Name: use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة 1R01AI33409 وقسم طب الأطفال ، كلية كارفر للطب ، جامعة أيوا.

<ol>
	<li>Lopes, J. P., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+virulence+of+Candida+albicans.">Pathogenesis and virulence of Candida albicans.</a> Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+control+of+cell+morphology+in+vivo+reveals+distinct+roles+for+yeast+and+filamentous+forms+of+Candida+albicans+during+infection.">Engineered control of cell morphology in vivo reveals distinct roles for yeast and filamentous forms of Candida albicans during infection.</a> Eukaryotic Cell. 2 (5), 1053-1060 (2003).</li><li>Arita, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+associated+proteins+involved+in+filamentation+with+impact+on+the+virulence+of+Candida+albicans.">Cell wall associated proteins involved in filamentation with impact on the virulence of Candida albicans.</a> Microbiological Research. 258, 126996 (2022).</li><li>Rai, L. S., Wijlick, L. V., Bougnoux, M. E., Bachellier-Bassi, S., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+commensal+and+pathogenic+life-styles+of+an+opportunistic+fungus-Candida+albicans.">Regulators of commensal and pathogenic life-styles of an opportunistic fungus-Candida albicans.</a> Yeast. 38 (4), 243-250 (2021).</li><li>Sudbery, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Candida+albicans+hyphae.">Growth of Candida albicans hyphae.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).</li><li>Basso, V., d'Enfert, C., Znaidi, S., Bachellier-Bassi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+genes+to+networks:+The+regulatory+circuitry+controlling+candida+albicans+morphogenesis.">From genes to networks: The regulatory circuitry controlling candida albicans morphogenesis.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 422, 61-99 (2019).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+Candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in Candida species.</a> Elife. 10, 64682 (2021).</li><li>Mitra, S., Dolan, K., Foster, T. H., Wellington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+morphogenesis+of+Candida+albicans+during+infection+in+a+live+animal.">Imaging morphogenesis of Candida albicans during infection in a live animal.</a> Journal of Biomedical Optics. 15 (1), 010504 (2010).</li><li>Wakade, R. S., Huang, M., Mitchell, A. P., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+Candida+albicans+identifies+differential+in+vitro+and+in+vivo+filamentation+phenotypes+for+transcription+factor+deletion+mutants.">Intravital imaging of Candida albicans identifies differential in vitro and in vivo filamentation phenotypes for transcription factor deletion mutants.</a> mSphere. 6 (3), 0043621 (2021).</li><li>Wakade, R. S., Kramara, J., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+filamentation+does+not+require+the+cAMP-PKA+pathway+in+vivo.">Candida albicans filamentation does not require the cAMP-PKA pathway in vivo.</a> mBio. 13 (3), 0085122 (2022).</li><li>Bergeron, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Pseudomonas+aeruginosa+interact+to+enhance+virulence+of+mucosal+infection+in+transparent+zebrafish.">Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa interact to enhance virulence of mucosal infection in transparent zebrafish.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 00475 (2017).</li><li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+and+filaments+have+specialized,+independent+activities+in+a+zebrafish+model+of+Candida+albicans+infection.">Yeast and filaments have specialized, independent activities in a zebrafish model of Candida albicans infection.</a> Infection and Immunity. 86 (10), 00415-00418 (2018).</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 6th edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html">https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html</a> (2020)</li><li>Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotypic+profile+of+the+Candida+albicans+regulatory+network.">A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network.</a> Plos Genetics. 5 (12), 1000783 (2009).</li><li>Cullen, P. J., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+filamentous+growth+in+yeast.">The regulation of filamentous growth in yeast.</a> Genetics. 190 (1), 23-49 (2012).</li><li>Herrero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+filament+formation+in+Candida+albicans+by+polyamine+levels.">Control of filament formation in Candida albicans by polyamine levels.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4870-4878 (1999).</li><li>Ahmad Hussin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+auxotrophy+and+biotin+enhanced+germ+tube+formation+in+Candida+albicans.">Biotin auxotrophy and biotin enhanced germ tube formation in Candida albicans.</a> Microorganisms. 4 (3), 37 (2016).</li><li>Nantel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+profiling+of+Candida+albicans+cells+undergoing+the+yeast-to-hyphal+transition.">Transcription profiling of Candida albicans cells undergoing the yeast-to-hyphal transition.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3452-3465 (2002).</li><li>Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strains+and+strategies+for+large-scale+gene+deletion+studies+of+the+diploid+human+fungal+pathogen+Candida+albicans.">Strains and strategies for large-scale gene deletion studies of the diploid human fungal pathogen Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 4 (2), 298-309 (2005).</li><li>Glazier, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EFG1,+Everyone's+favorite+gene+in+Candida+albicans:+A+comprehensive+literature+review.">EFG1, Everyone's favorite gene in Candida albicans: A comprehensive literature review.</a> Frontiers in Cellular Infection and Microbiology. 12, 855229 (2022).</li><li>Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+and+diverse+regulation+of+the+Ras/cAMP/protein+kinase+A+pathway+in+Candida+albicans.">Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Chaturvedi, A. K., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+genetically+engineered+strain+to+evaluate+the+pathogenic+potential+of+yeast+cell+and+filamentous+forms+during+Candida+albicans+systemic+infection+in+immunodeficient+mice.">Use of a genetically engineered strain to evaluate the pathogenic potential of yeast cell and filamentous forms during Candida albicans systemic infection in immunodeficient mice.</a> Infection and Immunity. 76 (1), 97-102 (2008).</li><li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth.">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryotic Cell. 10 (7), 932-944 (2011).</li><li>Brothers, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase-driven+phagocyte+recruitment+controls+Candida+albicans+filamentous+growth+and+prevents+mortality.">NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003634 (2013).</li><li>Holmes, H., Kennedy, J. C., Pottier, R., Rossi, R., Weagle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recipe+for+the+preparation+of+a+rodent+food+that+eliminates+chlorophyll-based+tissue+fluorescence.">A recipe for the preparation of a rodent food that eliminates chlorophyll-based tissue fluorescence.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B: Biology. 29 (2-3), 199 (1995).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

