Name: isolation and characterization of the natural microbiota of the model nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-08-17T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Vi erkänner ekonomiskt stöd från den tyska vetenskapsstiftelsen (projekt A1.1 och A1.2 från Collaborative Research Center 1182 om metaorganismernas ursprung och funktion). Vi tackar medlemmarna i Schulenburg-labbet för deras råd och stöd.

1. Förberedelse av buffertar och media
<ol><li>Bered S-buffert genom att tillsätta 5,85 g NaCl, 1,123 gK2HPO4, 5,926 g KH2PO4 och 1 L avjoniserat H2O-kolv och autoklav i 20 minuter vid121°C.</li>
	<li>Bered ett visköst medium genom att tillsätta S-buffert innehållande 1,2% (w/v) hydroximetylcellulosa (ämnet som orsakar viskositet hos mediet), 5 mg/ml kolesterol, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2 och 0,1% (v/v) aceton. Autoklav och...

<ol>
	<li>Schulenburg, H., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+biotic+environment+of+Caenorhabditis+elegans.">The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).</li><li>Petersen, C., Dirksen, P., Prahl, S., Strathmann, E. A., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+Caenorhabditis+elegans+across+1.5+years+in+selected+North+German+locations:+the+importance+of+substrate+type,+abiotic+parameters,+and+Caenorhabditis+competitors.">The prevalence of Caenorhabditis elegans across 1.5 years in selected North German locations: the importance of substrate type, abiotic parameters, and Caenorhabditis competitors.</a> BMC Ecology. 14 (1), 4 (2014).</li><li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Travelling+at+a+slug's+pace:+possible+invertebrate+vectors+of+Caenorhabditis+nematodes.">Travelling at a slug's pace: possible invertebrate vectors of Caenorhabditis nematodes.</a> BMC Ecology. 15 (1), 19 (2015).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+assembly+of+the+native+C.+elegans+microbiome+is+influenced+by+time,+substrate+and+individual+bacterial+taxa.">Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate and individual bacterial taxa.</a> Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+repertoire+contained+within+the+native+microbiota+of+the+model+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans.</a> The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2019).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+effects+of+C.+elegans+protective+natural+microbiota+on+host+physiology.">Exploring effects of C. elegans protective natural microbiota on host physiology.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 775728 (2022).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Watson, E., MacNeil, L. T., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+metabolic+and+gene+regulatory+networks+modulates+the+C.+elegans+dietary+response.">Integration of metabolic and gene regulatory networks modulates the C. elegans dietary response.</a> Cell. 153 (1), 253-266 (2013).</li><li>Watson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+systems+biology+uncovers+metabolites+affecting+C.+elegans+gene+expression+and+life+history+traits.">Interspecies systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits.</a> Cell. 156 (4), 759-770 (2014).</li><li>MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+developmental+acceleration+independent+of+TOR+and+insulin+in+C.+elegans.">Diet-induced developmental acceleration independent of TOR and insulin in C. elegans.</a> Cell. 153 (1), 240-252 (2013).</li><li>O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. -. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurotransmitter+produced+by+gut+bacteria+modulates+host+sensory+behaviour.">A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour.</a> Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).</li><li>Snoek, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-parent+recombinant+inbred+line+population+of+C.+elegans+allows+identification+of+novel+QTLs+for+complex+life+history+traits.">A multi-parent recombinant inbred line population of C. elegans allows identification of novel QTLs for complex life history traits.</a> BMC Biology. 17 (1), 24 (2019).</li><li>Avery, L., Shtonda, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+transport+in+the+C.+elegans+pharynx.">Food transport in the C. elegans pharynx.</a> Journal of Experimental Biology. 206 (14), 2441-2457 (2003).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+delicate+balance+between+bacterial+iron+and+reactive+oxygen+species+supports+optimal+C.+elegans+development.">A delicate balance between bacterial iron and reactive oxygen species supports optimal C. elegans development.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (3), 400-411 (2019).</li><li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+life+in+compost:+temporal+and+spatial+variation+of+North+German+Caenorhabditis+elegans+populations.">Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations.</a> Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).</li><li>F&#233;lix, M. -. A., Duveau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+and+habitat+sharing+of+natural+populations+of+Caenorhabditis+elegans+and+C.+briggsae.">Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae.</a> BMC Biology. 10 (1), 59 (2012).</li><li>Barri&#232;re, A., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+and+linkage+disequilibrium+in+natural+Caenorhabditis+elegans+populations.">Temporal dynamics and linkage disequilibrium in natural Caenorhabditis elegans populations.</a> Genetics. 176 (2), 999-1011 (2007).</li><li>Dolgin, E. S., F&#233;lix, M. -. A., Cutter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hakuna+Nematoda:+genetic+and+phenotypic+diversity+in+African+isolates+of+Caenorhabditis+elegans+and+C.+briggsae.">Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae.</a> Heredity. 100 (3), 304-315 (2008).</li><li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+animal+models+for+microbiome+research.">Simple animal models for microbiome research.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 764-775 (2019).</li><li>Barri&#232;re, A., F&#233;lix, M. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+C.+elegans+and+related+nematodes.">Isolation of C. elegans and related nematodes.</a> WormBook. , 1-19 (2014).</li><li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study.">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+adaptation+and+spatiotemporal+patterns+of+genetic+diversity+revealed+by+repeated+sampling+of+Caenorhabditis+elegans+across+the+Hawaiian+Islands.">Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands.</a> Molecular Ecology. 31 (8), 2327-2347 (2022).</li><li>Haber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+history+of+Caenorhabditis+elegans+inferred+from+microsatellites:+Evidence+for+spatial+and+temporal+genetic+differentiation+and+the+occurrence+of+outbreeding.">Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: Evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding.</a> Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2004).</li><li>Watson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+network+rewiring+of+propionate+flux+compensates+vitamin+B12+deficiency+in+C.+elegans.">Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans.</a> eLife. 5, 17670 (2016).</li></ol>

