Name: isolation and characterization of the natural microbiota of the model nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-08-17T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Vi anerkjenner økonomisk støtte fra German Science Foundation (prosjekter A1.1 og A1.2 fra Collaborative Research Center 1182 om metaorganismers opprinnelse og funksjon). Vi takker medlemmene av Schulenburg-laboratoriet for deres råd og støtte.

1. Forberedelse av buffere og medier
<ol><li>Forbered S-buffer ved å tilsette 5,85 g NaCl, 1,123 g K 2 HPO4, 5,926 g KH2PO4 og 1 L avionisertH2O til en kolbe og autoklav i 20 minutter ved 121 °C.</li>
	<li>Forbered et viskøst medium ved å tilsette S-buffer som inneholder 1,2% (w / v) hydroksymetylcellulose (stoffet som forårsaker viskositet i mediet), 5 mg / ml kolesterol, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2 og 0,1% (v / v) aceton. Au...

<ol>
	<li>Schulenburg, H., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+biotic+environment+of+Caenorhabditis+elegans.">The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).</li><li>Petersen, C., Dirksen, P., Prahl, S., Strathmann, E. A., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+Caenorhabditis+elegans+across+1.5+years+in+selected+North+German+locations:+the+importance+of+substrate+type,+abiotic+parameters,+and+Caenorhabditis+competitors.">The prevalence of Caenorhabditis elegans across 1.5 years in selected North German locations: the importance of substrate type, abiotic parameters, and Caenorhabditis competitors.</a> BMC Ecology. 14 (1), 4 (2014).</li><li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Travelling+at+a+slug's+pace:+possible+invertebrate+vectors+of+Caenorhabditis+nematodes.">Travelling at a slug's pace: possible invertebrate vectors of Caenorhabditis nematodes.</a> BMC Ecology. 15 (1), 19 (2015).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+assembly+of+the+native+C.+elegans+microbiome+is+influenced+by+time,+substrate+and+individual+bacterial+taxa.">Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate and individual bacterial taxa.</a> Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+repertoire+contained+within+the+native+microbiota+of+the+model+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans.</a> The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2019).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+effects+of+C.+elegans+protective+natural+microbiota+on+host+physiology.">Exploring effects of C. elegans protective natural microbiota on host physiology.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 775728 (2022).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Watson, E., MacNeil, L. T., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+metabolic+and+gene+regulatory+networks+modulates+the+C.+elegans+dietary+response.">Integration of metabolic and gene regulatory networks modulates the C. elegans dietary response.</a> Cell. 153 (1), 253-266 (2013).</li><li>Watson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+systems+biology+uncovers+metabolites+affecting+C.+elegans+gene+expression+and+life+history+traits.">Interspecies systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits.</a> Cell. 156 (4), 759-770 (2014).</li><li>MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+developmental+acceleration+independent+of+TOR+and+insulin+in+C.+elegans.">Diet-induced developmental acceleration independent of TOR and insulin in C. elegans.</a> Cell. 153 (1), 240-252 (2013).</li><li>O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. -. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurotransmitter+produced+by+gut+bacteria+modulates+host+sensory+behaviour.">A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour.</a> Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).</li><li>Snoek, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-parent+recombinant+inbred+line+population+of+C.+elegans+allows+identification+of+novel+QTLs+for+complex+life+history+traits.">A multi-parent recombinant inbred line population of C. elegans allows identification of novel QTLs for complex life history traits.</a> BMC Biology. 17 (1), 24 (2019).</li><li>Avery, L., Shtonda, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+transport+in+the+C.+elegans+pharynx.">Food transport in the C. elegans pharynx.</a> Journal of Experimental Biology. 206 (14), 2441-2457 (2003).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+delicate+balance+between+bacterial+iron+and+reactive+oxygen+species+supports+optimal+C.+elegans+development.">A delicate balance between bacterial iron and reactive oxygen species supports optimal C. elegans development.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (3), 400-411 (2019).</li><li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+life+in+compost:+temporal+and+spatial+variation+of+North+German+Caenorhabditis+elegans+populations.">Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations.</a> Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).</li><li>F&#233;lix, M. -. A., Duveau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+and+habitat+sharing+of+natural+populations+of+Caenorhabditis+elegans+and+C.+briggsae.">Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae.</a> BMC Biology. 10 (1), 59 (2012).</li><li>Barri&#232;re, A., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+and+linkage+disequilibrium+in+natural+Caenorhabditis+elegans+populations.">Temporal dynamics and linkage disequilibrium in natural Caenorhabditis elegans populations.</a> Genetics. 176 (2), 999-1011 (2007).</li><li>Dolgin, E. S., F&#233;lix, M. -. A., Cutter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hakuna+Nematoda:+genetic+and+phenotypic+diversity+in+African+isolates+of+Caenorhabditis+elegans+and+C.+briggsae.">Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae.</a> Heredity. 100 (3), 304-315 (2008).</li><li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+animal+models+for+microbiome+research.">Simple animal models for microbiome research.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 764-775 (2019).</li><li>Barri&#232;re, A., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+C.+elegans+and+related+nematodes.">Isolation of C. elegans and related nematodes.</a> WormBook. , 1-19 (2014).</li><li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study.">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+adaptation+and+spatiotemporal+patterns+of+genetic+diversity+revealed+by+repeated+sampling+of+Caenorhabditis+elegans+across+the+Hawaiian+Islands.">Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands.</a> Molecular Ecology. 31 (8), 2327-2347 (2022).</li><li>Haber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+history+of+Caenorhabditis+elegans+inferred+from+microsatellites:+Evidence+for+spatial+and+temporal+genetic+differentiation+and+the+occurrence+of+outbreeding.">Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: Evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding.</a> Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2004).</li><li>Watson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+network+rewiring+of+propionate+flux+compensates+vitamin+B12+deficiency+in+C.+elegans.">Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans.</a> eLife. 5, 17670 (2016).</li></ol>