يستخدم هذا النموذج الفحص المجهري متحد البؤر للحصول على صور لكائنات C. albicans أثناء نموها داخل أنسجة مضيف الثدييات ، مما يسمح لنا بتقييم الأنماط الظاهرية للتشكل أثناء العدوى النشطة. تعتبر عملية التشكل أساسية لتسبب C. albicans وقد تمت دراستها على نطاق واسع باستخدام مجموعة متنوعة من المقايسات في المختبر 2،3،4. ومع ذلك ، لا يمكن لأي مقايسة في المختبر أن نمذجة البيئة البيوكيميائية والهيكلية المعقدة للمضيف بشكل كامل.
يركز البروتوكول الموصوف هنا على استخدام نظام التصوير في الجسم الحي لفحص سلسلة / مكتبة من طفرات C. albicans لتحديد الجينات المشاركة في التشكل أثناء العدوى. يسمح لنا استخدام سلالات C. albicans التي تعبر عن بروتينات فلورية مختلفة بتحديد التشكل في الجسم الحي لسلالات C. albicans الطافرة مقارنة بسلالات السلالة المرجعية. إن مقارنة التشكل في الطفرة بالسلالة المرجعية داخل نفس منطقة العدوى تضمن تعرض الكائنات الحية لبيئات متطابقة. وهذا يسمح بالقياس الكمي للنسبة المئوية للخلايا التي تخضع للخيوط ، وكذلك مدى الخيوط. يسمح لنا تطبيع قياسات سلالة (سلالات) الطفرة بقياسات السلالة المرجعية بمقارنة أداء طفرة بأخرى بشكل أفضل.
توضح النتائج التمثيلية المقدمة هنا إمكانية وجود تباين كبير بين الأنماط الظاهرية في المختبر وفي الجسم الحي . غالبا ما تستخدم سلالة C. albicans efg1ΔΔ الطافرة كعنصر تحكم سلبي في فحوصات التشكل لأنها تفشل في الخيوط في جميع الظروف المختبرية تقريبا20. على الرغم من أن النتائج في الجسم الحي كانت مشابهة جدا للنتائج في المختبر ، حتى هذه السلالة المعوقة بشدة شكلت أحيانا خيوطا في بيئة الأنسجة المضيفة (الشكل 3). هذا يؤكد على قوة البيئة المضيفة في تحفيز التشكل.
في المقابل ، تظهر سلالة cyr1ΔΔ الطافرة تنافرا كبيرا بين النمو في المختبر والنمو في الجسم الحي. على الرغم من عدم خضوع أي من الخلايا الطافرة للخيوط في المختبر ، إلا أن نصف الخلايا تقريبا تنمو كخيوط في الجسم الحي (الشكل 4) 10,21. ومن المثير للاهتمام أن هذه الخيوط كانت أقصر بكثير من تلك التي شكلتها السلالة المرجعية ، مما يشير إلى أن CYR1 يساهم إما في معدل نمو الفتيل أو القدرة على الحفاظ على النمط الظاهري الخيطي. لتسهيل تحليل طول الفتيل ، تم قياس طول مسار منحنى الخيوط باستخدام إسقاط ثنائي الأبعاد للصور. في الإسقاطات ثنائية الأبعاد للخيوط التي تنمو في ثلاثة أبعاد ، فإن أي خيط ينمو على محور غير مواز للمستوى xy سيبرز أقصر من طوله الحقيقي. نظرا لأن هذا التقصير المسبق يحدث أيضا للسلالة المرجعية ، فإن تقييم توزيع أطوال الخيوط في إسقاط ثنائي الأبعاد لا يزال يسمح بإجراء مقارنة كمية بين السلالات المرجعية والمتحولة. يتطلب تحليل طول الفتيل في بعدين بدلا من ثلاثة أبعاد تحليلا أقل كثافة للصورة ؛ وبالتالي ، يمكن إجراؤه بسرعة نسبيا على كمبيوتر سطح مكتب نموذجي. يسمح استخدام هذا التحليل الأبسط بإدراج توزيع طول الخيوط كجزء من بروتوكول الفحص ، مما يعطي فهما أكثر دقة لقدرة كل متحولة على الخضوع للتشكل دون التسبب في تأخيرات كبيرة في الإنتاجية.
تم إجراء الدراسات التمثيلية المقدمة هنا باستخدام الفئران DBA2 / N ، والتي لديها عيب في نظامها المكمل مما تسبب في فشل تجنيد العدلات إلى موقع عدوى C. albicans 22. كان الهدف من هذه الدراسات هو التحقيق في آليات تنظيم خيوط C. albicans داخل الأنسجة المضيفة. لذلك تم استخدام الفئران DBA2 / N لتجنب إرباك النتائج بسبب حساسية سلالة فردية أو مقاومة للعدلات. نظرا لأن استجابة العدلات المضادة ل C. albicans يمكن أن تؤثر على الخيوط23 ، فإن تجنيد العدلات إلى موقع العدوى يمكن أن يؤثر على نتائج فحص التشكل. إذا كانت السلالة قادرة على الخيوط في الجسم الحي ولكن يتم تثبيطها بشدة من الخيوط عند وجود العدلات ، اكتشاف الخيوط في الفئران DBA2 / N ولكن من غير المحتمل رؤيتها عند استخدام الفئران ذات الانجذاب الكيميائي العدلات السليم. وبالتالي ، فإن إجهاد الماوس المستخدم كمضيف هو عامل مهم عند استخدام هذا البروتوكول.