Nematoden Caenorhabditis elegans är en av de mest intensivt studerade modellorganismerna inom biologisk forskning. Det introducerades av Sydney Brenner på 1960-talet, ursprungligen för att förstå nervsystemets utveckling och funktion29. Sedan dess har C. elegans blivit en kraftfull modell för att studera grundläggande processer inom alla biologiska discipliner, inklusive beteendebiologi, neurobiologi, åldrande, evolutionsbiologi, cellbiologi, utvecklingsbiologi och immuno...

I naturen finns C. elegans vanligtvis i ruttna växtmaterial, särskilt ruttna frukter som äpplen eller på komposthögar1. Det är också förknippat med vissa ryggradslösa värdar som sniglar och skogslök 2,3. Dessa livsmiljöer är rika på mikrober, som inte bara fungerar som mat för masken, men kan också bilda stabila föreningar med den. Information om mångfalden av naturligt associerade mikroorganismer publicerades först 2016 4,5,6. Sedan dess har dessa och bara några nyare studier avslöjat att C. elegans är associerad med en mängd olika bakterier och svampar, oftast inklusive bakterier av släktet Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter och flera andra 6,7,8. Flera associerade bakterier kan stabilt kolonisera masktarmen, men inte alla 6,9,10,11,12. De kommer sannolikt att vara av avgörande betydelse för vår förståelse av C. elegans biologi eftersom de kan ge näring, skydda mot patogener och eventuellt andra stressfaktorer och påverka centrala livshistoriska egenskaper som reproduktionshastighet, utveckling eller beteendemässiga svar.
Som ett exempel kan naturligt associerade isolat av släktena Pseudomonas, Ochrobactrum och även Enterobacter eller Gluconobacter skydda masken från patogeninfektion och dödande på olika sätt 5,6,11,13,14. Ett specifikt isolat av släktet Comamonas påverkar nematodens kostrespons, utveckling, livslängd och fertilitet15,16,17. Providencia-bakterier producerar neuromodulatortyramin och modulerar därmed värdens nervsystemaktivitet och resulterande beteendemässiga svar18. En uppsättning olika naturligt associerade bakterier visade sig påverka befolkningstillväxt, fertilitet och beteendemässiga svar 5,6,9,11,19.
Hittills är den exakta mångfalden och konsistensen hos den inhemska C. elegans-mikrobioten över livsmiljöer och geografiska platser inte helt förstådd, och ytterligare föreningar mellan masken och mikroberna från dess miljö återstår att avslöja. Flera tidigare studier använde bakteriestammar isolerade från någon markmiljö, naturliga C. elegans-livsmiljöer eller från mesokosmexperiment (dvs. laboratoriebaserade miljöer som återskapar naturliga livsmiljöer) med C. elegans laboratoriestammar 4,5,20. Även om dessa studier fick nya insikter om mikrobernas påverkan på specifika nematodegenskaper (t.ex. nematodmetabolism21), är relevansen av dessa interaktioner för C. elegans biologi i naturen oklar. Därför beskriver detta manuskript metoderna för att direkt isolera C. elegans från naturen och att