Name: use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud 1R01AI33409 og Institut for Pædiatri, Carver College of Medicine, University of Iowa.

<ol>
	<li>Lopes, J. P., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+virulence+of+Candida+albicans.">Pathogenesis and virulence of Candida albicans.</a> Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+control+of+cell+morphology+in+vivo+reveals+distinct+roles+for+yeast+and+filamentous+forms+of+Candida+albicans+during+infection.">Engineered control of cell morphology in vivo reveals distinct roles for yeast and filamentous forms of Candida albicans during infection.</a> Eukaryotic Cell. 2 (5), 1053-1060 (2003).</li><li>Arita, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+associated+proteins+involved+in+filamentation+with+impact+on+the+virulence+of+Candida+albicans.">Cell wall associated proteins involved in filamentation with impact on the virulence of Candida albicans.</a> Microbiological Research. 258, 126996 (2022).</li><li>Rai, L. S., Wijlick, L. V., Bougnoux, M. E., Bachellier-Bassi, S., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+commensal+and+pathogenic+life-styles+of+an+opportunistic+fungus-Candida+albicans.">Regulators of commensal and pathogenic life-styles of an opportunistic fungus-Candida albicans.</a> Yeast. 38 (4), 243-250 (2021).</li><li>Sudbery, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Candida+albicans+hyphae.">Growth of Candida albicans hyphae.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).</li><li>Basso, V., d'Enfert, C., Znaidi, S., Bachellier-Bassi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+genes+to+networks:+The+regulatory+circuitry+controlling+candida+albicans+morphogenesis.">From genes to networks: The regulatory circuitry controlling candida albicans morphogenesis.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 422, 61-99 (2019).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+Candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in Candida species.</a> Elife. 10, 64682 (2021).</li><li>Mitra, S., Dolan, K., Foster, T. H., Wellington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+morphogenesis+of+Candida+albicans+during+infection+in+a+live+animal.">Imaging morphogenesis of Candida albicans during infection in a live animal.</a> Journal of Biomedical Optics. 15 (1), 010504 (2010).</li><li>Wakade, R. S., Huang, M., Mitchell, A. P., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+Candida+albicans+identifies+differential+in+vitro+and+in+vivo+filamentation+phenotypes+for+transcription+factor+deletion+mutants.">Intravital imaging of Candida albicans identifies differential in vitro and in vivo filamentation phenotypes for transcription factor deletion mutants.</a> mSphere. 6 (3), 0043621 (2021).</li><li>Wakade, R. S., Kramara, J., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+filamentation+does+not+require+the+cAMP-PKA+pathway+in+vivo.">Candida albicans filamentation does not require the cAMP-PKA pathway in vivo.</a> mBio. 13 (3), 0085122 (2022).</li><li>Bergeron, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Pseudomonas+aeruginosa+interact+to+enhance+virulence+of+mucosal+infection+in+transparent+zebrafish.">Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa interact to enhance virulence of mucosal infection in transparent zebrafish.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 00475 (2017).</li><li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+and+filaments+have+specialized,+independent+activities+in+a+zebrafish+model+of+Candida+albicans+infection.">Yeast and filaments have specialized, independent activities in a zebrafish model of Candida albicans infection.</a> Infection and Immunity. 86 (10), 00415-00418 (2018).</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 6th edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html">https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html</a> (2020)</li><li>Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotypic+profile+of+the+Candida+albicans+regulatory+network.">A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network.</a> Plos Genetics. 5 (12), 1000783 (2009).</li><li>Cullen, P. J., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+filamentous+growth+in+yeast.">The regulation of filamentous growth in yeast.</a> Genetics. 190 (1), 23-49 (2012).</li><li>Herrero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+filament+formation+in+Candida+albicans+by+polyamine+levels.">Control of filament formation in Candida albicans by polyamine levels.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4870-4878 (1999).</li><li>Ahmad Hussin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+auxotrophy+and+biotin+enhanced+germ+tube+formation+in+Candida+albicans.">Biotin auxotrophy and biotin enhanced germ tube formation in Candida albicans.</a> Microorganisms. 4 (3), 37 (2016).</li><li>Nantel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+profiling+of+Candida+albicans+cells+undergoing+the+yeast-to-hyphal+transition.">Transcription profiling of Candida albicans cells undergoing the yeast-to-hyphal transition.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3452-3465 (2002).