من غير المرجح أن تكون ملاحظة أن السلالة الطافرة efg1ΔΔ تفشل في الخيوط في الجسم الحي مرتبطة باستجابات العدلات المضيفة ، لأن هذه السلالة تفشل أيضا في الخيوط في المختبر. الفتيل الذي لوحظ في الجسم الحي مع سلالة cyr1ΔΔ يتعارض مع فشله في الخيوط في المختبر. تشير البيانات من نموذج الزرد لعدوى C. albicans إلى أن العدلات المستجيبة مهمة في الوقاية من التشكل24. لذلك ، من غير المرجح أن يفسر استخدام فئران DBA2 / N ، التي تفتقر إلى استجابات العدلات ، الزيادة في خيوط cyr1ΔΔ في الجسم الحي مقارنة بالمختبر. ومع ذلك ، فإن البيئة في الجسم الحي تؤثر بوضوح على تشكل سلالة cyr1ΔΔ. وبالتالي ، قد يوفر مزيد من التحقيق في هذه السلالة معلومات مهمة حول تنظيم تشكل C. albicans أثناء العدوى النشطة. تم تصميم البروتوكول الموصوف هنا كاختبار فحص لتحديد سلالات مثل سلالة cyr1ΔΔ لاستخدامها في الدراسات المستقبلية.
يعد استخدام نظام تخدير الغاز منخفض التدفق مفيدا جدا لهذا البروتوكول (الشكل 1 أ ، ب). خلال التطوير الأولي لهذا البروتوكول ، تم تخدير الفئران باستخدام كوكتيل مخدر عن طريق الحقن من الكيتامين الممزوج بالزيلازين. في حين أنه كان من الممكن إجراء تصوير محدود باستخدام طريقة التخدير هذه ، إلا أن مدة التخدير كانت غير متوقعة ، مما يتطلب إنهاء جلسات التصوير بسرعة لتجنب تعافي الفأر من التخدير أثناء التصوير. أنظمة التخدير التقليدية المستنشقة ضخمة وتتطلب معدلات عالية من تدفق غازات التخدير ، وغالبا ما تتطلب استخدامها داخل غطاء الدخان. وبالتالي ، سيكون من الصعب جدا استخدام أنظمة التخدير المستنشقة التقليدية مع قيود المساحة للمجهر متحد البؤر دون تعريض الباحثين عن غير قصد لعوامل التخدير. يسمح استخدام نظام التخدير المستنشق منخفض التدفق بتخدير ثابت للحيوان مع الحفاظ على بيئة آمنة للمحقق. يسمح المخروط ذو التدفق المنخفض بتحديد موقع الحيوان بسهولة لكل من التلقيح والفحص المجهري. يسمح أنبوب التوصيل ذو العيار الصغير والحجم المنخفض باستخدام أنابيب طويلة نسبيا ، مما يتيح وضع آلة التخدير على مسافة كافية حتى لا تتداخل مع الفحص المجهري.
يؤدي الكلوروفيل الموجود في تشاو الفأر النموذجي إلى تألق ذاتي كبير للأنسجة25. هذا يخلق ضوضاء كبيرة في الصور ، مما يجعل من الصعب الحصول على صور عالية الجودة وعالية الدقة المكانية. عندما تم تغذية الحيوانات بالكلوروفيل الخالي من الكلوروفيل لمدة 7 أيام قبل التصوير ، انخفضت الخلفية من التألق الذاتي بشكل كبير في الأنسجة ، لكن الكلوروفيل المترسب في الشعر ظل يمثل مشكلة. إزالة الشعر على الصيوان باستخدام كريم مزيل الشعر الكيميائي الذي لا يحتاج إلى وصفة طبية فعال في تقليل التألق الذاتي في الشعر (الشكل 1C ، D). وبالتالي ، فإن الجمع بين تشاو الخالي من الكلوروفيل وإزالة الشعر الكافية قلل بشكل كبير من التألق الذاتي وحسن جودة الصورة بشكل كبير. نظرا لإزالة الشعر من الأذن قبل التصوير ، فإن لون شعر الحيوان لا يؤثر على هذا النظام. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لدراسة عدوى C. albicans في الفئران BALB / c (أبيض) و C57BL / 6 (أسود) و DBA2 / N (بني). يمكن أيضا استخدام البروتوكول مع فئران خروج المغلوب C57BL / 6 التي تعاني من نقص في جينات مضيفة مختلفة. سيسمح ذلك بإجراء تحقيقات مستقبلية حول كيفية تأثير الجهاز المناعي المضيف للثدييات على الخيوط. إحدى ميزات هذا النموذج التي لم تتم مناقشتها في هذا البروتوكول هي أنه نظرا لأن نظام التصوير هذا غير جراحي ، يمكن تصوير نفس الحيوان بشكل متكرر على مدار عدة أيام ، مما يسمح بمتابعة تقدم العدوى الفردية بمرور الوقت. من المحتمل أن تلعب هذه الميزة دورا رئيسيا في الدراسات المستقبلية حول التفاعل بين المضيف وممرض.
باختصار ، ينتج عن هذا البروتوكول صور عالية الدقة المكانية ل C. albicans تنمو في أنسجة مضيف ثديي حي ، مما يسمح بتقييم دقيق للتشكل في السلالات الطافرة8،9،10. توضح النتائج المقدمة هنا كيف يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص مكتبة من طفرات C. albicans. من بين طفرات C. albicans التي تم اختبارها حتى الآن ، يخضع جزء كبير من الطفرات ذات العيوب المعروفة في التشكل في المختبر بسهولة للخيوط في الجسم الحي 9,10. هذا يسلط الضوء على أهمية تضمين نظام في الجسم الحي مثل هذا النظام في التجارب المصممة لتوضيح آليات التسبب في C. albicans.

