Name: use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

这项工作得到了NIH拨款1R01AI33409和爱荷华大学卡弗医学院儿科的支持。

<ol>
	<li>Lopes, J. P., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+virulence+of+Candida+albicans.">Pathogenesis and virulence of Candida albicans.</a> Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+control+of+cell+morphology+in+vivo+reveals+distinct+roles+for+yeast+and+filamentous+forms+of+Candida+albicans+during+infection.">Engineered control of cell morphology in vivo reveals distinct roles for yeast and filamentous forms of Candida albicans during infection.</a> Eukaryotic Cell. 2 (5), 1053-1060 (2003).</li><li>Arita, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+associated+proteins+involved+in+filamentation+with+impact+on+the+virulence+of+Candida+albicans.">Cell wall associated proteins involved in filamentation with impact on the virulence of Candida albicans.</a> Microbiological Research. 258, 126996 (2022).</li><li>Rai, L. S., Wijlick, L. V., Bougnoux, M. E., Bachellier-Bassi, S., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+commensal+and+pathogenic+life-styles+of+an+opportunistic+fungus-Candida+albicans.">Regulators of commensal and pathogenic life-styles of an opportunistic fungus-Candida albicans.</a> Yeast. 38 (4), 243-250 (2021).</li><li>Sudbery, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Candida+albicans+hyphae.">Growth of Candida albicans hyphae.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).</li><li>Basso, V., d'Enfert, C., Znaidi, S., Bachellier-Bassi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+genes+to+networks:+The+regulatory+circuitry+controlling+candida+albicans+morphogenesis.">From genes to networks: The regulatory circuitry controlling candida albicans morphogenesis.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 422, 61-99 (2019).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+Candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in Candida species.</a> Elife. 10, 64682 (2021).</li><li>Mitra, S., Dolan, K., Foster, T. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+and+filaments+have+specialized,+independent+activities+in+a+zebrafish+model+of+Candida+albicans+infection.">Yeast and filaments have specialized, independent activities in a zebrafish model of Candida albicans infection.