</li><li>Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strains+and+strategies+for+large-scale+gene+deletion+studies+of+the+diploid+human+fungal+pathogen+Candida+albicans.">Strains and strategies for large-scale gene deletion studies of the diploid human fungal pathogen Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 4 (2), 298-309 (2005).</li><li>Glazier, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EFG1,+Everyone's+favorite+gene+in+Candida+albicans:+A+comprehensive+literature+review.">EFG1, Everyone's favorite gene in Candida albicans: A comprehensive literature review.</a> Frontiers in Cellular Infection and Microbiology. 12, 855229 (2022).</li><li>Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+and+diverse+regulation+of+the+Ras/cAMP/protein+kinase+A+pathway+in+Candida+albicans.">Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Chaturvedi, A. K., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+genetically+engineered+strain+to+evaluate+the+pathogenic+potential+of+yeast+cell+and+filamentous+forms+during+Candida+albicans+systemic+infection+in+immunodeficient+mice.">Use of a genetically engineered strain to evaluate the pathogenic potential of yeast cell and filamentous forms during Candida albicans systemic infection in immunodeficient mice.</a> Infection and Immunity. 76 (1), 97-102 (2008).</li><li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth.">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryotic Cell. 10 (7), 932-944 (2011).</li><li>Brothers, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase-driven+phagocyte+recruitment+controls+Candida+albicans+filamentous+growth+and+prevents+mortality.">NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003634 (2013).</li><li>Holmes, H., Kennedy, J. C., Pottier, R., Rossi, R., Weagle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recipe+for+the+preparation+of+a+rodent+food+that+eliminates+chlorophyll-based+tissue+fluorescence.">A recipe for the preparation of a rodent food that eliminates chlorophyll-based tissue fluorescence.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B: Biology. 29 (2-3), 199 (1995).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Denne model bruger konfokal mikroskopi til at opnå billeder af C. albicans organismer, når de vokser i vævet hos en pattedyrsvært, hvilket giver os mulighed for at evaluere morfogenesefænotyper under aktiv infektion. Morfogeneseprocessen er central for C. albicans patogenese og er blevet bredt undersøgt ved hjælp af en række in vitro-assays 2,3,4. Imidlertid kan intet in vitro-assay fuldt ud modellere værtens komplekse biokemiske og strukturelle miljø.
Protokollen beskrevet her er fokuseret på brugen af dette in vivo-billeddannelsessystem til at screene en serie / bibliotek af C. albicans mutanter for at identificere de gener, der er involveret i morfogenese under infektion. Brugen af C. albicans stammer, der udtrykker forskellige fluorescerende proteiner, giver os mulighed for at kvantificere in vivo morfogenese af C. albicans mutante stammer sammenlignet med en referencestamme. Sammenligning af morfogenese i mutanten med referencestammen inden for samme infektionsområde sikrer, at organismerne udsættes for identiske miljøer. Dette giver mulighed for kvantitativ måling af procentdelen af celler, der gennemgår filamentering, samt omfanget af filamentering. Normalisering af målingerne af mutantstammen/mutantstammerne til målingerne af referencestammen giver os mulighed for bedre at sammenligne en mutants ydeevne med en anden.
De repræsentative resultater, der præsenteres her, viser potentialet for en betydelig uoverensstemmelse mellem in vitro- og in vivo-fænotyper. C. albicans efg1ΔΔ mutant stamme bruges ofte som en negativ kontrol for morfogenese assays, da den ikke filament i næsten alle in vitro betingelser20. Selv om in vivo-resultaterne var meget lig in vitro-resultaterne, dannede selv denne stærkt hæmmede stamme lejlighedsvis filamenter i værtsvævsmiljøet (figur 3). Dette understreger værtsmiljøets styrke ved at udløse morfogenese.
I modsætning hertil viser cyr1ΔΔ mutantstammen en betydelig uoverensstemmelse mellem in vitro og in vivo vækst; selvom ingen af de mutante celler gennemgår filamentation in vitro, vokser ca. halvdelen af cellerne som filamenter in vivo (figur 4)10,21. Interessant nok var disse filamenter signifikant kortere end dem, der blev dannet af referencestammen, hvilket tyder på, at CYR1 bidrager til enten filamentvæksthastigheden eller evnen til at opretholde en filamentøs fænotype. For at lette analysen af filamentlængden blev filamenternes kurvebanelængde målt ved hjælp af en todimensionel projektion af billederne. I todimensionale fremskrivninger af filamenter, der vokser i tre dimensioner, vil ethvert filament, der vokser på en akse, der ikke er parallelt med xy-planet, projicere som kortere end dets sande længde. Da denne forkortning også forekommer for referencestammen, tillader evaluering af fordelingen af filamentlængder i en todimensionel projektion stadig en kvantitativ sammenligning mellem reference- og mutantstammerne. Analyse af filamentlængde i to snarere end tre dimensioner kræver mindre intensiv billedanalyse; Således kan det udføres relativt hurtigt på en typisk stationær computer. Brug af denne enklere analyse gør det muligt at inkludere filamentlængdefordeling som en del af en screeningsprotokol, hvilket giver en mere nuanceret forståelse af hver mutants evne til at gennemgå morfogenese uden at forårsage væsentlige forsinkelser i gennemstrømningen.