المبيضات البيض هو أحد مسببات الأمراض الفطرية البشرية الشائعة ، مما يسبب أمراض الجلد المخاطي ، والأمراض المنتشرة ، والتهابات الأنسجة الموضعية1. السمة الرئيسية لفسيولوجيا C. albicans هي نموها المعقد متعدد الأشكال ، والذي يرتبط بدوره كعامل ممرضوممرض 2،3،4. في ظل ظروف المغذيات الغنية في المختبر عند 30 درجة مئوية ، تنمو عادة كخميرة بيضاوية الشكل. تؤدي مجموعة متنوعة من المحفزات البيئية ، بما في ذلك الحرمان من المغذيات ، وتغيرات الأس الهيدروجيني ، والنمو عند 37 درجة مئوية ، والتعرض للمصل ، والنمو عند تضمينه في أجار ، إلى الانتقال إلى نمط نمو مستقطب ، مما يؤدي إلى تكوين خيوط حقيقية و / أو خيوط كاذبة5. يشار إلى بدء النمو المستقطب والنمو الناتج للكائنات الخيطية باسم التشكل.
نظرا لأهمية التشكل في ضراوة الكائن الحي ، فقد تمت دراسة تنظيم تكوين hyphal على نطاق واسع 6,7. هناك شبكة معقدة من مسارات الإشارات وتنظيم النسخ الذي يؤدي إلى التشكل. على الرغم من علاقة تشكل C. albicans مع التسبب في المرض ، فقد استخدمت معظم الدراسات التي تبحث في التشكل المحفزات في المختبر لتحفيز تكوين hyphal. أصبح من الواضح بشكل متزايد أن النماذج المختلفة في المختبر للخيوط ليست متطابقة من حيث المسارات التنظيمية الفردية المحفزة. علاوة على ذلك ، لا تتوافق ظروف النمو في المختبر بإحكام مع البيئة المعقدة للمضيف. نظرا لأهمية C. albicans كممرض بشري ، فإن الهدف من هذا البروتوكول هو التحقيق في مورفها أثناء العدوى النشطة في مضيف الثدييات باستخدام نظام ذو إنتاجية معتدلة ، مما يسمح للمحقق بفحص مكتبات C. albicans الطافرة.
لتسهيل هذه التحقيقات ، تم تطوير نظام تصوير في الجسم الحي يسمح لنا بالحصول على صور عالية الدقة المكانية لخلايا C. albicans أثناء إصابة صيوان فأر مخدر باستخدام مجهر متحد البؤرمقلوب 8،9،10. نظرا لأن جلد الصيوان رقيق جدا ، يمكن الحصول على هذه الصور دون الحاجة إلى تشريح الأنسجة. وبالتالي ، يمكن قياس بيانات النمط الظاهري الكمي في موقع العدوى النشطة داخل الأنسجة المضيفة. يتضمن البروتوكول الموصوف هنا تحويل سلالة مرجعية وسلالة متحولة واحدة أو أكثر مع أشرطة تعبير بروتين فلوري مختلفة11,12. ثم يتم خلط السلالات المعبرة عن البروتين الفلوري وحقنها بشكل مشترك داخل الأدمة. بعد إنشاء العدوى ، يتم استخدام التصوير متحد البؤر لتحديد كل من تواتر الخيوط وطول الخيوط المشكلة. يتم تطبيع البيانات التي تم الحصول عليها من السلالات الطافرة إلى تلك التي تم الحصول عليها من السلالة المرجعية ، الموجودة في نفس منطقة الأنسجة ، وبالتالي توفير التحكم الداخلي. سمح لنا هذا النظام بفحص عدة سلاسل من سلالات C. albicans الطافرة بنجاح ، والعديد منها به عيوب في التشكل في المختبر 9,10. العديد من هذه السلالات خيوط بسهولة في الجسم الحي ، مما يسلط الضوء على أهمية النماذج في الجسم الحي للتحقيق في التشكل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 coverslips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>20811</td>
			<td>large enough to cover the universal stage opening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 mL Insulin syringes</td>
			<td>EXELint</td>
			<td>26018</td>
			<td>Can use syringes that are 5/16&#34;&#8211;1/2&#34; long and 29&#8211;32 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.7% formaldehyde in dPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBJ5734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol/30% water</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>A05061001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.albicans reference strain and experimental strains</td>
			<td>SN250</td>
			<td>FGSC Online Catalog</td>
			<td>The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyl free mouse chow</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2920x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7050</td>
			<td>Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicator</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>76200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBA2/N (6-12 week old mice)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.&#160; The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.&#160; This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.&#160; It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.&#160; 
			Examples:&#160; 
			https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-40 
			https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174320&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-26 
			https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Must be sterile; open a new container for every experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze pad</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>P157112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel eye lurbicant</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ or FIJI analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ (FIJI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>J119005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8 (SP8)</td>
			<td>The objective lens&#160; (Leica 11506375) used here&#160; is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. 
			The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free&#160; spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. 
			The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific International</td>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair hair remover lotion</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Over the counter depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AB-101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent protein expression transformation constructs&#160; generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensitive laboratory tape</td>
			<td>Tape &#38; Label Graphic Systems Inc</td>
			<td>1007910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 cell culture medium</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>To safely hold the animals ear during injectinos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host