Nematoden Caenorhabditis elegans er en av de mest intensivt studerte modellorganismene i biologisk forskning. Det ble introdusert av Sydney Brenner på 1960-tallet, opprinnelig for å forstå utviklingen og funksjonen til nervesystemet29. Siden da har C. elegans blitt en kraftig modell for å studere grunnleggende prosesser på tvers av alle biologiske disipliner, inkludert atferdsbiologi, nevrobiologi, aldring, evolusjonær biologi, cellebiologi, utviklingsbiologi og immunologi....

I naturen finnes C. elegans ofte i råttent plantemateriale, spesielt råtne frukter som epler eller på komposthauger1. Det er også forbundet med visse virvelløse verter som snegler og woodlice 2,3. Disse habitatene er rike på mikrober, som ikke bare tjener som mat til ormen, men kan også danne stabile foreninger med den. Informasjon om mangfoldet av naturlig assosierte mikroorganismer ble først publisert i 2016 4,5,6. Siden da har disse og bare noen få nyere studier vist at C. elegans er assosiert med en rekke bakterier og sopp, oftest inkludert bakterier av slekten Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter og flere andre 6,7,8. Flere tilknyttede bakterier kan stabilt kolonisere ormtarmen, men ikke alle 6,9,10,11,12. De vil sannsynligvis være av sentral betydning for vår forståelse av C. elegans biologi fordi de kan gi ernæring, beskytte mot patogener og muligens andre stressorer, og påvirke sentrale livshistorieegenskaper som reproduktiv hastighet, utvikling eller atferdsrespons.
Som et eksempel kan naturlig assosierte isolater av slektene Pseudomonas, Ochrobactrum, og også Enterobacter eller Gluconobacter beskytte ormen mot patogeninfeksjon og drepe på forskjellige måter 5,6,11,13,14. Et spesifikt isolat av slekten Comamonas påvirker nematode kostholdsrespons, utvikling, levetid og fruktbarhet15,16,17. Providencia-bakterier produserer nevromodulatoren tyramin og derved modulerer vertsnervesystemets aktivitet og resulterende atferdsresponser18. Et sett med forskjellige naturlig assosierte bakterier ble vist å påvirke befolkningsvekst, fruktbarhet og atferdsrespons 5,6,9,11,19.
Til dags dato er det nøyaktige mangfoldet og konsistensen til den innfødte C. elegans mikrobiota på tvers av habitater og geografiske steder ikke fullt ut forstått, og ytterligere foreninger mellom ormen og mikrober fra miljøet gjenstår å bli avdekket. Flere tidligere studier brukte bakteriestammer isolert fra noe jordmiljø, naturlige C. elegans habitater, eller fra mesokosmeksperimenter (dvs. laboratoriebaserte miljøer som gjenskaper naturlige habitater) med C. elegans laboratoriestammer 4,5,20. Selv om disse studiene fikk ny innsikt i påvirkning av mikrober på spesifikke nematodeegenskaper (f.eks. Nematodemetabolisme21), er relevansen av disse interaksjonene for C. elegans biologi i naturen uklar. Derfor beskriver dette manuskriptet metodene for å direkte isolere C. elegans fra naturen og