</a> Infection and Immunity. 86 (10), 00415-00418 (2018).</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 6th edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html">https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html</a> (2020)</li><li>Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+genetically+engineered+strain+to+evaluate+the+pathogenic+potential+of+yeast+cell+and+filamentous+forms+during+Candida+albicans+systemic+infection+in+immunodeficient+mice.">Use of a genetically engineered strain to evaluate the pathogenic potential of yeast cell and filamentous forms during Candida albicans systemic infection in immunodeficient mice.</a> Infection and Immunity. 76 (1), 97-102 (2008).</li><li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth.">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryotic Cell. 10 (7), 932-944 (2011).</li><li>Brothers, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase-driven+phagocyte+recruitment+controls+Candida+albicans+filamentous+growth+and+prevents+mortality.">NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003634 (2013).</li><li>Holmes, H., Kennedy, J. C., Pottier, R., Rossi, R., Weagle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recipe+for+the+preparation+of+a+rodent+food+that+eliminates+chlorophyll-based+tissue+fluorescence.">A recipe for the preparation of a rodent food that eliminates chlorophyll-based tissue fluorescence.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B: Biology. 29 (2-3), 199 (1995).</li></ol>

作者没有利益冲突需要披露。

该模型利用共聚焦显微镜来获取白色念珠菌生物在哺乳动物宿主组织内生长的图像，从而使我们能够评估活动性感染期间的形态发生表型。形态发生过程是白色念珠菌发病机制的核心，并且已使用各种体外测定进行了广泛研究2，3，4。然而，没有体外测定可以完全模拟宿主复杂的生化和结构环境。
这里描述的方案侧重于使用这种体内成像系统来筛选一系列/文库的白色念珠菌突变体，以鉴定感染期间参与形态发生的基因。使用表达不同荧光蛋白的白色念珠菌菌株使我们能够量化白色念珠菌突变菌株与参考菌株相比的体内形态发生。将突变体的形态发生与同一感染区域内的参考菌株进行比较，可确保生物体暴露于相同的环境中。这允许定量测量经历灯丝化的细胞的百分比，以及灯丝化的程度。将突变菌株的测量值归一化为参考菌株的测量值，使我们能够更好地比较一个突变体与另一个突变体的性能。
这里介绍的代表性结果表明， 体外 和 体内 表型之间可能存在显着差异。 白色念珠菌 efg1ΔΔ 突变菌株通常用作形态发生测定的阴性对照，因为它在几乎所有 体外 条件下都无法成丝20。尽管 体内 结果与 体外 结果非常相似，但即使是这种严重受阻的菌株，偶尔也会在宿主组织环境中形成细丝（图3）。这强调了宿主环境在触发形态发生方面的强度。