المبيضات البيض هو أحد مسببات الأمراض البشرية الهامة. قدرتها على التبديل بين الأشكال المورفولوجية أمر أساسي لمرضها. يتم تنظيم هذه التغييرات المورفولوجية من خلال شبكة إشارات معقدة يتم التحكم فيها استجابة للمحفزات البيئية. تمت دراسة هذه المكونات التنظيمية بشكل كبير ، ولكن جميع الدراسات تقريبا تستخدم مجموعة متنوعة من المحفزات في المختبر لتحفيز الخيوط. لتحديد كيفية تنظيم التشكل أثناء عملية التسبب في المرض ، قمنا بتطوير نظام الفحص المجهري في الجسم الحي للحصول على صور عالية الدقة المكانية للكائنات الحية التي تخضع لتكوين hyphal داخل مضيف الثدييات. يصف البروتوكول المقدم هنا استخدام هذا النظام لفحص مجموعات صغيرة من سلالات C. albicans الطافرة ، مما يسمح لنا بتحديد المنظمين الرئيسيين للتشكل عند حدوثه في موقع الإصابة. يتم تقديم نتائج تمثيلية ، مما يدل على أن بعض منظمات التشكل ، مثل منظم النسخ Efg1 ، لها أنماط ظاهرية متسقة في المختبر وفي الجسم الحي ، في حين أن المنظمين الآخرين ، مثل adenyl cyclase (Cyr1) ، لديهم أنماط ظاهرية مختلفة بشكل كبير في الجسم الحي مقارنة بالمختبر.

