと神経系の発達と機能を理解するために、1960年代にシドニーブレナーによって導入されました29。それ以来、C. elegansは、行動生物学、神経生物学、老化、進化生物学、細胞生物学、発生生物学、免疫学など、すべての生物学分野にわた?...

自然界では、C.エレガンスは腐った植物、特にリンゴのような腐った果物や堆肥の山によく見られます1。また、ナメクジやウッドスライスなどの特定の無脊椎動物の宿主にも関連しています2,3。これらの生息地は微生物が豊富で、ワームの餌として役立つだけでなく、それと安定した関係を形成する可能性もあります。天然関連微生物の多様性に関する情報は、2016年にのみ公開されました4,5,6。それ以来、これらおよびほんの数件の最近の研究により、C.エレガンスはさまざまな細菌および真菌と関連していることが明らかにされており、最も一般的にはシュードモナス属、エンテロバクター属、オクロバクトラム属、エルウィニア属、コマモナス属、グルコノバクター属、および他のいくつかの細菌が含まれます6,7,8。いくつかの関連細菌は、すべてではありませんが、ワーム腸に安定してコロニーを形成することができます6,9,10,11,12。それらは、栄養を提供し、病原体やおそらく他のストレッサーから保護し、生殖率、発達、行動反応などの中心的な生活史形質に影響を与える可能性があるため、C.エレガンスの生物学を理解する上で非常に重要である可能性があります。
一例として、シュードモナス属、オクロバクトラム属、およびエンテロバクター属またはグルコノバクター属の天然会合分離株は、異なる方法で病原体感染および死滅からワームを保護することができる5、6、11、13、14。コマモナス属の特定の分離は、線虫の食事反応、発達、寿命、および生殖能力に影響を与えます15,16,17。プロビデンシア属細菌は神経調節物質チラミンを産生し、それによって宿主の神経系の活動とその結果生じる行動反応を調節します18。一連の異なる天然関連細菌が、集団成長率、生殖能力、および行動反応に影響を与えることが実証されました5、6、9、11、19。
今日まで、生息地や地理的な場所にわたる在来のC.エレガンス微生物叢の正確な多様性と一貫性は完全には理解されておらず、ワームとその環境からの微生物とのさらなる関連はまだ明らかにされていません。以前のいくつかの研究では、いくつかの土壌環境、自然のC.エレガンスの生息地、またはC.エレガンスの実験室株4,5,20を使用したメソコズム実験(つまり、自然の生息地を再現するラボベースの環境)から分離された細菌株を使用していました。これらの研究は、特定の線虫の形質(例えば、線虫代謝21)に対する微生物の影響に関する新しい洞察を得たが、これらの相互作用が自然界のC.elegans生物学との関連性は不明である。したがって、この原稿は、C.エレガンスを自然から直接分離し、単一のワームとワームのグループの両方から自然に関連する微生物を分離し、その後特徴付ける方法を説明しています。記載された方法は、天然のC.エレガンスおよびその天然微生物叢の単離および特性評価のために以前に使用された手順の更新および改良版である2,6,7。C.エレガンスが世界中の植物物質の分解に広く見られることを考えると(特に腐った果物、温帯地域、および秋)1,2,22,23,24,25、このプロトコルは、C.エレガンスの関連に関心があるときはいつでも、どのラボでも適用できます。 自然に関連する微生物への形質、したがってより自然に関連するコンテキスト。後者は、関連する微生物叢が多様な生活史特性に影響を与える可能性があることが他の宿主システムの多様性から知られているため、線虫の生物学を完全に理解するために極めて重要です26、現在、ほぼすべての生命科学分野にわたる多数のC.エレガンス研究でほとんど無視されている側面。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>COMSOL</td>
			<td>COMSOL</td>
			<td></td>
			<td>multiphysics simulation software</td>
		</tr>
	</tbody>
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isolation and characterization of the natural microbiota of the model nematode caenorhabditis elegans