å isolere og deretter karakterisere de naturlig assosierte mikrober fra både enkeltormer og grupper av ormer. De beskrevne metodene er en oppdatert og forbedret versjon av prosedyrene som tidligere ble brukt for isolering og karakterisering av naturlige C. elegans og dens opprinnelige mikrobiota 2,6,7. Tatt i betraktning at C. elegans er utbredt i nedbrytende plantemateriale over hele verden (spesielt i råtnende frukt, tempererte områder og om høsten)1,2,22,23,24,25, kan denne protokollen brukes av ethvert laboratorium når det er interesse for å relatere C. elegans egenskaper til naturlig assosierte mikrober og dermed en mer naturlig relevant kontekst. Sistnevnte er avgjørende for en full forståelse av nematodens biologi fordi det er kjent fra et mangfold av andre vertssystemer at den tilhørende mikrobiotaen kan påvirke ulike livshistorieegenskaper26, et aspekt som for tiden i stor grad er neglisjert i mangfoldet av C. elegans-studier på tvers av nesten alle livsvitenskapsdisipliner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>COMSOL</td>
			<td>COMSOL</td>
			<td></td>
			<td>multiphysics simulation software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of the natural microbiota of the model nematode caenorhabditis elegans

Nematoden Caenorhabditis elegans samhandler med et stort mangfold av mikroorganismer i naturen. Generelt er C. elegans ofte funnet i råttent plantemateriale, spesielt råtne frukter som epler eller på komposthauger. Det er også forbundet med visse hvirvelløse verter som snegler og woodlice. Disse habitatene er rike på mikrober, som tjener som mat for C. elegans , og som også vedvarende kan kolonisere nematodetarmen. Til dags dato er det nøyaktige mangfoldet og konsistensen til den innfødte C. elegans mikrobiota på tvers av habitater og geografiske steder ikke fullt ut forstått. Her beskriver vi en passende tilnærming for å isolere C. elegans fra naturen og karakterisere mikrobiota av ormer. Nematoder kan lett isoleres fra kompostmateriale, råtnende epler, snegler eller tiltrekkes ved å plassere epler på komposthauger. Den beste tiden for å finne C. elegans på den nordlige halvkule er fra september til november. Ormer kan vaskes ut av oppsamlet substratmateriale ved å nedsenke substratet i bufferløsning, etterfulgt av innsamling av nematoder og overføring til nematodevekstmedium eller PCR-buffer for etterfølgende analyse. Vi illustrerer videre hvordan prøvene kan brukes til å isolere og rense ormassosierte mikroorganismer og til å behandle ormer for 16S ribosomal RNA-analyse av mikrobiotasamfunnssammensetning. Samlet sett kan de beskrevne metodene stimulere til ny forskning på karakterisering av C. elegans mikrobiota på tvers av habitater og geografiske steder, og dermed bidra til å oppnå en omfattende forståelse av mangfoldet og stabiliteten til nematodens mikrobiota som grunnlag for fremtidig funksjonell forskning.