تستند النتائج المقدمة هنا إلى التقارير المنشورة سابقا 9,10. الهدف من هذا التحليل هو إجراء تقييم كمي لقدرة سلالات C. albicans الطافرة على الخضوع للتشكل أثناء العدوى النشطة. قد يكون من الصعب تقييم المعلمات النموذجية التي تميز الخيوط الكاذبة عن الخيوط الفطرية في الكائنات الحية التي تنمو في ثلاثة أبعاد في بيئة معقدة في الجسم الحي. هذا صحيح بشكل خاص عند النظر إلى المقاطع العرضية ثنائية الأبعاد التي تم إنشاؤها بواسطة التصوير البؤري. ومن ثم، يركز تحليل الفحص هذا على تحديد الكائنات الحية التي تنمو في صورة خيطية مقابل خميرة. بالنسبة لدراسات المتابعة باستخدام تحليل أكثر تعمقا ، بما في ذلك إعادة البناء ثلاثية الأبعاد ، يمكن تكييف هذه الطريقة لتمييز الخميرة والخيوط والخيوط الزائفة.
يسمح التعبير عن بروتين فلوري في سلالة مرجعية أو متحولة من C. albicans بالكشف المباشر عن مورفولوجيا الإجهاد في الجسم الحي (الشكل 3 والشكل 4). بشكل عام ، من الأفضل إجراء تحليل المجهر الضوئي الكمي عندما يكون عدد قليل من وحدات البكسل في الصورة مشبعا. بالنسبة لهذا البروتوكول ، غالبا ما يؤدي تشبع الصورة إلى تبسيط التحليل. توطين البروتين الفلوري ليس موحدا في جميع أنحاء الخلية وغالبا ما يكون أعلى في الخميرة الأم منه في خيوط. لحسن الحظ ، بالنسبة للتحقيق في التشكل ، فإن التوزيع المكاني للإشارة ، وليس شدتها ، يحدد النتيجة. لذلك ، فإن الحصول على الصور التي يتم فيها تشبع العديد من وحدات البكسل يحسن القدرة على تحديد التشكل في هذا الفحص.
لتوضيح أهمية تقييم التشكل في الجسم الحي ، يتم تقديم نتائج تمثيلية للسلالة المرجعية (SN250) واثنين من الطفرات: أحدهما يفتقر إلى عامل النسخ Efg1 والآخر يفتقر إلى adenylyl cyclase Cyr1. في المختبر ، لا تنمو أي من هذه السلالات كخيوط20,21. عندما تزرع في المختبر في وسط RPMI المكمل بمصل 10٪ ، فإن السلالة المرجعية تشكل خيوط بسرعة ، في حين أن سلالات efg1ΔΔ و cyr1ΔΔ لا تفعل ذلك (الشكل 3 والشكل 4). في ظل هذه الظروف ، يظهر الطافر efg1ΔΔ نموا مستقطبا إلى حد ما ، حيث تكون الخلايا الابنة ممدودة قليلا مقارنة بالخلايا الأم. هذا يؤكد على أهمية استخدام تعريف واضح للخيوط. أي تعريف من هذا القبيل هو تعسفي بشكل افتراضي ، لكنه ضروري لإجراء تقييم متسق للنمط الظاهري. بالنسبة لهذه الدراسات ، يتم تعريف نمط النمو الخيطي على أنه كائن حي له أطول بعد لخلية ابنة أكثر من ضعف أبعاد الخلية الأم. باستخدام هذا التعريف ، فإن خلايا efg1ΔΔ الممدودة ليست خيطية.
تمشيا مع النمط الظاهري في المختبر ، يظهر efg1 ΔΔ عيبا كبيرا في خيوط الجسم الحي: ما يقرب من 9 ٪ من خلايا efg1ΔΔ نمت كخيوط في الجسم الحي (الشكل 3). في المقابل ، نمت 53٪ من الخلايا الطافرة cyr1ΔΔ كخيوط في الجسم الحي (الشكل 4). على الرغم من أن عدد الخلايا الطافرة cyr1 ΔΔ التي تخضع للخيوط في الجسم الحي كان أقل بكثير من السلالة المرجعية ، فإن قدرة متحولة cyr1ΔΔ على تكوين خيوط في الجسم الحي تمثل تغييرا كبيرا عن افتقارها التام إلى التشكل في المختبر. بصريا ، بدت الخيوط التي شكلتها طفرة cyr1ΔΔ أقصر من السلالة المرجعية. لتقييم هذا كميا ، تم قياس طول مسار المنحنى للخلايا الخيطية باستخدام إسقاط ثنائي الأبعاد للصور في الجسم الحي (الشكل 4E). كان متوسط طول خيوط cyr1ΔΔ أقصر بنسبة 29٪ من خيوط السلالة المرجعية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg"> الشكل 1: التخدير والتلقيح. أ: تحريض التخدير باستخدام غرفة الحث. (ب) يتم الحفاظ على التخدير باستخدام مخروط الأنف ، مما يسمح بإعادة وضع الماوس حسب الحاجة. (ج) يوضع كريم إزالة الشعر باستخدام قضيب ذو رأس قطني. تم تطبيق جل تزييت العين لحماية العينين أثناء التخدير. (د) إزالة الشعر الفعال للأذن اليمنى. قارن مع الأذن اليسرى غير المعالجة. (ه) حقن المطثية البيض داخل الأدمة في أذن الفأر. يتم تثبيت الأذن في مكانها باستخدام طرف أنبوب مخروطي ملفوف بشريط جلدي على الوجهين (شريط أزياء). (و) لقطة مقربة للحقن داخل