相比之下， cyr1ΔΔ突变菌株在 体外 和 体内 生长之间表现出实质性的不一致;虽然没有突变细胞在 体外经历丝化，但大约一半的细胞 在体内 生长为细丝（图4）10，21。有趣的是，这些细丝明显短于由参考菌株形成的细丝，这表明 CYR1 有助于丝状生长速率或维持丝状表型的能力。为了便于分析灯丝长度，使用图像的二维投影测量灯丝的曲线路径长度。在三维生长的细丝的二维投影中，任何在不平行于 xy 平面的轴上生长的细丝都将投影出比其真实长度短。由于这种透视缩短也发生在参考菌株上，因此评估二维投影中细丝长度的分布仍然可以在参考菌株和突变菌株之间进行定量比较。在二维而不是三维中分析细丝长度需要较少强度的图像分析;因此，它可以在典型的台式计算机上相对较快地执行。使用这种更简单的分析可以将细丝长度分布作为筛选方案的一部分，从而更细致地了解每个突变体进行形态发生的能力，而不会导致吞吐量的显着延迟。
这里介绍的代表性研究是使用DBA2 / N小鼠进行的，这些小鼠的补体系统存在缺陷，导致未能将中性粒细胞募集到 白色念珠菌 感染的部位22。这些研究的目的是研究宿主组织内 白色念珠菌 丝状体的调节机制。因此，使用DBA2 / N小鼠来避免由于单个菌株对中性粒细胞的敏感性或抵抗力而混淆结果。由于中性粒细胞抗白色念珠菌 反应可影响灯丝形成23，中性粒细胞募集到感染部位可能会影响形态发生测定的结果。如果菌株能够在 体内 成丝，但在存在中性粒细胞时强烈抑制丝化，则会在DBA2 / N小鼠中检测到丝化，但在使用具有完整中性粒细胞趋化性的小鼠时不太可能看到丝化。因此，使用该协议时，用作宿主的小鼠的应变是一个重要因素。
观察到efg1ΔΔ突变菌株在体内无法丝化不太可能与宿主中性粒细胞反应有关，因为该菌株也未能在体外丝化。用cyr1ΔΔ菌株在体内观察到的灯丝与其体外灯丝化失败不一致。来自白色念珠菌感染斑马鱼模型的数据表明，反应性中性粒细胞在预防形态发生中很重要24。因此，与体外相比，使用缺乏中性粒细胞反应的DBA2 / N小鼠不太可能解释cyr1ΔΔ在体内的丝化增加。然而，体内环境明显影响了cyr1ΔΔ菌株的形态发生;因此，对该菌株的进一步研究可能提供有关活动性感染期间白色念珠菌形态发生调节的重要信息。此处描述的方案被设计为筛选测定，以鉴定用于未来研究的菌株，例如cyr1ΔΔ菌株。
使用低流量气体麻醉系统对该协议非常有帮助（图1A，B）。在该协议的初始开发过程中，使用氯胺酮与甲苯噻嗪混合的可注射麻醉混合物麻醉小鼠。虽然可以使用这种麻醉方法进行有限的成像，但麻醉的持续时间是不可预测的，需要快速结束成像会话以避免小鼠在成像期间从麻醉中恢复过来。传统的吸入麻醉系统体积庞大，需要高速率的麻醉气体，通常需要在通风橱中使用。因此，传统的吸入麻醉系统在共聚焦显微镜的空间限制下很难使用，而不会无意中使研究人员暴露于麻醉剂中。使用低流量吸入麻醉系统可以对动物进行一致的麻醉，同时为研究者保持安全的环境。低流量鼻锥允许在接种和显微镜下轻松定位动物。小口径、小容量输送管允许使用相对较长的管子，这使得麻醉机能够放置在足够的距离，以免干扰显微镜检查。
典型小鼠食物中存在的叶绿素导致显着的组织自发荧光25。这会在图像中产生大量噪点，从而难以获得高质量、高空间分辨率的图像。当动物在成像前喂食无叶绿素食物7天时，组织中自发荧光的背景显着降低，但沉积在头发中的叶绿素仍然存在问题。使用非处方化学脱毛膏去除耳廓上的毛发可有效减少头发中的自发荧光（图1C，D）。因此，无叶绿素食物和充分脱毛的组合大大降低了自发荧光并显着提高了图像质量。由于在成像之前将毛发从耳朵上去除，因此动物毛发的颜色不会影响该系统。该协议已成功用于研究BALB / c（白色），C57BL / 6（黑色）和DBA2 / N（棕色）小鼠中的 白色念珠菌 感染。该方案还可用于缺乏各种宿主基因的C57BL / 6敲除小鼠;这将允许未来研究哺乳动物宿主免疫系统如何影响灯丝。该协议中未讨论的该模型的一个特征是，由于该成像系统是非侵入性的，因此可以在几天内对同一只动物进行重复成像，从而可以随时间跟踪个体感染的进展。这一特征可能会在未来关于宿主-病原体相互作用的研究中发挥关键作用。
总之，该协议导致白色念珠菌在活哺乳动物宿主组织中生长的高空间分辨率图像，从而可以准确评估突变菌株8，9，10的形态发生。这里提供的结果证明了该协议如何用于筛选白色念珠菌突变体文库。在迄今为止测试的白色念珠菌突变体中，很大一部分在体外具有已知形态发生缺陷的突变体很容易在体内发生丝化9，10。这突出了在旨在阐明白色念珠菌发病机制的实验中包括像这样的体内系统的重要性。

白色念珠菌是一种常见的人类真菌病原体，可引起皮肤黏膜疾病、播散性疾病和局部组织感染1。白色念珠菌生理学的一个关键特征是其复杂的多态性生长，这与它作为共生和病原体的作用有关2，3，4。在30°C的体外丰富的营养条件下，它通常以卵形出芽酵母的形式生长。各种环境触发因素，包括营养剥夺、pH值变化、37°C生长、暴露于血清以及嵌入琼脂时的生长，导致向极化生长模式的转变，导致形成真正的菌丝和/或假菌丝5。极化生长的开始和由此产生的丝状生物的生长被称为形态发生。