Nematoden C. elegans finnes ofte i nedbrytende frukt, som epler, og også kompostprøver. I Nord-Tyskland finnes C. elegans samt congeneric arter (spesielt C. remanei, men også C. briggsae) hovedsakelig fra september til2. november. Nematoder er oftest funnet i nedbrytende plantemateriale, spesielt råtnende frukter som epler eller pærer, og også kompost, spesielt materiale som viser en høy grad av nedbrytning. Frukt- og kompostprøvene kan tas inn i laborat...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans er en av de viktigste modellartene i biologi, men nesten all forskning utføres i fravær av dens naturlig assosierte mikrober. Metodene beskrevet her vil bidra til å forbedre vår forståelse av mangfoldet av tilknyttede mikrober som grunnlag for fremtidig funksjonell C. elegans forskning.

Isolering og karakterisering av den naturlige mikrobiotaen til modellen Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Denne protokollen gir ny innsikt i den naturlige mikrobiotaen til C.elegans. Samtidig kan de isolerte mikroberene brukes i kontrollerte laboratorieeksperimenter for å karakterisere mikrobiota-vertsinteraksjoner og C.elegans biologi. Denne protokollen fokuserer på å isolere mikrober assosiert med C.elegans i naturen, som derfor er nøkkelen til å forstå biologien til denne viktige modellverten i en mer naturlig sammenheng.Det vil være nyttig å være kjent med utseendet på Caenorhabditis sammenlignet med andre nematoder. Pipetting under dissekering omfang kan i utgangspunktet være utfordrende, men praksis vil være nyttig. Begynn med å samle miljøprøver som kompost eller råtne frukter i separate plastposer, rør eller rene beholdere.Fordel stykkene av de innsamlede miljøprøvene jevnt i en steril ni centimeter tom petriskål og tilsett ca. 20 ml sterilt viskøst medium for å dekke prøven med mediet. Under dissekeringsmikroskopet, søk etter Caenorhabditis nematoder etter retningslinjene for isolering av Caenorhabditis elegans og relaterte nematoder. Ved hjelp av en 20 til 100 mikroliter pipette, samle den minste mulige mengden væske som inneholder Caenorhabditis nematoder fra platen og overfør den til den tre centimeter petriskålen som inneholder en til tre milliliter steril M9T.For å etablere en ormpopulasjon kan de enkelte ormene overføres til en plate med et nematodevekstmedium eller NGM. For å vaske nematoder og fjerne mikrober som er tilstede utenfor nematoder, inkuber dem i M9T i 10 til 15 minutter. Pipette ut den minste mulige mengden væske som inneholder nematoder og overfør den til en ny steril tre centimeter petriskål som inneholder en til tre milliliter fersk M9T.For upartisk identifisering av nematodeassosierte mikrober, lag en 96 brønnplate med omtrent tre sterile perler med en millimeter diameter og tilsett en blanding av 19,5 mikroliter PCR-buffer og 0,5 mikroliter proteinase K per brønn. Overfør en enkelt vasket nematode til hver brønn med så lite væske som mulig. Bryt opp de overførte nematoder ved hjelp av en perlehomogenisator i tre minutter ved 30 hertz og sentrifuger platene eller rørene ved 8.000 G i 10 sekunder ved romtemperatur for å få væsken til bunnen.For å identifisere C.elegans, varme prøvene i en PCR-syklus i en time ved 50 grader Celsius og 15 minutter ved 95 grader Celsius for å isolere DNA fra individuelle nematoder, eller bruk kommersielle sett for å isolere DNA fra ormpopulasjoner. Frys det isolerte DNA-et ved minus 20 grader Celsius for langtidslagring. Bruk DNA og primerparet NLP 30 fremover og NLP 30 revers og produser et 154 basepar PCR-produkt.For å isolere bakteriene, lag en 96-brønnplate med omtrent tre sterile en millimeter perler, 20 mikroliter M9-buffer per