isolera och därefter karakterisera de naturligt associerade mikroberna från både enskilda maskar och grupper av maskar. De beskrivna metoderna är en uppdaterad och förbättrad version av de procedurer som tidigare använts för isolering och karakterisering av naturliga C. elegans och dess ursprungliga mikrobiota 2,6,7. Med tanke på att C. elegans finns i stor utsträckning i sönderdelande växtmaterial över hela världen (särskilt i ruttnande frukter, tempererade regioner och på hösten)1,2,22,23,24,25, kan detta protokoll tillämpas av alla laboratorier när det finns intresse för att relatera C. elegans egenskaper till naturligt associerade mikrober och därmed ett mer naturligt relevant sammanhang. Det senare är avgörande för en fullständig förståelse av nematodens biologi eftersom det är känt från en mångfald av andra värdsystem att den associerade mikrobiotan kan påverka olika livshistoriska egenskaper26, en aspekt som för närvarande till stor del försummas i mängden C. elegans-studier inom nästan alla life science-discipliner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>COMSOL</td>
			<td>COMSOL</td>
			<td></td>
			<td>multiphysics simulation software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of the natural microbiota of the model nematode caenorhabditis elegans

Nematoden Caenorhabditis elegans interagerar med en stor mångfald av mikroorganismer i naturen. I allmänhet finns C. elegans vanligtvis i ruttna växtmaterial, särskilt ruttna frukter som äpplen eller på komposthögar. Det är också förknippat med vissa ryggradslösa värdar som sniglar och trälök. Dessa livsmiljöer är rika på mikrober, som fungerar som mat för C. elegans och som också ihållande kan kolonisera nematoden tarmen. Hittills är den exakta mångfalden och konsistensen hos den inhemska C. elegans-mikrobioten över livsmiljöer och geografiska platser inte helt förstådd. Här beskriver vi ett lämpligt tillvägagångssätt för att isolera C. elegans från naturen och karakterisera maskarnas mikrobiota. Nematoder kan lätt isoleras från kompostmaterial, ruttnande äpplen, sniglar eller lockas genom att placera äpplen på komposthögar. Den bästa tiden för att hitta C. elegans på norra halvklotet är från september till november. Ormar kan tvättas ur uppsamlat substratmaterial genom att nedsänka substratet i buffertlösning, följt av insamling av nematoder och deras överföring till nematodtillväxtmedium eller PCR-buffert för efterföljande analys. Vi illustrerar vidare hur proverna kan användas för att isolera och rena de maskassocierade mikroorganismerna och för att bearbeta maskar för 16S ribosomal RNA-analys av mikrobiotasamhällets sammansättning. Sammantaget kan de beskrivna metoderna stimulera ny forskning om karakterisering av C. elegans-mikrobiotan över livsmiljöer och geografiska platser, vilket bidrar till att få en omfattande förståelse för mångfalden och stabiliteten hos nematodens mikrobiota som grund för framtida funktionell forskning.