由于形态发生对生物体毒力的重要性，菌丝形成的调节已被广泛研究6，7。有一个复杂的信号通路和转录调控网络触发形态发生。尽管白色念珠菌形态发生与发病机制有关，但大多数研究形态发生的研究都使用体外刺激来触发菌丝形成。越来越清楚的是，就刺激的个体调节途径而言，各种体外灯丝模型并不相同。此外，没有体外生长条件与宿主的复杂环境紧密对应。鉴于白色念珠菌作为人类病原体的重要性，该协议的目标是使用中等通量的系统研究其在哺乳动物宿主活动性感染期间的形态发生，从而允许研究人员筛选白色念珠菌突变文库。
为了促进这些研究，开发了一种体内成像系统，使我们能够使用倒置共聚焦显微镜8，9，10在麻醉小鼠耳廓感染期间获得白色念珠菌细胞的高空间分辨率图像。由于耳廓的皮肤非常薄，因此无需组织解剖即可获得这些图像。因此，可以在宿主组织内活动性感染部位测量定量表型数据。这里描述的方案涉及使用不同的荧光蛋白表达盒11，12转化参考菌株和一个或多个突变菌株。然后将表达荧光蛋白的菌株混合并皮内共注射。建立感染后，共聚焦成像用于量化灯丝化的频率和形成的细丝的长度。从突变菌株获得的数据归一化为从参考菌株获得的数据，其存在于同一组织区域中，从而提供内部对照。该系统使我们能够成功筛选出几个系列的白色念珠菌突变菌株，其中许多在体外具有形态发生缺陷9，10。这些菌株中的许多在体内容易长丝，突出了体内模型对形态发生研究的重要性。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 coverslips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>20811</td>
			<td>large enough to cover the universal stage opening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 mL Insulin syringes</td>
			<td>EXELint</td>
			<td>26018</td>
			<td>Can use syringes that are 5/16&#34;&#8211;1/2&#34; long and 29&#8211;32 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.7% formaldehyde in dPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBJ5734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol/30% water</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>A05061001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.albicans reference strain and experimental strains</td>
			<td>SN250</td>
			<td>FGSC Online Catalog</td>
			<td>The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyl free mouse chow</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2920x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7050</td>
			<td>Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicator</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>76200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBA2/N (6-12 week old mice)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.&#160; The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.&#160; This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.&#160; It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.&#160; 
			Examples:&#160; 
			https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-40 
			https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174320&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-26 