الأدمة. تتشكل فقاعة شاحبة في الجلد ، وهي علامة على نجاح التنسيب داخل الأدمة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg"> الشكل 2: التحضير للتصوير. (أ) مرحلة المجهر المعدة للتصوير. يتم تأمين مخروط أنف التخدير في مكانه. يتم لصق غطاء على المسرح الذي يغطي فتحة العدسة. تتوفر قطع إضافية من الشريط. يتم تسخين المرحلة الساخنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية (غير معروضة). ب: وضع الفأر المخدر في مخروط أنف التخدير. (ج) يتم تدوير الماوس قليلا بحيث يكون جانب الأذن الذي تم تلقيحه متجها نحو الغطاء السفلي / العدسة الموضوعية. ثم يتم تسطيح الأذن مقابل الغطاء السفلي وتثبيتها في مكانها عن طريق وضع غطاء ثان أعلى الأذن. (د) يتم لصق الغطاء العلوي على المسرح لتثبيت الأذن في مكانها بالنسبة لمرحلة المجهر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg"> الشكل 3: مورفولوجيا في المختبر وفي الجسم الحي للسلالة الطافرة efg1ΔΔ. (أ) صورة واسعة المجال لسلالات WT و efg1ΔΔ الطافرة بعد تحريض الخيوط في المختبر عن طريق نمو الخلايا في RPMI + مصل 10٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. تمثل قضبان المقياس 10 ميكرومتر. تم ضبط تباين الصورة باستخدام برنامج تحرير الصور لتسهيل المشاهدة. (ب) النسبة المئوية للخيوط في المختبر التي لوحظت في سلالات WT و efg1ΔΔ الطافرة. Und = غير قابل للكشف (لم يتم اكتشاف أي خيوط). يمثل ارتفاع الشريط النسبة المئوية المتوسطة للخلايا الخيطية من ثلاث تجارب مستقلة حيث تم تحديد كمية 100 خلية على الأقل. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (مقارنة النتائج باختبار t للطالب ، p < 0.001). (C) صورة مجهرية متحدة البؤر ل WT (أخضر) ومتحولة EFG1ΔΔ (حمراء) تنمو في الجسم الحي بعد 24 ساعة من التلقيح. تشير الأسهم إلى أمثلة على الخلايا الطافرة efg1ΔΔ التي تلبي تعريفنا ل "الخيطية". يمثل شريط المقياس 50 ميكرومتر. (د) النسبة المئوية للخيوط في الجسم الحي التي لوحظت في سلالات WT و efg1ΔΔ الطافرة. يمثل ارتفاع الشريط النسبة المئوية المتوسطة للخلايا الخيطية من تجربتين مستقلتين. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (مقارنة النتائج باختبار t للطالب ، p < 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg"> الشكل 4: مورفولوجيا في المختبر وفي الجسم الحي للسلالة الطافرة cyr1 ΔΔ. (أ) صورة واسعة المجال للسلالة الطافرة cyr1ΔΔ بعد تحريض الخيوط في المختبر عن طريق نمو الخلايا في RPMI + مصل 10٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. يمثل شريط المقياس 10 ميكرومتر. تم ضبط تباين الصورة باستخدام برنامج تحرير الصور لتسهيل المشاهدة. (ب) النسبة المئوية للخيوط في المختبر التي لوحظت في سلالات WT و cyr1ΔΔ الطافرة. Und = غير قابل للكشف (لم يتم اكتشاف أي خيوط). يمثل ارتفاع الشريط النسبة المئوية المتوسطة للخلايا الخيطية من ثلاث تجارب مستقلة حيث تم تحديد كمية 100 خلية على الأقل. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (مقارنة النتائج باختبار t للطالب ، p < 0.001). (C) صورة مجهرية متحدة البؤر ل WT (أخضر) ومتحولة cyr1ΔΔ (حمراء) تنمو في الجسم الحي بعد 24 ساعة من التلقيح. يمثل شريط المقياس 50 ميكرومتر. (د) النسبة المئوية للخيوط في الجسم الحي التي لوحظت في سلالات WT و cyr1ΔΔ الطافرة. يمثل ارتفاع الشريط النسبة المئوية المتوسطة للخلايا الخيطية من تجربتين مستقلتين. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (مقارنة النتائج باختبار t للطالب ، p < 0.001). (ه) توزيع طول الفتيل في الجسم الحي ، كما تم قياسه بطول مسار المنحنى في إسقاط ثنائي الأبعاد لمكدس z. تمثل كل نقطة طول خيط واحد. لم يتم تضمين الخلايا التي تنمو كخميرة في هذا التحليل. يشير الشريط إلى متوسط طول الفتيل. يختلف توزيع الأطوال اختلافا كبيرا عند تحليلها باستخدام اختبار Mann-Whitney U (p < 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