Nematoden C. elegans finns ofta i sönderdelande frukter, såsom äpplen, och även kompostprover. I norra Tyskland finns C. elegans samt kongeneriska arter (särskilt C. remanei men även C. briggsae) huvudsakligen från september till2 november. Nematoderna finns oftast i sönderdelande växtmaterial, särskilt ruttnande frukter som äpplen eller päron, och även kompost, särskilt material som visar en hög grad av sönderdelning. Frukt- och kompostproverna ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans är en av de viktigaste modellarterna inom biologi, men nästan all forskning utförs i avsaknad av dess naturligt associerade mikrober. De metoder som beskrivs här kommer att bidra till att förbättra vår förståelse för mångfalden av associerade mikrober som grund för framtida funktionell C. elegans-forskning.

Isolering och karakterisering av den naturliga mikrobiotan i modellen Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Detta protokoll möjliggör nya insikter i den naturliga mikrobiotan hos C.elegans. Samtidigt kan de isolerade mikroberna användas i kontrollerade laboratorieexperiment för att karakterisera mikrobiota-värdinteraktioner och C.elegans-biologi. Detta protokoll fokuserar på att isolera mikrober associerade med C.elegans i naturen, vilket därför är nyckeln till att förstå biologin hos denna viktiga modellvärd i ett mer naturligt sammanhang.Det kommer att vara till hjälp att vara bekant med utseendet på Caenorhabditis jämfört med andra nematoder. Pipetting under dissekeringsomfånget kan initialt vara utmanande, men övning kommer att vara till hjälp. Börja med att samla in miljöprover som kompost eller ruttna frukter i separata plastpåsar, rör eller rena behållare.Sprid bitarna av de insamlade miljöproverna jämnt i en steril nio centimeter tom petriskål och tillsätt cirka 20 ml sterilt visköst medium för att täcka provet med mediet. Under dissekeringsmikroskopet, sök efter Caenorhabditis nematoder enligt riktlinjerna för isolering av Caenorhabditis elegans och relaterade nematoder. Använd en pipett på 20 till 100 mikroliter och samla minsta möjliga mängd vätska som innehåller Caenorhabditis-nematoderna från plattan och överför den till petriskålen på tre centimeter som innehåller en till tre milliliter steril M9T.För att etablera en maskpopulation kan de enskilda maskarna överföras till en tallrik med ett nematodtillväxtmedium eller NGM. För att tvätta nematoderna och ta bort mikroberna som finns utanför nematoderna, inkubera dem i M9T i 10 till 15 minuter. Pipettera ut minsta möjliga mängd vätska som innehåller nematoderna och överför den till en ny steril petriskål på tre centimeter som innehåller en till tre milliliter färsk M9T.För opartisk identifiering av nematodassocierade mikrober, förbered en 96-brunnsplatta med cirka tre sterila pärlor med en millimeterdiameter och tillsätt en blandning av 19,5 mikroliter PCR-buffert och 0,5 mikroliter proteinas K per brunn. Överför en enda tvättad nematod till varje brunn med så lite vätska som möjligt. Bryt upp de överförda nematoderna med hjälp av en pärlhomogenisator i tre minuter vid 30 hertz och centrifugera plattorna eller rören vid 8 000 G i 10 sekunder vid rumstemperatur för att få vätskan till botten.För att identifiera C.elegans, värm proverna i en PCR-cykler i en timme vid 50 grader Celsius och 15 minuter vid 95 grader Celsius för att isolera DNA från enskilda nematoder, eller använd kommersiella kit för att isolera DNA från maskpopulationer. Frys det isolerade DNA vid minus 20 grader Celsius för långvarig lagring. Använd DNA och primerparet NLP 30 framåt och NLP 30 bakåt och producera en 154 baspar PCR-produkt.För att isolera bakterierna, förbered en 96-brunnsplatta med cirka tre sterila en millimeter pärlor, 20 mikroliter M9-buffert per brunn och pipettera en enda tvättad nematod till varje brunn med så lite vätska som möjligt. Bryt upp nematoderna som visats innan du använder en pärlhomogenisator, följt av kort centrifugering av plattan för att få vätskan till botten. När du är klar, samla