			https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Must be sterile; open a new container for every experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze pad</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>P157112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel eye lurbicant</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ or FIJI analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ (FIJI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>J119005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8 (SP8)</td>
			<td>The objective lens&#160; (Leica 11506375) used here&#160; is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. 
			The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free&#160; spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. 
			The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific International</td>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair hair remover lotion</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Over the counter depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AB-101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent protein expression transformation constructs&#160; generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensitive laboratory tape</td>
			<td>Tape &#38; Label Graphic Systems Inc</td>
			<td>1007910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 cell culture medium</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>To safely hold the animals ear during injectinos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host

白色念珠菌是一种重要的人类病原体。它在形态学形式之间切换的能力是其发病机制的核心;这些形态变化由响应环境刺激而控制的复杂信号网络调节。这些调节成分已被高度研究，但几乎所有研究都使用各种体外刺激来触发灯丝。为了确定形态发生如何在发病过程中受到调节，我们开发了一种体内显微镜系统，以获得哺乳动物宿主内经历菌丝形成的生物体的高空间分辨率图像。这里介绍的方案描述了使用该系统来筛选白色念珠菌突变菌株的小型集合，使我们能够识别形态发生的关键调节因子，因为它发生在感染部位。提出了代表性的结果表明，一些形态发生的调节因子，例如转录调节因子Efg1，在体外和体内具有一致的表型，而其他调节因子，例如腺苷酸环化酶（Cyr1），与体外相比，体内表型显着不同。

此处介绍的结果基于先前发表的报告9，10。该分析的目的是定量评估突变白色 念珠菌菌 株在活动性感染期间发生形态发生的能力。区分假菌丝和菌丝的典型参数在复杂的 体内 环境中三维生长的生物体中可能难以评估。在观察共聚焦成像产生的二维横截面时尤其如此。因此，该筛选分析的重点是识别生长为丝状与酵母的生物。对于使用更深入分析的后续研究，包括三维重建，该方法可以适用于区分酵母、菌丝和假菌丝。
荧光蛋白在 白色念珠 菌的参考或突变菌株中的表达可以直接检测 体内 菌株形态（图3 和 图4）。通常，当图像中很少或没有像素饱和时，最好进行定量光学显微镜分析。然而，对于该协议，图像的饱和通常会简化分析。荧光蛋白在整个细胞中的定位并不均匀，并且在母酵母中通常高于在细丝中。幸运的是，对于形态发生的研究，信号的空间分布而不是其强度决定了结果。因此，获得许多像素饱和的图像可以提高在该测定中量化形态发生的能力。