線虫カ エノラブディティスエレガンスは 、自然界の多種多様な微生物と相互作用します。一般に、 C.エレガンスは 腐った植物、特にリンゴのような腐った果物や堆肥の山によく見られます。また、ナメクジやウッドスライスなどの特定の無脊椎動物の宿主にも関連しています。これらの生息地は微生物が豊富で、 C.エレガンスの 餌として機能し、線虫の腸に持続的にコロニーを形成することもできます。今日まで、生息地や地理的な場所を超えた在来の C.エレガンス 微生物叢の正確な多様性と一貫性は完全には理解されていません。ここでは、 C.エレガンスを 自然から分離し、ワームの微生物叢を特徴付けるための適切なアプローチについて説明します。線虫は、堆肥材料、腐ったリンゴ、ナメクジから簡単に分離したり、リンゴを堆肥の山に置くことによって引き付けることができます。北半球で C.エレガンス を見つけるのに最適な時期は9月から11月です。ワームは、基質を緩衝液に浸し、続いて線虫を捕集し、その後の分析のために線虫増殖培地またはPCR緩衝液に移すことによって、収集された基質材料から洗い流すことができます。さらに、サンプルを使用してワーム関連微生物を分離および精製し、微生物叢群集組成の16SリボソームRNA分析のためにワームを処理する方法を示します。全体として、記載された方法は、生息地および地理的位置にわたる C.エレガンス 微生物叢の特性評価に関する新しい研究を刺激し、それによって将来の機能研究の基礎として線虫の微生物叢の多様性と安定性の包括的な理解を得るのに役立つ可能性があります。

線虫C.エレガンスは、リンゴなどの果物の分解や堆肥サンプルに頻繁に見られます。北ドイツでは、主に9月から11月2日まで、C. elegansと同属種(特にC. remaneiだけでなくC. briggsae)が見られます。線虫は、植物物質、特にリンゴやナシなどの腐った果物、および堆肥、特に高グレードの分解を示す材料に最も一般的に見られます。果物と堆肥のサンプル?...

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Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans は生物学の主要なモデル種の1つですが、ほとんどすべての研究は、その自然に関連する微生物の不在下で行われています。ここで説明する方法は、将来の機能的 C.エレガンス 研究の基礎として、関連する微生物の多様性の理解を深めるのに役立ちます。

