Name: use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie 1R01AI33409 en de afdeling Kindergeneeskunde, Carver College of Medicine, University of Iowa.

<ol>
	<li>Lopes, J. P., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+virulence+of+Candida+albicans.">Pathogenesis and virulence of Candida albicans.</a> Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+control+of+cell+morphology+in+vivo+reveals+distinct+roles+for+yeast+and+filamentous+forms+of+Candida+albicans+during+infection.">Engineered control of cell morphology in vivo reveals distinct roles for yeast and filamentous forms of Candida albicans during infection.</a> Eukaryotic Cell. 2 (5), 1053-1060 (2003).</li><li>Arita, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+associated+proteins+involved+in+filamentation+with+impact+on+the+virulence+of+Candida+albicans.">Cell wall associated proteins involved in filamentation with impact on the virulence of Candida albicans.</a> Microbiological Research. 258, 126996 (2022).</li><li>Rai, L. S., Wijlick, L. V., Bougnoux, M. E., Bachellier-Bassi, S., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+commensal+and+pathogenic+life-styles+of+an+opportunistic+fungus-Candida+albicans.">Regulators of commensal and pathogenic life-styles of an opportunistic fungus-Candida albicans.</a> Yeast. 38 (4), 243-250 (2021).</li><li>Sudbery, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Candida+albicans+hyphae.">Growth of Candida albicans hyphae.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).</li><li>Basso, V., d'Enfert, C., Znaidi, S., Bachellier-Bassi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+genes+to+networks:+The+regulatory+circuitry+controlling+candida+albicans+morphogenesis.">From genes to networks: The regulatory circuitry controlling candida albicans morphogenesis.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 422, 61-99 (2019).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+Candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in Candida species.</a> Elife. 10, 64682 (2021).</li><li>Mitra, S., Dolan, K., Foster, T. H., Wellington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+morphogenesis+of+Candida+albicans+during+infection+in+a+live+animal.">Imaging morphogenesis of Candida albicans during infection in a live animal.</a> Journal of Biomedical Optics. 15 (1), 010504 (2010).</li><li>Wakade, R. S., Huang, M., Mitchell, A. P., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+Candida+albicans+identifies+differential+in+vitro+and+in+vivo+filamentation+phenotypes+for+transcription+factor+deletion+mutants.">Intravital imaging of Candida albicans identifies differential in vitro and in vivo filamentation phenotypes for transcription factor deletion mutants.</a> mSphere. 6 (3), 0043621 (2021).</li><li>Wakade, R. S., Kramara, J., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+filamentation+does+not+require+the+cAMP-PKA+pathway+in+vivo.">Candida albicans filamentation does not require the cAMP-PKA pathway in vivo.</a> mBio. 13 (3), 0085122 (2022).</li><li>Bergeron, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Pseudomonas+aeruginosa+interact+to+enhance+virulence+of+mucosal+infection+in+transparent+zebrafish.">Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa interact to enhance virulence of mucosal infection in transparent zebrafish.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 00475 (2017).</li><li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+and+filaments+have+specialized,+independent+activities+in+a+zebrafish+model+of+Candida+albicans+infection.">Yeast and filaments have specialized, independent activities in a zebrafish model of Candida albicans infection.</a> Infection and Immunity. 86 (10), 00415-00418 (2018).</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 6th edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html">https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html</a> (2020)</li><li>Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotypic+profile+of+the+Candida+albicans+regulatory+network.">A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network.</a> Plos Genetics. 5 (12), 1000783 (2009).</li><li>Cullen, P. J., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+filamentous+growth+in+yeast.">The regulation of filamentous growth in yeast.</a> Genetics. 190 (1), 23-49 (2012).</li><li>Herrero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+filament+formation+in+Candida+albicans+by+polyamine+levels.">Control of filament formation in Candida albicans by polyamine levels.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4870-4878 (1999).