De repræsentative undersøgelser, der præsenteres her, blev udført ved hjælp af DBA2/N-mus, som har en defekt i deres komplementsystem, der forårsager manglende rekruttering af neutrofiler til stedet for C. albicans-infektion 22. Målet med disse undersøgelser var at undersøge mekanismer til regulering af C. albicans filamentation i værtsvævet. Derfor blev DBA2/N-mus brugt til at undgå at forvirre resultaterne på grund af en individuel stammes modtagelighed eller resistens over for neutrofiler. Da det neutrofile anti-C. albicans-respons kan påvirke filamentation23, kan neutrofilrekruttering til infektionsstedet påvirke resultaterne af et morfogeneseassay. Hvis en stamme er i stand til at filamentere in vivo , men hæmmes kraftigt fra filamentering, når neutrofiler er til stede, vil filamentation blive påvist i DBA2/N-mus, men det vil sandsynligvis ikke ses, når mus med intakt neutrofil kemotaxis anvendes. Således er belastningen af musen, der bruges som vært, en vigtig faktor, når du bruger denne protokol.
Observationen af, at efg1ΔΔ-mutantstammen ikke filamenterer in vivo , er sandsynligvis ikke relateret til værtsneutrofile reaktioner, fordi denne stamme heller ikke filamenterer in vitro. Filamentationen, der observeres in vivo med cyr1ΔΔ-stammen, er uoverensstemmende med dens manglende filamentation in vitro. Data fra zebrafiskmodellen af C. albicans infektion indikerer, at reagerende neutrofiler er vigtige i forebyggelsen af morfogenese24. Derfor er det usandsynligt, at brugen af DBA2/N-mus, som mangler neutrofilresponser, vil forklare stigningen i filamentation af cyr1ΔΔ in vivo sammenlignet med in vitro. Ikke desto mindre påvirker in vivo-miljøet klart morfogenesen af cyr1ΔΔ-stammen; yderligere undersøgelse af denne stamme kan således give vigtige oplysninger om reguleringen af C. albicans morfogenese under aktive infektioner. Protokollen, der er beskrevet her, er designet som et screeningsassay for at identificere stammer såsom cyr1ΔΔ-stammen, der skal bruges i fremtidige undersøgelser.
Brugen af et lavstrømsgasbedøvelsessystem er meget nyttigt for denne protokol (figur 1A, B). Under den indledende udvikling af denne protokol blev mus bedøvet ved hjælp af en injicerbar bedøvelsescocktail af ketamin blandet med xylazin. Mens det var muligt at udføre begrænset billeddannelse med den bedøvelsesmetode, var varigheden af anæstesi uforudsigelig, hvilket krævede, at billeddannelsessessioner blev afsluttet hurtigt for at undgå, at musen kom sig efter anæstesi under billeddannelse. Traditionelle inhalerede bedøvelsessystemer er omfangsrige og kræver høje strømningshastigheder af bedøvelsesgasser, hvilket ofte kræver, at de bruges i en røghætte. Således ville traditionelle inhalerede bedøvelsessystemer være meget vanskelige at bruge med pladsbegrænsningerne i et konfokalmikroskop uden utilsigtet at udsætte efterforskerne for bedøvelsesmidlerne. Brugen af et inhaleret bedøvelsessystem med lav strømning muliggør ensartet anæstesi af dyret, samtidig med at der opretholdes et sikkert miljø for efterforskeren. Den lavstrøms næsekegle muliggør nem positionering af dyret til både podning og mikroskopi. Den lille kaliber, lavvolumen leveringsrør tillader brug af relativt lange rør, hvilket gør det muligt at placere anæstesimaskinen i en tilstrækkelig afstand for ikke at forstyrre mikroskopi.
Klorofyl til stede i typisk musechow fører til signifikant vævsautofluorescens25. Dette skaber betydelig støj i billederne, hvilket gør det vanskeligt at få billeder af høj kvalitet og høj rumlig opløsning. Når dyr blev fodret med klorofylfri chow i 7 dage før billeddannelse, blev baggrunden fra autofluorescens væsentligt reduceret i væv, men klorofyl deponeret i håret fortsatte med at være problematisk. Fjernelse af håret på pinnae ved hjælp af en over-the-counter kemisk hårfjerningscreme er effektiv til at minimere autofluorescens i håret (figur 1C, D). Således reducerede kombinationen af klorofylfri chow og tilstrækkelig hårfjerning væsentligt autofluorescens og forbedrede billedkvaliteten dramatisk. Fordi håret fjernes fra øret inden billeddannelse, påvirker farven på dyrets hår ikke dette system. Denne protokol er blevet brugt med succes til at studere C. albicans infektioner i BALB / c (hvid), C57BL / 6 (sort) og DBA2 / N (brun) mus. Protokollen kan også bruges med C57BL/6 knockout-mus, der mangler forskellige værtsgener; Dette vil muliggøre fremtidige undersøgelser af, hvordan pattedyrets værtsimmunsystem påvirker filamentering. Et træk ved denne model, der ikke er diskuteret i denne protokol, er, at fordi dette billeddannelsessystem er ikke-invasivt, kan det samme dyr afbildes gentagne gange over flere dage, hvilket gør det muligt at følge udviklingen af individuel infektion over tid. Denne funktion vil sandsynligvis spille en central rolle i fremtidige undersøgelser af værtspatogeninteraktionen.