为了说明评估 体内形态发生的重要性，给出了参考菌株（SN250）和两种突变体的代表性结果：一种缺乏转录因子Efg1，另一种缺乏腺苷酸环化酶Cyr1。 在体外，这些菌株都没有生长为细丝20，21。当在补充有10%血清的RPMI培养基中体 外 生长时，参考菌株会迅速形成细丝，而 efg1ΔΔ和 cyr1ΔΔ菌株则不会（图3 和 图4）。在这些条件下， efg1ΔΔ突变体表现出某种极化生长，与母细胞相比，子细胞略微拉长。这强调了使用明确的灯丝定义的重要性。默认情况下，任何此类定义都是任意的，但对于表型的一致评估是必要的。对于这些研究，丝状生长模式被定义为子细胞最长尺寸超过母细胞两倍的生物体。使用这个定义，细长的 efg1ΔΔ细胞不是丝状的。
与其体外表型一致，efg1ΔΔ在体内表现出明显的丝化缺陷：大约9%的efg1ΔΔ细胞在体内生长为细丝（图3）。相比之下，53%的cyr1ΔΔ突变细胞在体内以细丝形式生长（图4）。尽管体内经历丝化的cyr1ΔΔ突变细胞的数量明显低于参考菌株，但cyr1ΔΔ突变体在体内形成细丝的能力代表了其在体外完全缺乏形态发生的实质性变化。从视觉上看，由cyr1ΔΔ突变体形成的细丝似乎比参考菌株短。为了定量评估这一点，使用体内图像的二维投影测量丝状细胞的曲线路径长度（图4E）。cyr1ΔΔ细丝的中位长度比参考应变的细丝短29%。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg"> 图1：麻醉和接种 。 （A）使用诱导室诱导麻醉。（B）使用鼻锥维持麻醉，允许根据需要重新定位小鼠。（C）使用棉头涂抹器涂抹脱毛霜。眼部润滑凝胶已用于在麻醉期间保护眼睛。（D）有效脱除右耳毛发。与未经治疗的左耳相比。（E）将 白色念珠菌 皮内注射到小鼠耳朵中。使用用双面皮肤胶带（时尚胶带）包裹的锥形管的尖端将耳朵固定到位。（F）皮内注射的关闭。皮肤中形成一个苍白的气泡，这是皮内放置成功的标志。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg"> 图2：成像准备 。 （A）为成像准备的显微镜载物台。麻醉鼻锥固定到位。盖玻片被贴在覆盖镜头开口的载物台上。可提供其他胶带。将加热阶段预热至37°C（未显示）。（B）将麻醉小鼠放入麻醉鼻锥中。（C）将鼠标稍微旋转，使接种的耳朵一侧朝向底部盖玻片/物镜。然后将耳朵压平在底部盖玻片上，并通过在耳朵顶部放置第二个盖玻片来固定到位。（D）将顶部盖玻片贴在载物台上，以将耳朵相对于显微镜载物台固定到位。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg"> 图 3：efg1ΔΔ 突变菌株的体外和体内形态。 （A）WT和efg1ΔΔ突变菌株的宽场图像，通过在37°C下在RPMI + 10%血清中生长细胞4小时体外诱导丝化。比例尺代表 10 μm。使用照片编辑软件调整图像对比度以方便查看。（B）在WT和efg1ΔΔ突变菌株中观察到的体外灯丝百分比。Und = 检测不到（未检测到细丝）。条形高度代表来自三个独立实验的丝状细胞的中位数百分比，其中至少量化了100个细胞。误差线表示标准偏差（与学生的t检验比较的结果，p < 0.001）。（C）接种后24小时在体内生长的WT（绿色）和efg1ΔΔ突变体（红色）的共聚焦显微照片。箭头表示符合我们对“丝状”定义的efg1ΔΔ突变细胞的例子。比例尺代表 50 μm。 （D） 在 WT 和 efg1ΔΔ 突变菌株中观察到的体内细丝化百分比。条形高度代表来自两个独立实验的丝状细胞的中位数百分比。误差线表示标准偏差（与学生的t检验比较的结果，p < 0.001）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg"> 图 4：cyr1 ΔΔ 突变菌株的体外和体内形态。 （A） 通过在 RPMI + 10% 血清中生长细胞在 37 °C 下培养细胞 4 小时，体外诱导灯丝后 cyr1ΔΔ 突变菌株的宽场图像。比例尺代表 10 μm。使用照片编辑软件调整图像对比度以方便查看。（B）在WT和cyr1ΔΔ突变菌株中观察到的体外灯丝百分比。Und = 检测不到（未检测到细丝）。条形高度代表来自三个独立实验的丝状细胞的中位数百分比，其中至少量化了100个细胞。误差线表示标准差（与学生的t检验比较的结果，p < 0.001）。（C）接种后24小时在体内生长的WT（绿色）和cyr1ΔΔ突变体（红色）的共聚焦显微照片。比例尺代表 50 μm。 （D）在WT和cyr1ΔΔ突变菌株中观察到的体内细丝化百分比。条形高度代表来自两个独立实验的丝状细胞的中位数百分比。误差线表示标准差（与学生的t检验比较的结果，p < 0.001）。（E）体内灯丝长度的分布，如通过z堆栈的二维投影中的曲线路径长度来测量。每个点代表一根细丝的长度。作为酵母生长的细胞不包括在该分析中。条形表示灯丝长度的中位数。使用曼-惠特尼U检验分析时，长度分布差异显著（p < 0.001）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