</li><li>Ahmad Hussin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+auxotrophy+and+biotin+enhanced+germ+tube+formation+in+Candida+albicans.">Biotin auxotrophy and biotin enhanced germ tube formation in Candida albicans.</a> Microorganisms. 4 (3), 37 (2016).</li><li>Nantel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+profiling+of+Candida+albicans+cells+undergoing+the+yeast-to-hyphal+transition.">Transcription profiling of Candida albicans cells undergoing the yeast-to-hyphal transition.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3452-3465 (2002).</li><li>Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strains+and+strategies+for+large-scale+gene+deletion+studies+of+the+diploid+human+fungal+pathogen+Candida+albicans.">Strains and strategies for large-scale gene deletion studies of the diploid human fungal pathogen Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 4 (2), 298-309 (2005).</li><li>Glazier, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EFG1,+Everyone's+favorite+gene+in+Candida+albicans:+A+comprehensive+literature+review.">EFG1, Everyone's favorite gene in Candida albicans: A comprehensive literature review.</a> Frontiers in Cellular Infection and Microbiology. 12, 855229 (2022).</li><li>Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+and+diverse+regulation+of+the+Ras/cAMP/protein+kinase+A+pathway+in+Candida+albicans.">Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Chaturvedi, A. K., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+genetically+engineered+strain+to+evaluate+the+pathogenic+potential+of+yeast+cell+and+filamentous+forms+during+Candida+albicans+systemic+infection+in+immunodeficient+mice.">Use of a genetically engineered strain to evaluate the pathogenic potential of yeast cell and filamentous forms during Candida albicans systemic infection in immunodeficient mice.</a> Infection and Immunity. 76 (1), 97-102 (2008).</li><li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth.">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryotic Cell. 10 (7), 932-944 (2011).</li><li>Brothers, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase-driven+phagocyte+recruitment+controls+Candida+albicans+filamentous+growth+and+prevents+mortality.">NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003634 (2013).</li><li>Holmes, H., Kennedy, J. C., Pottier, R., Rossi, R., Weagle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recipe+for+the+preparation+of+a+rodent+food+that+eliminates+chlorophyll-based+tissue+fluorescence.">A recipe for the preparation of a rodent food that eliminates chlorophyll-based tissue fluorescence.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B: Biology. 29 (2-3), 199 (1995).</li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dit model maakt gebruik van confocale microscopie om beelden te verkrijgen van C. albicans-organismen terwijl ze groeien in het weefsel van een zoogdiergastheer, waardoor we morfogenesefenotypen tijdens actieve infectie kunnen evalueren. Het proces van morfogenese staat centraal in de pathogenese van C. albicans en is op grote schaal bestudeerd met behulp van een verscheidenheid aan in vitro assays 2,3,4. Geen enkele in vitro test kan echter de complexe biochemische en structurele omgeving van de gastheer volledig modelleren.
Het hier beschreven protocol is gericht op het gebruik van dit in vivo beeldvormingssysteem om een reeks / bibliotheek van C. albicans-mutanten te screenen om de genen te identificeren die betrokken zijn bij morfogenese tijdens infectie. Het gebruik van C. albicans-stammen die verschillende fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, stelt ons in staat om in vivo morfogenese van C. albicans mutante stammen te kwantificeren in vergelijking met die van een referentiestam. Het vergelijken van morfogenese in de mutant met de referentiestam binnen hetzelfde infectiegebied zorgt ervoor dat de organismen worden blootgesteld aan identieke omgevingen. Dit maakt kwantitatieve meting mogelijk van het percentage cellen dat filamentatie ondergaat, evenals de mate van filamentatie. Normalisatie van de metingen van de mutante stam(en) ten opzichte van die van de referentiestam stelt ons in staat om de prestaties van de ene mutant beter met de andere te vergelijken.
De hier gepresenteerde representatieve resultaten tonen het potentieel aan voor een significante discrepantie tussen in vitro en in vivo fenotypen. De C. albicans efg1ΔΔ mutante stam wordt vaak gebruikt als een negatieve controle voor morfogenese-assays omdat het in bijna alle in vitro omstandigheden nietfilamenteert 20. Hoewel de in vivo resultaten sterk leken op de in vitro resultaten, vormde zelfs deze ernstig belemmerde stam af en toe filamenten in de gastheerweefselomgeving (figuur 3). Dit benadrukt de kracht van de gastheeromgeving bij het activeren van morfogenese.