Sammenfattende resulterer denne protokol i billeder med høj rumlig opløsning af C. albicans, der vokser i vævet hos en levende pattedyrvært, hvilket muliggør nøjagtig evaluering af morfogenese i mutante stammer 8,9,10. Resultaterne, der præsenteres her, viser, hvordan denne protokol kan bruges til at screene et bibliotek af C. albicans mutanter. Af de C. albicans mutanter, der er testet til dato, gennemgår en stor del af mutanter med kendte defekter i morfogenese in vitro let filamentation in vivo 9,10. Dette understreger vigtigheden af at inkludere et in vivo-system som dette i eksperimenter designet til at belyse mekanismerne i C. albicans patogenese.

Candida albicans er et almindeligt humant svampepatogen, der forårsager mucokutan sygdom, dissemineret sygdom og lokaliserede vævsinfektioner1. Et centralt træk ved C. albicans fysiologi er dens komplekse polymorfe vækst, som er knyttet til dens rolle som både en kommensal og et patogen 2,3,4. Under rige næringsstofforhold in vitro ved 30 °C vokser den typisk som en ovoid spirende gær. En række miljømæssige udløsere, herunder næringsstofmangel, pH-ændringer, vækst ved 37 °C, eksponering for serum og vækst, når de er indlejret i agar, resulterer i overgangen til et polariseret vækstmønster, hvilket resulterer i dannelse af ægte hyfer og / eller pseudohyphae5. Initieringen af polariseret vækst og den resulterende vækst af filamentøse organismer kaldes morfogenese.
På grund af betydningen af morfogenese i organismens virulens er reguleringen af hyphaldannelse blevet grundigt undersøgt 6,7. Der er et komplekst netværk af signalveje og transkriptionel regulering, der udløser morfogenese. På trods af forholdet mellem C. albicans morfogenese og patogenese har de fleste undersøgelser, der undersøger morfogenese, brugt in vitro-stimuli til at udløse hyphaldannelse. Det bliver mere og mere klart, at de forskellige in vitro-modeller for filamentering ikke er identiske med hensyn til de enkelte reguleringsveje, der stimuleres. Desuden svarer ingen in vitro-vækstbetingelser tæt til værtens komplekse miljø. I betragtning af betydningen af C. albicans som et humant patogen er målet med denne protokol at undersøge dets morfogenese under aktiv infektion i en pattedyrvært ved hjælp af et system med moderat gennemstrømning, hvilket gør det muligt for en efterforsker at screene C. albicans mutantbiblioteker. 
For at lette disse undersøgelser blev der udviklet et in vivo-billeddannelsessystem, der giver os mulighed for at opnå billeder med høj rumlig opløsning af C. albicans-celler under infektion af pinna fra en bedøvet mus ved hjælp af et omvendt konfokalt mikroskop 8,9,10. Fordi pinnaens hud er ret tynd, kan disse billeder opnås uden behov for vævsdissektion. Således kan kvantitative fænotypedata måles på stedet for aktive infektioner i værtsvævet. Den her beskrevne protokol indebærer omdannelse af en referencestamme og en eller flere mutante stammer med forskellige fluorescerende proteinekspressionskassetter11,12. De fluorescerende proteinekspressive stammer blandes derefter og co-injiceres intradermalt. Efter at infektionen er etableret, anvendes konfokal billeddannelse til at kvantificere både hyppigheden af filamentering og længden af de dannede filamenter. De data, der opnås fra de mutante stammer, normaliseres til dem, der opnås fra referencestammen, som er til stede i samme vævsområde, hvilket giver en intern kontrol. Dette system har gjort det muligt for os med succes at screene flere serier af C. albicans mutantstammer, hvoraf mange har morfogenesefejl in vitro 9,10. Mange af disse stammer filament let in vivo, hvilket fremhæver betydningen af in vivo-modeller til undersøgelse af morfogenese.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 coverslips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>20811</td>
			<td>large enough to cover the universal stage opening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 mL Insulin syringes</td>
			<td>EXELint</td>
			<td>26018</td>
			<td>Can use syringes that are 5/16&#34;&#8211;1/2&#34; long and 29&#8211;32 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.7% formaldehyde in dPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBJ5734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol/30% water</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>A05061001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.albicans reference strain and experimental strains</td>
			<td>SN250</td>
			<td>FGSC Online Catalog</td>
			<td>The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyl free mouse chow</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2920x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7050</td>
			<td>Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicator</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>76200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBA2/N (6-12 week old mice)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.&#160; The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.&#160; This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.&#160; It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.&#160; 
			Examples:&#160; 
			https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-40 
			https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174320&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-26 
			https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Must be sterile; open a new container for every experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze pad</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>P157112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel eye lurbicant</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ or FIJI analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ (FIJI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>J119005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8 (SP8)</td>
			<td>The objective lens&#160; (Leica 11506375) used here&#160; is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. 