suspensionen och späd den seriellt i en till 10 andel.Platta upp till 100 mikroliter av den utspädda suspensionen på nio centimeter agarplattor. Inkubera sedan plattorna vid 15 till 20 grader Celsius i 24 till 48 timmar. För att få den rena bakteriekulturen, plocka en enda koloni från den inkuberade plattan med en steril slinga eller tandpetare och stryk den på en ny agarplatta som innehåller samma agarmedium som användes under reningen.Se till att endast använda 1/3 av plattan. Sterilisera sedan en återanvändbar slinga eller använd en ny steril slinga och dra den genom den första strimman för att skapa en andra strimma på en annan 1/3 del av provplattan. Upprepa det genom att dra en slinga genom den andra raden och skapa den tredje raden för att uppnå den enda kolonitillväxten.Inkubera plattan under samma tillväxtförhållanden som används för isolering, och upprepa reningssteget om så krävs. Odla de rena kolonierna i ett flytande medium med samma temperatur och tillväxtförhållanden. Därefter karakteriserar bakterierna genom att extrahera bakterie-DNA från rena flytande kulturer som förstärker 16S ribosomalt RNA med användning av 27 framåt och 1495 omvända primers och utför PCR som beskrivs i texten.När de insamlade frukt- och kompostproverna distribuerades i petriskålar och nedsänktes i ett flytande eller visköst medium resulterade det i att maskarna lämnade substratmaterialet och simmade till mediets yta. Mikroberna isolerades som rena enskilda kolonier och reningen spelade en viktig roll eftersom vissa C.elegans-associerade bakterier kan bilda biofilmer eller lätt aggregera, vilket resulterar i kulturer med flera arter. PCR med hjälp av C.elegans-specifika primers, nämligen NLP 30 framåt och NLP 30 bakåt, resulterade i förstärkning av en 154 basparprodukt för C.elegans.DNA som isolerades från enstaka maskar resulterade i svaga PCR-band, medan DNA-extraktion från maskpopulationerna bestående av minst 50 maskar gav en större mängd och tydligare band. Framgången för C.elegans specifika PCR bekräftades genom att köra DNA från en laboratoriestam, nämligen N2, som en positiv kontroll samtidigt med DNA från de isolerade nematoderna Mikrober finns överallt. Därför är det viktigt att arbeta under sterila förhållanden för att säkerställa att de mikrober som isoleras verkligen är förknippade med masken i naturen.De isolerade mikroberna kan användas för att studera värd-mikrobiotainteraktioner eller mikrobernas roll på värdbiologi, till exempel åldrande, utveckling eller immunitet i kontrollerade laboratorieexperiment. Mikrober isolerade med denna teknik används för närvarande av C.elegans-samhället för att förbättra förståelsen för mikrobiotadiversitet på värdkondition eller mikrobernas roll på immunitet.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stabil Isotopic Profilering av förmedlande Metabola Flux i utvecklingsländer och vuxna Stage Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolering och In vitro Aktivering av Caenorhabditis elegans Spermier

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Mätning Caenorhabditis elegans Livslängd på 96 Tja mikrotiterplattor

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampyriska Isolering av extracellulär vätska från<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basisk<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering och miljöövervakning

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Använda RNA-medierad strategi Interference Matning att screena för gener involverade i kroppsstorlek förordningen i rundmasken<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Insamling, isolering och anrikning av naturligt förekommande Magnetotactic bakterier från miljön

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

odling av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensioner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Använda Caenorhabditis elegans för att screena för vävnadsspecifika förkläde interaktioner

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...