Daarentegen vertoont de cyr1ΔΔ mutante stam een aanzienlijke discrepantie tussen in vitro en in vivo groei; hoewel geen van de mutante cellen in vitro filamentatie ondergaat, groeit ongeveer de helft van de cellen in vivo als filamenten (figuur 4)10,21. Interessant is dat deze filamenten significant korter waren dan die gevormd door de referentiestam, wat suggereert dat CYR1 bijdraagt aan de snelheid van filamentgroei of het vermogen om een filamenteus fenotype te behouden. Om de analyse van de filamentlengte te vergemakkelijken, werd de lengte van het curvepad van de filamenten gemeten met behulp van een tweedimensionale projectie van de afbeeldingen. In tweedimensionale projecties van filamenten die in drie dimensies groeien, zal elk filament dat groeit op een as die niet evenwijdig is aan het xy-vlak, net zo korter projecteren dan zijn werkelijke lengte. Aangezien deze foreshortening ook voorkomt voor de referentiestam, maakt het evalueren van de verdeling van filamentlengtes in een tweedimensionale projectie nog steeds een kwantitatieve vergelijking mogelijk tussen de referentie- en mutante stammen. Analyse van filamentlengte in twee in plaats van drie dimensies vereist minder intensieve beeldanalyse; het kan dus relatief snel worden uitgevoerd op een typische desktopcomputer. Het gebruik van deze eenvoudigere analyse maakt het mogelijk om filamentlengteverdeling op te nemen als onderdeel van een screeningprotocol, waardoor een genuanceerder inzicht ontstaat in het vermogen van elke mutant om morfogenese te ondergaan zonder aanzienlijke vertragingen in de doorvoer te veroorzaken.
De hier gepresenteerde representatieve studies werden uitgevoerd met behulp van DBA2/N-muizen, die een defect in hun complementsysteem hebben waardoor neutrofielen niet worden gerekruteerd naar de plaats van C. albicans-infectie 22. Het doel van deze studies was om mechanismen van de regulatie van C. albicans filamentatie in het gastheerweefsel te onderzoeken. Daarom werden DBA2/N-muizen gebruikt om te voorkomen dat de resultaten in de war raakten vanwege de gevoeligheid of resistentie van een individuele stam tegen neutrofielen. Aangezien de neutrofiele anti-C. albicans-respons de filamentatie kan beïnvloeden23, kan neutrofielenrekrutering naar de plaats van infectie de resultaten van een morfogenesetest beïnvloeden. Als een stam in staat is om in vivo te filamenteren, maar sterk wordt geremd door filamentatie wanneer neutrofielen aanwezig zijn, zou filamentatie worden gedetecteerd in DBA2 / N-muizen, maar zou het onwaarschijnlijk zijn dat het wordt gezien bij het gebruik van muizen met intacte neutrofiele chemotaxis. De stam van de muis die als gastheer wordt gebruikt, is dus een belangrijke factor bij het gebruik van dit protocol.
De waarneming dat de efg1ΔΔ mutante stam niet in vivo filamenteert, is waarschijnlijk niet gerelateerd aan gastheerneurtrofiele reacties, omdat deze stam ook niet in vitro filamenteert. De filamentatie die in vivo wordt waargenomen met de cyr1ΔΔ-stam is discordant met het falen van filamentatie in vitro. Gegevens van het zebravismodel van C. albicans-infectie geven aan dat reagerende neutrofielen belangrijk zijn bij de preventie van morfogenese24. Daarom is het onwaarschijnlijk dat het gebruik van DBA2/N-muizen, die geen neutrofiele responsen hebben, de toename van de filamentatie van de cyr1ΔΔ in vivo in vergelijking met in vitro verklaart. Niettemin heeft de in vivo omgeving duidelijk invloed op de morfogenese van de cyr1ΔΔ-stam; verder onderzoek van deze stam kan dus belangrijke informatie opleveren over de regulatie van C. albicans morfogenese tijdens actieve infecties. Het hier beschreven protocol is ontworpen als een screeningstest om stammen zoals de cyr1ΔΔ-stam te identificeren die in toekomstige studies zullen worden gebruikt.