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Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

本手稿描述了一种使用非侵入性共聚焦显微镜在哺乳动物宿主活动性感染期间筛选中等大小的 白色念珠菌 突变文库的形态发生表型的方法。

使用 体内 成像筛选哺乳动物宿主活动性感染期间 白色念珠 菌突变菌株的形态发生表型

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

白色念珠菌形态发生是由无数的环境信号触发的。通过研究体内形态发生，我们正在确定生物体如何整合和响应所有这些环境信号。该技术的主要优点是，它允许我们在没有可能使用体外模型系统引入的偏差或伪影的情况下研究形态发生。很少有人有皮内注射的经验。我强烈建议刚接触这项技术的人联系他们的动物资源兽医，以帮助学习它。演示该程序的将是Rohan Wakade，我们实验室小组的博士后研究员。首先通过在接种前至少七天喂食无叶绿素的食物来准备动物接种。注射前一天，用牙签从一个菌落中取一滴加拿大白色念珠菌细胞。接种25毫升YPD并重复此过程几次，以获得来自几个不同菌落的细胞。将培养物在 30 摄氏度下以 175 RPM 的速度在轨道振荡器培养箱中孵育过夜。以500×g离心一毫升培养物两分钟，然后用一毫升无菌DPBS洗涤酵母三次。将沉淀重悬于一毫升无菌DPBS中，并将培养物稀释至1至100。使用血细胞计数器计数细胞并相应地调整细胞密度。接下来，通过混合等体积的参考菌株和实验菌株来创建注射接种物。使用棉签，将非处方脱毛膏大量涂抹在麻醉动物双耳的内表面和外表面。两到三分钟后，用干纱布轻轻擦拭耳朵，然后用浸有无菌水的纱布垫彻底去除脱毛膏残留物。用70%乙醇对耳朵表面进行消毒后，通过多次倒置小瓶或涡旋来充分混合接种物。将20至30微升接种物吸入胰岛素注射器中。将针头保持在直立位置并轻轻敲击注射器，以确保桶中的任何空气都在顶部。小心地将空气和多余的接种物喷射回接种管或废液管中，使柱塞达到 10 微升标记。将柜台双面皮肤胶带敷在一个小圆锥形或圆底塑料管上，并将耳朵披在胶带上，避免麻醉鼻锥移位。保持注射器针头几乎与皮肤平行并避免任何大静脉，将针尖插入皮肤的最外层，直到斜面刚好被覆盖，然后慢慢地将接种物皮内注射。良好的皮内注射会在皮肤上产生一个小气泡。将针头固定 15 到 20 秒，然后再将其从耳朵上取下，以尽量减少泄漏。按照机构协议，用生物危害标签标记笼子，表明笼子里的动物感染了白色念珠菌。使用与制备接种物相同的洗涤培养物，在RPMI 1640中创建1至50稀释的细胞，补充10%的热量和活化的胎牛血清，并在37摄氏度下孵育4小时。使用显微镜检查样品。计数至少100个细胞，记录每种菌株的酵母和丝状细胞的数量。将长工作距离物镜旋转到位，并在镜头上放置一滴浸没液。放下镜头以避免在放置盖玻片时可能损坏。将 1.5 号盖玻片放在载物台开口上并将其粘贴到位。升起物镜，使浸没液与物镜和盖玻片接触。将麻醉鼻锥固定在显微镜载物台上，使其在成像时完全覆盖动物的鼻子。将麻醉小鼠的鼻子放入鼻锥中。将一滴无菌水滴在物镜上方的盖玻片上。调整麻醉鼻锥并定位鼠标，使鼠标的耳朵位于水滴上方。拿另一张盖玻片，将盖玻片的边缘平行于鼠标的身体放置，边缘接触鼠标耳朵与头部相接的地方。使用铰链运动，将盖玻片的自由边缘降低到显微镜载物台。当盖玻片贴在显微镜载物台上时，会使耳朵变平。用胶带牢固地粘住顶盖滑，以保持足够的压力以保持耳朵平坦，并避免将鼠标的头发或胡须卡在胶带中。除非使用带有环境室的显微镜，否则请用无菌窗帘松散地覆盖小鼠的身体，以保持正常的热环境。使用白光，宽场成像，调整焦点平面进入耳组织，并聚焦在血管中移动的红细胞。为了获得足够强的信噪比，以便可以确定视野中所有细胞的形态，请调整激光功率或成像速度。为避免组织损伤，请使用尽可能低的激光功率。选择一个在参考菌株中具有清晰细丝形成的视野，并且大多数生物体的分布足以确定其形态。设置 Z 堆栈的焦点的顶部和底部平面。覆盖感染区域的整个深度不是必需的，但请记住，成像体积顶部或底部的生物通常被排除在分析之外。获取Z-stack图像，对每个通道进行伪着色以区分每个应变并覆盖通道。保存图像。使用成像软件将Z堆栈最大投影到二维图像中。按菌株类型和形态计算最大投影图像中看到的每个生物。参考菌株在体外迅速形成细丝。而EFG1 Null未能形成细丝。EFG1 Null在体内也表现出明显的灯丝缺陷。大约9%的EFG1空细胞在体内以细丝形式生长。同样，与参考菌株相比，CYR1 Null突变菌株在体外显示出丝状缺陷。相比之下，53%的CYR1 Null突变细胞在体内以细丝形式生长。由CYR1 Null突变体形成的细丝短于参考菌株。在接种过程中保持针头与皮肤平行至关重要。目标是将接种物放置在皮肤外层下方。该技术还可以与在感兴趣的宿主细胞中表达荧光蛋白的小鼠品系一起使用，使我们能够研究体内宿主病原体的相互作用。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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