تصف هذه المخطوطة طريقة لفحص مكتبات المبيضات المبيضات المتحولة متوسطة الحجم بحثا عن الأنماط الظاهرية للتشكل أثناء العدوى النشطة في مضيف الثدييات باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر غير الغازي.

استخدام التصوير في الجسم الحي للكشف عن الأنماط الظاهرية للتشكل في سلالات المبيضات البيض الطافرة أثناء العدوى النشطة في مضيف الثدييات

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

يتم تشغيل تشكل المبيضات البيض من خلال عدد لا يحصى من الإشارات البيئية. من خلال دراسة التشكل في الجسم الحي ، نحدد كيف يتكامل الكائن الحي مع كل هذه الإشارات البيئية ويستجيب لها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بدراسة التشكل في غياب التحيز أو القطع الأثرية التي يمكن إدخالها باستخدام أنظمة النماذج في المختبر.عدد قليل جدا من الناس لديهم خبرة في الحقن داخل الأدمة. أوصي بشدة أن يقوم شخص جديد على هذه التقنية بالاتصال بالطبيب البيطري للموارد الحيوانية للمساعدة في تعلمها. سيتم توضيح الإجراء روهان واكادي ، زميل ما بعد الدكتوراه من مجموعة مختبراتنا.ابدأ بإعداد الحيوان للتلقيح عن طريق إطعام تشاو خال من الكلوروفيل لمدة سبعة أيام على الأقل قبل التلقيح. قبل يوم واحد من الحقن ، خذ القليل من خلايا كندا البيض من مستعمرة واحدة باستخدام مسواك. تلقيح 25 ملليلتر من YPD وكرر هذه العملية عدة مرات للحصول على خلايا من عدة مستعمرات مختلفة.احتضان الاستزراع طوال الليل عند 30 درجة مئوية في حاضنة شاكر مدارية بسرعة 175 دورة في الدقيقة. جهاز طرد مركزي ملليلتر واحد من الثقافة لمدة دقيقتين عند 500 × جم ، ثم اغسل الخميرة ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من DPBS المعقمة. أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من DPBS المعقم وقم بتخفيف الثقافة من 1 إلى 100.عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وبالتالي ضبط كثافة الخلية. بعد ذلك ، قم بإنشاء اللقاح للحقن عن طريق خلط كميات متساوية من السلالة المشار إليها والتجريبية. باستخدام مسحة قطنية ، ضع كريم مزيل الشعر الذي لا يحتاج إلى وصفة طبية بحرية على السطح الداخلي والخارجي لكلتا أذني مخدر.بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، امسح الأذن برفق بشاش جاف متبوعا بضمادات شاش مشبعة بالماء المعقم لإزالة بقايا كريم مزيل الشعر تماما. بعد تعقيم سطح الأذنين بنسبة 70٪ من الإيثانول ، امزج اللقاح جيدا عن طريق قلب القارورة عدة مرات أو دوامتها. ارسم 20 إلى 30 ميكرولترا من اللقاح في حقنة الأنسولين.أمسك الإبرة في الوضع الرأسي واضغط على المحقنة برفق للتأكد من أن أي هواء في البرميل في الأعلى. أخرج الهواء واللقاح الزائد بعناية مرة أخرى إلى أنبوب اللقاح أو أنبوب النفايات بحيث يكون المكبس عند علامة 10 ميكرولتر. ضع الشريط الجلدي على الوجهين على أنبوب بلاستيكي صغير مخروطي أو مستدير القاع وقم بثني الأذن عبر الشريط ، وتجنب إزاحة مخروط أنف التخدير.الحفاظ على إبرة المحقنة موازية تقريبا للجلد وتجنب أي عروق كبيرة ، أدخل طرف الإبرة في الطبقة الخارجية من الجلد حتى يتم تغطية شطبة فقط وحقن اللقاح ببطء داخل الأدمة. الحقن الجيد داخل الأدمة سيرفع فقاعة صغيرة في الجلد. حافظ على الإبرة في مكانها لمدة 15 إلى 20 ثانية قبل إزالتها من الأذن لتقليل التسرب.باتباع البروتوكولات المؤسسية ، ضع علامة على القفص بملصقات بيولوجية تشير إلى أن الحيوانات الموجودة في القفص مصابة بالمبيضات البيض. باستخدام نفس المزارع المغسولة التي تم استخدامها لإعداد اللقاح ، قم بإنشاء تخفيف من 1 إلى 50 من الخلايا في RPMI 1640 ، مع استكماله بحرارة 10٪ ومصل بقري جنيني منشط واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع الهبوط لمدة أربع ساعات. افحص العينة باستخدام المجهر.عد ما لا يقل عن 100 خلية ، وسجل عدد الخميرة والخلايا الخيطية لكل سلالة. قم بتدوير هدف مسافة العمل الطويلة في مكانه وضع قطرة من سائل الغمر على العدسة. اخفض العدسة لتجنب التلف المحتمل عند وضع الغطاء المنزلق.ضع الغطاء رقم 1.5 فوق فتحة المسرح وقم بتثبيته في مكانه. ارفع الهدف بحيث يكون سائل الغمر ملامسا لكل من العدسة الشيئية وانزلاق الغطاء. قم بتأمين مخروط أنف التخدير على مرحلة المجهر بطريقة تغطي أنف الحيوان بالكامل عندما يكون في وضع التصوير.ضع أنف الفأر المخدر في مخروط الأنف. ضع قطرة من الماء المعقم على الغطاء فوق العدسة الشيئية. اضبط مخروط أنف التخدير وضع الماوس بحيث تكون أذن الفأر فوق قطرة الماء.خذ زلة غطاء أخرى وضع حافة زلة الغطاء موازية لجسم الماوس بحيث تلامس الحافة الماوس حيث تلتقي الأذن بالرأس. باستخدام حركة مفصلية ، قم بخفض الحافة الحرة لانزلاق الغطاء إلى مرحلة المجهر. عندما يأتي انزلاق الغطاء ضد مرحلة المجهر ، فإنه سوف يسطح الأذن.قم بربط الغطاء العلوي بإحكام لتحمل ضغطا كافيا للحفاظ على الأذن مسطحة وتجنب التقاط شعر الماوس أو شعيراته في الشريط. ما لم يتم استخدام مجهر مع غرفة بيئية ، قم بتغطية جسم الفأر بشكل فضفاض بستارة معقمة للحفاظ على بيئة حرارية طبيعية. باستخدام الضوء الأبيض ، والتصوير واسع المجال ، اضبط مستوى التركيز في أنسجة الأذن وركز على خلايا الدم الحمراء التي تتحرك في الأوعية الدموية.للحصول على إشارة قوية بما يكفي لنسبة الضوضاء بحيث يمكن تحديد التشكل لجميع الخلايا في مجال الرؤية ، اضبط قوة الليزر أو سرعة التصوير. لتجنب تلف الأنسجة ، استخدم أقل طاقة ليزر ممكنة. اختر مجال رؤية به تكوين خيوط واضحة في السلالة المشار إليها وحيث تنتشر معظم الكائنات الحية بدرجة كافية بحيث يمكن تحديد مورفولوجيتها.اضبط مستويي التركيز العلوي والسفلي لمكدس Z. ليس من الضروري تغطية عمق المنطقة المصابة بالكامل ، ولكن ضع في اعتبارك أن الكائنات الحية في أعلى أو أسفل الحجم المصور عادة ما يتم استبعادها من التحليل. احصل على صور Z-stack ، وقم بتلوين كل قناة زائفة لتمييز كل سلالة وتراكب القنوات.احفظ الصور. استخدم برنامج التصوير لإجراء أقصى إسقاط لمكدس Z في صورة ثنائية الأبعاد. عد كل كائن حي يظهر في صور الإسقاط القصوى حسب نوع السلالة والمورفولوجيا.تشكل السلالة المشار إليها بسرعة خيوطا في المختبر. في حين فشل EFG1 Null في تشكيل خيوط. يظهر EFG1 Null عيبا كبيرا في الفتيل في الجسم الحي أيضا.نما ما يقرب من 9٪ من خلايا EFG1 Null كخيوط في الجسم الحي. وبالمثل ، أظهرت سلالة CYR1 Null الطافرة عيبا في الفتيل في المختبر مقارنة بالسلالة المشار إليها. في المقابل ، نمت 53٪ من الخلايا الطافرة CYR1 Null كخيوط في الجسم الحي.كانت الخيوط التي شكلتها طفرة CYR1 Null أقصر من السلالة المشار إليها. من الأهمية بمكان إبقاء الإبرة موازية للجلد أثناء التلقيح. الهدف هو وضع اللقاح تحت الطبقة الخارجية من الجلد.يمكن أيضا استخدام هذه التقنية مع سلالات الفئران التي تعبر عن بروتين فلوري في الخلايا المضيفة ذات الأهمية مما يسمح لنا بدراسة تفاعلات مسببات الأمراض المضيفة في الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

في الجسم الحي التصوير الطفيليات الليشمانية المعدلة وراثيا في مضيف لايف

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

غير الغازية تصوير الزاجل كريات بيضاء والهجرة في الجسم الحي</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

دراسة المجتمعات الميكروبية<em&gt; في فيفو</em&gt;: نموذج من التفاعل بوساطة بين المضيف<em&gt; المبيضات البيض</em&gt; و<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في الخطوط الجوية

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

دراسة الظواهر المضيف في<em&gt; affinis الجمبوزيا</em&gt; وبعد المضادات الحيوية العلاج

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

تصوير تفاعل الخلية في الغشاء المخاطي الرغامى أثناء عدوى فيروس الإنفلونزا باستخدام الفحص المجهري إينترافيتال اثنين-فوتون

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

توضيح والتصوير المبيضات ألبيكانس بيوفيم

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

مُسَاَنّة مُعَدِيّة سابقة لدراسة المبيضات المبيضات البَيكانسِيّة الواصلة Morphogenesi في الجهاز الهضمي

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

عدوى الإشريكية القولونية المتكررة في المسالك البولية الناجمة عن التعرض للمثانة المهبلية Gardnerella في الفئران

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...