Het gebruik van een low-flow gas anesthesiesysteem is zeer nuttig voor dit protocol (figuur 1A,B). Tijdens de eerste ontwikkeling van dit protocol werden muizen verdoofd met behulp van een injecteerbare anesthetische cocktail van ketamine gemengd met xylazine. Hoewel het mogelijk was om beperkte beeldvorming uit te voeren met die anesthesiemethode, was de duur van de anesthesie onvoorspelbaar, waardoor beeldvormingssessies snel moesten worden beëindigd om te voorkomen dat de muis tijdens de beeldvorming herstelde van anesthesie. Traditionele geïnhaleerde anesthetische systemen zijn omvangrijk en vereisen hoge stroomsnelheden van anesthetische gassen, waardoor ze vaak in een zuurkast moeten worden gebruikt. Traditionele geïnhaleerde anestheticasystemen zouden dus zeer moeilijk te gebruiken zijn met de ruimtebeperkingen van een confocale microscoop zonder de onderzoekers per ongeluk bloot te stellen aan de anesthetica. Het gebruik van een low-flow geïnhaleerd anestheticumsysteem maakt consistente anesthesie van het dier mogelijk met behoud van een veilige omgeving voor de onderzoeker. De low-flow nosecone maakt een eenvoudige positionering van het dier mogelijk voor zowel inenting als microscopie. De kleine kaliber, low-volume delivery tubing maakt het gebruik van relatief lange buizen mogelijk, waardoor het anesthesieapparaat op voldoende afstand kan worden geplaatst om microscopie niet te verstoren.
Het chlorofyl dat aanwezig is in typische muizen chow leidt tot significante weefselautofluorescentie25. Dit zorgt voor aanzienlijke ruis in de beelden, waardoor het moeilijk is om beelden van hoge kwaliteit en een hoge ruimtelijke resolutie te verkrijgen. Wanneer dieren gedurende 7 dagen voorafgaand aan beeldvorming chlorofylvrije chow kregen, was de achtergrond van autofluorescentie aanzienlijk afgenomen in weefsel, maar chlorofyl afgezet in het haar bleef problematisch. Het verwijderen van het haar op de pinnae met behulp van een vrij verkrijgbare chemische ontharingscrème is effectief in het minimaliseren van autofluorescentie in het haar (figuur 1C, D). De combinatie van chlorofylvrije chow en adequate ontharing verminderde dus aanzienlijk de autofluorescentie en verbeterde de beeldkwaliteit dramatisch. Omdat het haar uit het oor wordt verwijderd voorafgaand aan de beeldvorming, heeft de kleur van het haar van het dier geen invloed op dit systeem. Dit protocol is met succes gebruikt om C. albicans-infecties te bestuderen bij BALB / c (wit), C57BL / 6 (zwart) en DBA2 / N (bruine) muizen. Het protocol kan ook worden gebruikt met C57BL/6 knock-out muizen die een tekort hebben aan verschillende gastheergenen; dit zal toekomstige onderzoeken mogelijk maken naar hoe het immuunsysteem van de gastheer van zoogdieren de filamentatie beïnvloedt. Een kenmerk van dit model dat niet in dit protocol wordt besproken, is dat, omdat dit beeldvormingssysteem niet-invasief is, hetzelfde dier gedurende meerdere dagen herhaaldelijk kan worden afgebeeld, waardoor de voortgang van individuele infectie in de loop van de tijd kan worden gevolgd. Deze functie zal waarschijnlijk een sleutelrol spelen in toekomstige studies naar de gastheer-pathogeen interactie.