			The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free&#160; spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. 
			The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific International</td>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair hair remover lotion</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Over the counter depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AB-101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent protein expression transformation constructs&#160; generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensitive laboratory tape</td>
			<td>Tape &#38; Label Graphic Systems Inc</td>
			<td>1007910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 cell culture medium</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>To safely hold the animals ear during injectinos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host

Candida albicans er et vigtigt humant patogen. Dens evne til at skifte mellem morfologiske former er central for dens patogenese; Disse morfologiske ændringer reguleres af et komplekst signalnetværk, der styres som reaktion på miljømæssige stimuli. Disse regulatoriske komponenter er blevet stærkt undersøgt, men næsten alle undersøgelser bruger en række in vitro-stimuli til at udløse filamentering. For at bestemme, hvordan morfogenese reguleres under patogeneseprocessen, udviklede vi et in vivo-mikroskopisystem for at opnå billeder med høj rumlig opløsning af organismer, der gennemgår hyphaldannelse i pattedyrsværten. Protokollen, der præsenteres her, beskriver brugen af dette system til at screene små samlinger af C. albicans mutante stammer, så vi kan identificere nøgleregulatorer af morfogenese, som det forekommer på infektionsstedet. Repræsentative resultater præsenteres, hvilket viser, at nogle regulatorer af morfogenese, såsom transkriptionsregulatoren Efg1, har konsistente fænotyper in vitro og in vivo, mens andre regulatorer, såsom adenylcyklase (Cyr1), har signifikant forskellige fænotyper in vivo sammenlignet med in vitro.

De resultater, der præsenteres her, er baseret på tidligere offentliggjorte rapporter 9,10. Målet med denne analyse er kvantitativt at evaluere mutant C. albicans stammers evne til at gennemgå morfogenese under aktive infektioner. De typiske parametre, der adskiller pseudohyphae fra hyfer, kan være vanskelige at evaluere i organismer, der vokser i tre dimensioner i et komplekst in vivo-miljø. Dette gælder især, når man ser på de todimensionelle tværsnit skabt af konfokal billeddannelse. Derfor er denne screeningsanalyse fokuseret på at identificere organismer, der vokser som trådformede versus gær. Til opfølgende undersøgelser ved hjælp af en mere dybtgående analyse, herunder tredimensionelle rekonstruktioner, kan denne metode tilpasses til at diskriminere gær, hyfer og pseudohyphae.
Ekspressionen af et fluorescerende protein i en reference- eller mutantstamme af C. albicans muliggør ligefrem påvisning af stammemorfologi in vivo (figur 3 og figur 4). Generelt udføres kvantitativ lysmikroskopianalyse bedst, når få eller ingen af pixels i billedet er mættede. For denne protokol forenkler en mætning af billedet imidlertid ofte analysen. Fluorescerende proteinlokalisering er ikke ensartet i hele cellen og er ofte højere i modergæren end i filamenter. Heldigvis definerer signalets rumlige fordeling snarere end dets intensitet resultatet til undersøgelse af morfogenese. Derfor forbedrer opnåelse af billeder, hvor mange pixels er mættede, evnen til at kvantificere morfogenese i dette assay.
For at illustrere vigtigheden af at evaluere morfogenese in vivo præsenteres repræsentative resultater for referencestammen (SN250) og to mutanter: den ene mangler transkriptionsfaktoren Efg1 og den anden mangler adenylylcyklase Cyr1. In vitro vokser ingen af disse stammer som filamenter20,21. Når den dyrkes in vitro i RPMI-medium suppleret med 10% serum, danner referencestammen hurtigt filamenter, mens efg1ΔΔ- og cyr1ΔΔ-stammerne ikke gør det (figur 3 og figur 4). Under disse forhold udviser efg1ΔΔ-mutanten noget polariseret vækst, hvor dattercellerne er lidt aflange sammenlignet med modercellerne. Dette understreger vigtigheden af at bruge en klar definition af filamentering. Enhver sådan definition er som standard vilkårlig, men det er nødvendigt for konsekvent evaluering af fænotypen. Til disse undersøgelser defineres et trådformet vækstmønster som en organisme med den længste dimension af en dattercelle mere end dobbelt så stor som modercellen. Ved hjælp af denne definition er de aflange efg1ΔΔ-celler ikke trådformede.