brønn, og pipetter en enkelt vasket nematode til hver brønn med så lite væske som mulig. Bryt opp nematoder som demonstrert før du bruker en perlehomogenisator, etterfulgt av kort sentrifugering av platen for å få væsken til bunnen. Når du er ferdig, samle suspensjonen og fortynn den serielt i en til 10 andel.Plate opptil 100 mikroliter av den fortynnede suspensjonen på ni centimeter agarplater. Deretter inkuberer platene ved 15 til 20 grader Celsius i 24 til 48 timer. For å oppnå den rene bakteriekulturen, velg en enkelt koloni fra den inkuberte platen ved hjelp av en steril løkke eller tannpirker og strek den på en ny agarplate som inneholder det samme agarmediet som ble brukt under rensingen.Sørg for å bare bruke 1/3 av platen. Steriliser deretter en gjenbrukbar løkke eller bruk en ny steril løkke og dra den gjennom den første stripen for å lage en andre strek på en annen 1/3 del av prøveplaten. Gjenta det ved å dra en løkke gjennom den andre streken og opprette den tredje streken for å oppnå enkeltkoloniveksten.Inkuber platen under de samme vekstforholdene som brukes til isolasjon, og gjenta om nødvendig rensetrinnet. Dyrk de rene koloniene i et flytende medium ved å bruke samme temperatur og vekstforhold. Deretter karakteriserer bakteriene ved å trekke ut bakterie-DNA fra rene flytende kulturer som forsterker 16S ribosomal RNA ved hjelp av 27 fremover og 1495 omvendte primere og utfører PCR som beskrevet i teksten.Når de innsamlede frukt- og kompostprøvene ble distribuert i petriskåler og nedsenket i et flytende eller tyktflytende medium, resulterte det i at ormene forlot underlagsmaterialet og svømte til mediets overflate. Mikrobene ble isolert som rene enkeltkolonier, og rensingen spilte en viktig rolle da noen C.elegans-assosierte bakterier kan danne biofilmer eller lett aggregere, noe som resulterer i flerartskulturer. PCR ved hjelp av C.elegans spesifikke primere, nemlig NLP 30 fremover og NLP 30 revers, resulterte i forsterkning av et 154 baseparprodukt for C.elegans.DNA isolert fra enkeltormer resulterte i svake PCR-bånd, mens DNA-ekstraksjon fra ormpopulasjonene bestående av minst 50 ormer ga en større mengde og klarere bånd. Suksessen til C.elegans-spesifikk PCR ble bekreftet ved å kjøre DNA fra en laboratoriestamme, nemlig N2, da en positiv kontroll samtidig med DNA fra de isolerte nematodene Mikrober er overalt. Derfor er det viktig å arbeide under sterile forhold for å sikre at de mikrober som er isolert, virkelig er forbundet med ormen i naturen.De isolerte mikroberene kan brukes til å studere vertsmikrobiota-interaksjoner eller mikroberens rolle på vertsbiologi, for eksempel aldring, utvikling eller immunitet i kontrollerte laboratorieeksperimenter. Mikrober isolert med denne teknikken brukes for tiden av C.elegans-samfunnet for å forbedre forståelsen av mikrobiotadiversitet på vertstrening eller mikroberens rolle på immunitet.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grunnleggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og observasjon

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Bruke RNA-mediert interferens fôringsstrategi til skjerm for gener involvert i Body Size forordning i nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Innsamling, isolasjon og berikelse av naturlig forekommende Magnetotactic Bakterier fra Miljøverndepartementet

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

dyrking av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensjoner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Bruke Caenorhabditis elegans til å screene for vevsspesifikke chaperone interaksjoner

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...