モデル線虫の天然微生物叢の分離と特性評価

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

このプロトコルは、C.elegansの天然微生物叢への新しい洞察を可能にします。同時に、単離された微生物は、微生物叢と宿主の相互作用およびC.elegans生物学を特徴付けるために、制御された実験室実験で使用することができます。このプロトコルは、自然界のC.elegansに関連する微生物を分離することに焦点を当てているため、この重要なモデル宿主の生物学をより自然な状況で理解するための鍵となります。他の線虫と比較してカエノラブディティスの出現に精通していることは有用でしょう。解剖スコープでのピペッティングは最初は難しい場合がありますが、練習が役立ちます。堆肥や腐った果物などの環境サンプルを別々のビニール袋、チューブ、またはきれいな容器に集めることから始めます。収集した環境サンプルの断片を滅菌9センチメートルの空のペトリ皿に均等に広げ、約20ミリリットルの滅菌粘性培地を加えてサンプルを培地で覆います。解剖顕微鏡下で、カエノラブディティス・エレガンスおよび関連する線虫の分離に関するガイドラインに従って、カエノラブディティス線虫を検索します。20〜100マイクロリットルのピペットを使用して、Caenorhabditis線虫を含む可能な限り少量の液体をプレートから収集し、1〜3ミリリットルの滅菌M9Tを含む3センチメートルのペトリ皿に移します。ワーム集団を確立するために、個々のワームを線虫増殖培地またはNGMと共にプレート上に移すことができる。線虫を洗浄し、線虫の外側に存在する微生物を除去するには、それらをM9Tで10〜15分間インキュベートします。線虫を含む液体を可能な限り少量ピペットで取り出し、1〜3ミリリットルの新鮮なM9Tを含む新しい滅菌3センチメートルのペトリ皿に移します。線虫関連微生物を公平に同定するには、直径1ミリメートルの滅菌ビーズを約3個含む96ウェルプレートを調製し、ウェルあたり19.5マイクロリットルのPCRバッファーと0.5マイクロリットルのプロテイナーゼKの混合物を加えます。単一の洗浄した線虫をできるだけ少ない液体で各ウェルに移します。移した線虫をビーズホモジナイザーを使用して30ヘルツで3分間分解し、プレートまたはチューブを室温で10秒間8, 000 Gで遠心分離して液体を底に運びます。C.elegansを同定するには、PCRサイクラーでサンプルを摂氏50度で1時間、摂氏95度で15分間加熱して個々の線虫のDNAを分離するか、市販のキットを使用して線虫集団のDNAを分離します。単離したDNAを摂氏マイナス20度で凍結して長期保存します。DNAとプライマーペアNLP 30を順方向および逆方向に使用し、154塩基対のPCR産物を生成します。細菌を単離するには、約3つの滅菌1ミリメートルビーズ、ウェルあたり20マイクロリットルのM9バッファーを含む96ウェルプレートを準備し、洗浄した線虫を1つピペットで各ウェルにできるだけ少ない液体でピペットで送ります。ビーズホモジナイザーを使用する前に実証されたように線虫を分解し、続いてプレートを短時間遠心分離して液体を底に運びます。完了したら、懸濁液を収集し、1〜10の割合で連続的に希釈します。希釈した懸濁液を最大100マイクロリットル、9センチメートルの寒天プレートにプレートします。次に、プレートを摂氏15〜20度で24〜48時間インキュベートします。純粋な細菌培養物を得るには、滅菌ループまたはつまようじを使用してインキュベートプレートから単一のコロニーを選択し、精製中に使用したのと同じ寒天培地を含む新しい寒天プレートにストリークします。プレートの1/3のみを使用するようにしてください。次に、再利用可能なループを滅菌するか、新しい滅菌ループを使用して最初のストリークにドラッグし、サンプルプレートの別の1/3部分に2番目のストリークを作成します。2番目のストリークにループをドラッグし、3番目のストリークを作成して、単一のコロニーの成長を達成することで、これを繰り返します。単離に使用したのと同じ増殖条件下でプレートをインキュベートし、必要に応じて精製ステップを繰り返します。純粋なコロニーを液体培地中で、同じ温度および増殖条件を用いて増殖させる。次に、純粋な液体培養物から細菌DNAを抽出し、27フォワードプライマーと1495リバースプライマーを使用して16SリボソームRNAを増幅し、本文に記載されているようにPCRを行うことにより、細菌の特性評価を行います。採取した果物や堆肥のサンプルをペトリ皿に分配し、液体または粘性のある培地に浸すと、ワームが基質材料を離れて培地の表面に泳ぎました。微生物は純粋な単一コロニーとして単離され、一部のC.elegans関連細菌はバイオフィルムを形成したり凝集しやすく、複数種の培養をもたらす可能性があるため、精製は重要な役割を果たしました。C.elegans特異的プライマー、すなわちNLP 30フォワードおよびNLP 30リバースを用いたPCRは、C.エレガンスの154塩基対産物の増幅をもたらした。単一のワームから分離されたDNAは弱いPCRバンドをもたらしましたが、少なくとも50匹のワームからなるワーム集団からのDNA抽出は、より多く、より明確なバンドをもたらしました。C.elegans特異的PCRの成功は、微生物がいたるところにある単離された線虫のDNAと同時にポジティブコントロールとして実験室株すなわちN2のDNAを実行することによって確認された。したがって、単離された微生物が自然界のワームと真に関連していることを確認するために、無菌条件下で作業することが不可欠です。単離された微生物は、宿主と微生物叢の相互作用、または宿主生物学における微生物の役割、例えば、制御された実験室実験における老化、発生、または免疫を研究するために使用することができる。この技術で分離された微生物は、現在、宿主の適応度に関する微生物叢の多様性や免疫に対する微生物の役割の理解を深めるために、C.elegansコミュニティによって使用されています。

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

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開発と成人期における中間代謝フラックスの安定同位体プロファイル線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

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アイソレーションと試験管内で</emの>活性化線虫（Caenorhabditis elegans）精子

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

計測線虫（Caenorhabditis elegans）</em96穴マイクロタイタープレートの>寿命

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

から細胞外液のヴァンパイア·アイソレーション<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた<em&gt; Cエレガンス</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

当然のことながら環境から磁性細菌の発生の収集、分離、濃縮

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

の栽培<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;ラボにおける三次元で

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...