I overensstemmelse med sin in vitro-fænotype udviser efg1 ΔΔ en signifikant filamentationsfejl in vivo: ca. 9% af efg1ΔΔ-cellerne voksede som filamenter in vivo (figur 3). I modsætning hertil voksede 53% af cyr1ΔΔ-mutantcellerne som filamenter in vivo (figur 4). Selvom antallet af cyr1 ΔΔ-mutante celler, der gennemgår filamentation in vivo, var signifikant lavere end referencestammen, repræsenterer cyr1ΔΔ-mutantens evne til at danne filamenter in vivo en væsentlig ændring fra dens fuldstændige mangel på morfogenese in vitro. Visuelt syntes filamenterne dannet af cyr1ΔΔ-mutanten at være kortere end referencestammen. For at evaluere dette kvantitativt blev kurvebanelængden af de trådformede celler målt ved hjælp af en todimensionel projektion af in vivo-billederne (figur 4E). Medianlængden af cyr1ΔΔ-filamenter var 29% kortere end filamenter af referencestammen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg"> Figur 1: Anæstesi og podning . (A) Induktion af anæstesi ved hjælp af et induktionskammer. (B) Anæstesi opretholdes ved hjælp af en næsekegle, så musen kan omplaceres efter behov. (C) Hårfjerningscreme påføres ved hjælp af en applikator med bomuldsspids. Øjensmøregel er blevet påført for at beskytte øjnene under anæstesi. (D) Effektiv hårfjerning af højre øre. Sammenlign med det ubehandlede venstre øre. (E) Intradermal injektion af C. albicans i museøret. Øret holdes på plads ved hjælp af spidsen af et konisk rør indpakket med dobbeltsidet hudbånd (modebånd). (F) Nærbillede af intradermal injektion. En bleg boble dannes i huden, hvilket er et tegn på en vellykket intradermal placering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg"> Figur 2: Forberedelse til billeddannelse. (A) Mikroskopfase forberedt til billeddannelse. Anæstesi næsekeglen er fastgjort på plads. En dæksel er tapet til scenen, der dækker linseåbningen. Yderligere stykker tape er tilgængelige. Det opvarmede trin forvarmes til 37 °C (vises ikke). (B) Placering af den bedøvede mus i anæstesinæsekeglen. (C) Musen drejes lidt, så den side af øret, der blev podet, vender mod den nederste dæksel/objektivlinse. Øret flades derefter mod bunddækslet og fastgøres på plads ved at placere en anden dæksel oven på øret. (D) Den øverste dæksel tapes til trinnet for at fastgøre øret på plads i forhold til mikroskoptrinnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg"> Figur 3: In vitro - og in vivo-morfologi af efg1ΔΔ-mutantstammen. (A) Widefield-billede af WT- og efg1ΔΔ-mutantstammer efter in vitro-induktion af filamentation ved dyrkning af celler i RPMI + 10% serum ved 37 °C i 4 timer. Skalabjælker repræsenterer 10 μm. Billedkontrast blev justeret ved hjælp af fotoredigeringssoftware for at lette visningen. (B) Procentdel af filamentation in vitro observeret i WT- og efg1ΔΔ-mutantstammerne. Und = ikke detekterbar (der blev ikke påvist filamenter). Bjælkehøjde repræsenterer medianprocenten af trådceller fra tre uafhængige eksperimenter, hvor mindst 100 celler blev kvantificeret. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelse (resultater sammenlignet med elevens t-test, p < 0,001). C) Konfokal mikrograf af WT (grøn) og efg1ΔΔ-mutanten (rød), der vokser in vivo 24 timer efter podning. Pile angiver eksempler på efg1ΔΔ mutante celler, der opfylder vores definition af "trådformet". Skalabjælken repræsenterer 50 μm. (D) Procentdel af filamentation in vivo observeret i WT- og efg1ΔΔ-mutantstammerne. Søjlehøjde repræsenterer medianprocenten af trådceller fra to uafhængige eksperimenter. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelse (resultater sammenlignet med elevens t-test, p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg"> Figur 4: In vitro og in vivo morfologi af cyr1 ΔΔ mutantstammen. (A) Widefield-billede af cyr1ΔΔ-mutantstammen efter in vitro-induktion af filamentation ved at dyrke celler i RPMI + 10% serum ved 37 °C i 4 timer. Skalabjælken repræsenterer 10 μm. Billedkontrast blev justeret ved hjælp af fotoredigeringssoftware for at lette visningen. (B) Procentdel af filamentation in vitro observeret i WT- og cyr1ΔΔ-mutantstammerne. Und = ikke detekterbar (der blev ikke påvist filamenter). Bjælkehøjde repræsenterer medianprocenten af trådceller fra tre uafhængige eksperimenter, hvor mindst 100 celler blev kvantificeret. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelse (resultater sammenlignet med elevens t-test, p < 0,001). (C) Konfokal mikrograf af WT (grøn) og cyr1ΔΔ-mutanten (rød), der vokser in vivo 24 timer efter podning. Skalabjælken repræsenterer 50 μm. (D) Procentdel af filamentation in vivo observeret i WT- og cyr1ΔΔ-mutantstammerne. Søjlehøjde repræsenterer medianprocenten af trådceller fra to uafhængige eksperimenter. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelse (resultater sammenlignet med elevens t-test, p < 0,001). (E) Fordeling af glødetrådslængde in vivo målt ved kurvebanelængde i en todimensionel projektion af z-stakken. Hver prik repræsenterer længden af et filament. Celler, der voksede som gær, blev ikke inkluderet i denne analyse. Bar angiver median filament længde. Fordelingen af længder er signifikant anderledes, når den analyseres ved hjælp af en Mann-Whitney U-test (p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Dette manuskript beskriver en metode til screening af moderat størrelse Candida albicans mutantbiblioteker for morfogenesefænotyper under aktiv infektion i en pattedyrsvært ved hjælp af ikke-invasiv konfokal mikroskopi.

Brug af In Vivo-billeddannelse til screening for morfogenesefænotyper i Candida albicans mutante stammer under aktiv infektion i en pattedyrvært

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

Candida albicans morfogenese udløses af et utal af miljøsignaler. Ved at studere morfogenese in vivo bestemmer vi, hvordan organismen integreres og reagerer på alle disse miljøsignaler. Den største fordel ved denne teknik er, at den giver os mulighed for at studere morfogenese i fravær af bias eller artefakter, der kan introduceres ved hjælp af in vitro-modelsystemer.Meget få mennesker har erfaring med intradermale injektioner. Jeg anbefaler kraftigt, at en ny til denne teknik kontakter deres dyreressourcedyrlæge for at få hjælp til at lære det. Rohan Wakade, en postdoktor fra vores laboratoriegruppe, demonstrerer proceduren.Begynd med at forberede dyret til podning ved at fodre klorofylfri chow i mindst syv dage før podning. En dag før injektion skal du tage en dab af Canada albicans celler fra en koloni ved hjælp af en tandstikker. Pod 25 ml YPD og gentag denne proces flere gange for at opnå celler fra flere forskellige kolonier.Inkuber kulturen natten over ved 30 grader Celsius i en orbital shaker-inkubator ved 175 o / min. Centrifuge en milliliter kultur i to minutter ved 500 x g, vask derefter gæren tre gange med en milliliter steril DPBS. Resuspender pelleten i en milliliter steril DPBS og fortynd kulturen ved 1 til 100.Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer, og juster derfor celletætheden. Opret derefter podekulturen til injektion ved at blande lige store mængder af den refererede og eksperimentelle stamme. Brug en vatpind i bomuld til at anvende en over-the-counter hårfjerningscreme liberalt på den indre og ydre overflade af begge ører på et bedøvet dyr.Efter to til tre minutter tørres øret forsigtigt med et tørt gasbind efterfulgt af gasbind mættet i sterilt vand for grundigt at fjerne hårfjerningscremerester. Efter sterilisering af ørens overflade med 70% ethanol blandes inokulumet godt ved at vende hætteglasset flere gange eller hvirvle det. Tegn 20 til 30 mikroliter inokulum i en insulinsprøjte.Hold kanylen i opretstående stilling, og bank forsigtigt på sprøjten for at sikre, at der er luft i tønden øverst. Skub forsigtigt luft og overskydende podeglas tilbage i poderøret eller et affaldsrør, så stemplet er ved 10 mikroliter-mærket. Påfør over disken dobbeltsidet hudtape på et lille konisk eller rundbundet plastrør og drapér øret over båndet, så du undgår at løsne anæstesinæsekeglen.Hold sprøjtenålen næsten parallel med huden og undgå store vener, indsæt spidsen af nålen i det yderste lag af huden, indtil skråen er lige dækket, og injicer langsomt podet intradermalt. En god intradermal injektion vil hæve en lille boble i huden. Hold nålen på plads i 15 til 20 sekunder, før du fjerner den fra øret for at minimere lækage.I henhold til institutionelle protokoller skal du markere buret med biohazard-etiketter, der angiver, at dyr i buret er inficeret med Candida albicans. Ved hjælp af de samme vaskede kulturer, der blev brugt til at forberede podningen, skabes en 1 til 50 fortynding af celler i RPMI 1640, suppleret med 10% varme og aktiveret føtalt bovint serum og inkuberes ved 37 grader Celsius med tumbling i fire timer. Prøven undersøges ved hjælp af et mikroskop.Tæl mindst 100 celler, og registrer antallet af gær- og trådceller for