Samenvattend resulteert dit protocol in beelden met een hoge ruimtelijke resolutie van C. albicans die groeien in het weefsel van een levende zoogdiergastheer, waardoor een nauwkeurige evaluatie van morfogenese in mutante stammen mogelijk is 8,9,10. De hier gepresenteerde resultaten laten zien hoe dit protocol kan worden gebruikt om een bibliotheek van C. albicans-mutanten te screenen. Van de tot nu toe geteste C. albicans-mutanten ondergaat een groot deel van de mutanten met bekende defecten in morfogenese in vitro gemakkelijk filamentatie in vivo 9,10. Dit benadrukt het belang van het opnemen van een in vivo systeem zoals dit in experimenten die zijn ontworpen om de mechanismen van C. albicans pathogenese op te helderen.

Candida albicans is een veel voorkomende menselijke schimmelpathogeen, die mucocutane ziekte, gedissemineerde ziekte en gelokaliseerde weefselinfecties veroorzaakt1. Een belangrijk kenmerk van de fysiologie van C. albicans is de complexe polymorfe groei, die verband houdt met zijn rol als zowel een commensale als een pathogeen 2,3,4. Onder rijke voedingscondities in vitro bij 30 °C groeit het meestal als een eivormige ontluikende gist. Een verscheidenheid aan omgevingstriggers, waaronder nutriëntengebrek, pH-veranderingen, groei bij 37 °C, blootstelling aan serum en groei wanneer ingebed in agar, resulteren in de overgang naar een gepolariseerd groeipatroon, wat resulteert in de vorming van echte schimmeldraden en / of pseudohyphae5. Het initiëren van gepolariseerde groei en de daaruit voortvloeiende groei van filamenteuze organismen wordt morfogenese genoemd.
Vanwege het belang van morfogenese in de virulentie van het organisme, is de regulatie van hyphale vorming uitgebreid bestudeerd 6,7. Er is een complex netwerk van signaalroutes en transcriptionele regulatie dat morfogenese veroorzaakt. Ondanks de relatie van C. albicans morfogenese met pathogenese, hebben de meeste studies die morfogenese onderzoeken in vitro stimuli gebruikt om hyphale vorming te veroorzaken. Het wordt steeds duidelijker dat de verschillende in vitro modellen van filamentatie niet identiek zijn in termen van de individuele regulatoire routes die worden gestimuleerd. Bovendien komen geen in vitro groeiomstandigheden nauw overeen met de complexe omgeving van de gastheer. Gezien het belang van C. albicans als een menselijke ziekteverwekker, is het doel van dit protocol om de morfogenese ervan te onderzoeken tijdens actieve infectie in een zoogdiergastheer met behulp van een systeem met matige doorvoer, waardoor een onderzoeker C. albicans mutant bibliotheken kan screenen.
Om deze onderzoeken te vergemakkelijken, werd een in vivo beeldvormingssysteem ontwikkeld waarmee we beelden met een hoge ruimtelijke resolutie van C. albicans-cellen kunnen verkrijgen tijdens infectie van de pinna van een verdoofde muis met behulp van een omgekeerde confocale microscoop 8,9,10. Omdat de huid van de pinna vrij dun is, kunnen deze beelden worden verkregen zonder dat weefseldissectie nodig is. Zo kunnen kwantitatieve fenotypegegevens worden gemeten op de plaats van actieve infecties in het gastheerweefsel. Het hier beschreven protocol omvat de transformatie van een referentiestam en een of meer mutante stammen met verschillende fluorescerende eiwitexpressiecassettes11,12. De fluorescerende eiwitexpressiestammen worden vervolgens gemengd en gelijktijdig intradermaal geïnjecteerd. Nadat de infectie is vastgesteld, wordt confocale beeldvorming gebruikt om zowel de frequentie van filamentatie als de lengte van de gevormde filamenten te kwantificeren. De gegevens verkregen van de mutante stammen worden genormaliseerd tot die verkregen uit de referentiestam, die in hetzelfde weefselgebied aanwezig is, waardoor een interne controle wordt geboden. Dit systeem heeft ons in staat gesteld om met succes verschillende series C. albicans mutante stammen te screenen, waarvan er vele morfogenesedefecten hebben in vitro 9,10. Veel van deze stammen filamenten gemakkelijk in vivo, wat het belang van in vivo modellen voor het onderzoek naar morfogenese benadrukt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 coverslips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>20811</td>
			<td>large enough to cover the universal stage opening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 mL Insulin syringes</td>
			<td>EXELint</td>
			<td>26018</td>
			<td>Can use syringes that are 5/16&#34;&#8211;1/2&#34; long and 29&#8211;32 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.7% formaldehyde in dPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBJ5734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol/30% water</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>A05061001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.albicans reference strain and experimental strains</td>