hver stamme. Drej det lange arbejdsdistancemål på plads, og læg en dråbe nedsænkningsvæske på linsen. Sænk objektivet for at undgå mulig skade, når dækslet placeres.Plads nummer 1.5 dæksel glider over sceneåbningen og tape den på plads. Hæv målet, så nedsænkningsvæsken er i kontakt med både objektivlinsen og dækselslippen. Fastgør en anæstesi næsekegle på mikroskopstadiet på en sådan måde, at den dækker dyrets næse helt, når den er i position til billeddannelse.Placer næsen på en bedøvet mus i næsekeglen. Placer en dråbe sterilt vand på dækselslippet over objektivlinsen. Juster anæstesinæsekeglen, og placer musen, så musens øre er over vanddråben.Tag en anden dækselseddel, og placer dækslipens kant parallelt med musens krop med kanten, der rører musen, hvor øret møder hovedet. Brug en hængselbevægelse til at sænke den frie kant af dækslet glide til mikroskoptrinnet. Da dækselslippet kommer mod mikroskoptrinnet, vil det flade øret.Tape topdækslet sikkert for at holde lige nok tryk til at holde øret fladt og undgå at fange musens hår eller knurhår i båndet. Medmindre der anvendes et mikroskop med et miljøkammer, skal du løse musens krop med en steril drapering for at opretholde et normalt termisk miljø. Ved hjælp af hvidt lys, widefield-billeddannelse, juster fokusplanet ind i ørevævet og fokuser på de røde blodlegemer, der bevæger sig i blodkarrene.For at opnå et stærkt nok signal til støjforhold, så morfologi kan bestemmes for alle celler i synsfeltet, skal du justere lasereffekten eller billeddannelseshastigheden. For at undgå vævsskade skal du bruge den lavest mulige lasereffekt. Vælg et synsfelt med klar filamentdannelse i den refererede stamme, og hvor de fleste organismer er spredt nok ud til, at deres morfologi kan bestemmes.Indstil de øverste og nederste fokusplaner for en Z-stak. Det er ikke nødvendigt at dække hele dybden af det inficerede område, men husk på, at organismer øverst eller nederst i det afbildede volumen typisk udelukkes fra analysen. Anskaf Z-stack-billeder, pseudofarve hver kanal for at skelne mellem hver stamme og overlejre kanalerne.Gem billederne. Brug billedbehandlingssoftware til at udføre en maksimal projektion af Z-stakken til et todimensionelt billede. Tæl hver organisme set i de maksimale projektionsbilleder efter stammetype og morfologi.Den refererede stamme danner hurtigt filamenter in vitro. Mens EFG1 Null ikke dannede filamenterne. EFG1 Null udviser også en betydelig filamentationsfejl in vivo.Ca. 9% af EFG1 Null-celler voksede som filamenter in vivo. Tilsvarende viste CYR1 Null-mutantstammen en filamentationsdefekt in vitro sammenlignet med den refererede stamme. I modsætning hertil voksede 53% af CYR1 Null-mutantcellerne som filamenter in vivo.Filamenterne dannet af CYR1 Null-mutanten var kortere end den refererede stamme. Det er vigtigt at holde nålen parallel med huden under podning. Målet er at placere podemuskulaturen lige under det ydre lag af huden.Denne teknik kan også bruges med musestammer, der udtrykker et fluorescerende protein i værtsceller af interesse, så vi kan studere værtspatogeninteraktioner in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Brug af kunstig Sputum Medium til Test antibiotikum Effekt mod<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I forhold mere relevante for cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

At studere mikrobielle samfund<em&gt; In vivo</em&gt;: En model af Host-medieret samspil mellem<em&gt; Candida albicans</em&gt; Og<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I luftvejene

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En simpel og effektiv tilgang til Construct Mutant vacciniavirus Vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Undersøgelse af Host fænotyper i<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Efter behandling med antibiotika

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Imaging celle interaktion i trakeal slimhinde under Influenza virusinfektion ved hjælp af to-foton Intravital mikroskopi

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Afklaring og Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

En Ex vivo Assay at studere Candida albicans Hyphal Morphogenese i mave-tarmkanalen

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Tilbagevendende Escherichia coli urinvejsinfektion udløst af Gardnerella vaginalis Blæreeksponering hos mus

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...