			<td>SN250</td>
			<td>FGSC Online Catalog</td>
			<td>The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyl free mouse chow</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2920x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7050</td>
			<td>Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicator</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>76200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBA2/N (6-12 week old mice)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.&#160; The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.&#160; This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.&#160; It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.&#160; 
			Examples:&#160; 
			https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-40 
			https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174320&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-26 
			https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Must be sterile; open a new container for every experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze pad</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>P157112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel eye lurbicant</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ or FIJI analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ (FIJI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>J119005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8 (SP8)</td>
			<td>The objective lens&#160; (Leica 11506375) used here&#160; is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. 
			The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free&#160; spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. 
			The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific International</td>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair hair remover lotion</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Over the counter depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AB-101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent protein expression transformation constructs&#160; generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensitive laboratory tape</td>
			<td>Tape &#38; Label Graphic Systems Inc</td>
			<td>1007910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 cell culture medium</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>To safely hold the animals ear during injectinos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host

Candida albicans is een belangrijke ziekteverwekker bij de mens. Het vermogen om te schakelen tussen morfologische vormen staat centraal in de pathogenese; deze morfologische veranderingen worden gereguleerd door een complex signaleringsnetwerk dat wordt aangestuurd als reactie op omgevingsstimuli. Deze regulerende componenten zijn zeer bestudeerd, maar bijna alle studies gebruiken een verscheidenheid aan in vitro stimuli om filamentatie te activeren. Om te bepalen hoe morfogenese wordt gereguleerd tijdens het pathogeneseproces, hebben we een in vivo microscopiesysteem ontwikkeld om beelden met een hoge ruimtelijke resolutie te verkrijgen van organismen die hyphale vorming ondergaan in de gastheer van het zoogdier. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van dit systeem om kleine verzamelingen van C. albicans mutante stammen te screenen, waardoor we de belangrijkste regulatoren van morfogenese kunnen identificeren zoals deze optreedt op de plaats van infectie. Er worden representatieve resultaten gepresenteerd die aantonen dat sommige regulatoren van morfogenese, zoals de transcriptionele regulator Efg1, consistente fenotypen in vitro en in vivo hebben, terwijl andere regulatoren, zoals adenylcyclase (Cyr1), in vivo significant verschillende fenotypen hebben in vergelijking met in vitro.

De hier gepresenteerde resultaten zijn gebaseerd op eerder gepubliceerde rapporten 9,10. Het doel van deze analyse is om kwantitatief het vermogen van mutante C. albicans-stammen om morfogenese te ondergaan tijdens actieve infecties kwantitatief te evalueren. De typische parameters die pseudohyphae van schimmeldraden onderscheiden, kunnen moeilijk te evalueren zijn in organismen die in drie dimensies groeien in een complexe in vivo omgeving. Dit geldt met name wanneer wordt gekeken naar de tweedimensionale doorsneden die worden gecreëerd door confocale beeldvorming. Daarom is deze screeningsanalyse gericht op het identificeren van organismen die groeien als filamenteus versus gist. Voor vervolgstudies met behulp van een meer diepgaande analyse, inclusief driedimensionale reconstructies, kan deze methode worden aangepast om gist, schimmeldraden en pseudohyphae te onderscheiden.
De expressie van een fluorescerend eiwit in een referentie- of mutante stam van C. albicans maakt een eenvoudige detectie van stammorfologie in vivo mogelijk (figuur 3 en figuur 4). Over het algemeen kan kwantitatieve lichtmicroscopieanalyse het beste worden uitgevoerd wanneer weinig tot geen van de pixels in het beeld verzadigd zijn. Voor dit protocol vereenvoudigt een verzadiging van het beeld echter vaak de analyse. Fluorescerende eiwitlokalisatie is niet uniform in de hele cel en is vaak hoger in de moedergist dan in filamenten. Gelukkig bepaalt voor het onderzoek naar morfogenese de ruimtelijke verdeling van het signaal, in plaats van de intensiteit ervan, de uitkomst. Daarom verbetert het verkrijgen van afbeeldingen waarin veel pixels verzadigd zijn het vermogen om morfogenese in deze test te kwantificeren.
Om het belang van het evalueren van morfogenese in vivo te illustreren, worden representatieve resultaten gepresenteerd voor de referentiestam (SN250) en twee mutanten: een zonder de transcriptiefactor Efg1 en de andere zonder adenylcyclase Cyr1. In vitro groeien geen van deze stammen als filamenten20,21. Wanneer de referentiestam in vitro wordt gekweekt in RPMI-medium aangevuld met 10% serum, vormt de referentiestam snel filamenten, terwijl de efg1ΔΔ- en cyr1ΔΔ-stammen dat niet doen (figuur 3 en figuur 4). Onder deze omstandigheden vertoont de efg1ΔΔ-mutant een enigszins gepolariseerde groei, waarbij de dochtercellen enigszins langwerpig zijn in vergelijking met de moedercellen. Dit benadrukt het belang van het gebruik van een duidelijke definitie van filamentatie. Een dergelijke definitie is standaard willekeurig, maar het is noodzakelijk voor een consistente evaluatie van het fenotype. Voor deze studies wordt een filamenteus groeipatroon gedefinieerd als een organisme met de langste dimensie van een dochtercel die meer dan twee keer zo groot is als die van de moedercel. Volgens deze definitie zijn de langwerpige efg1ΔΔ-cellen niet filamenteus.
In overeenstemming met zijn in vitro fenotype vertoont de efg1ΔΔ in vivo een significant filamentatiedefect: ongeveer 9% van de efg1ΔΔ-cellen groeide in vivo als filamenten (figuur 3). Daarentegen groeide 53% van de cyr1ΔΔ mutante cellen in vivo als filamenten (figuur 4). Hoewel het aantal cyr1ΔΔ-mutantcellen dat in vivo filamentatie onderging significant lager was dan de referentiestam, betekent het vermogen van de cyr1ΔΔ-mutant om filamenten in vivo te vormen een substantiële verandering ten opzichte van het volledige gebrek aan morfogenese in vitro. Visueel bleken de filamenten gevormd door de cyr1ΔΔ mutant korter te zijn dan de referentiestam. Om dit kwantitatief te evalueren, werd de lengte van het curvepad van de filamenteuze cellen gemeten met behulp van een tweedimensionale projectie van de in vivo beelden (figuur 4E). De mediane lengte van cyr1ΔΔ filamenten was 29% korter dan filamenten van de referentiestam.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg"> Figuur 1: Anesthesie en inenting. (A) Inductie van anesthesie met behulp van een inductiekamer. (B) Anesthesie wordt gehandhaafd met behulp van een neuskegel, waardoor de muis indien nodig kan worden verplaatst. (C) Ontharingscrème wordt aangebracht met behulp van een applicator met katoenpunt. Oogbevochtigingsgel is aangebracht om de ogen te beschermen tijdens anesthesie. (D) Effectieve ontharing van het rechteroor. Vergelijk met het onbehandelde linkeroor. (E) Intradermale injectie van C. albicans in het muizenoor. Het oor wordt op zijn plaats gehouden met behulp van de punt van een conische buis omwikkeld met dubbelzijdige huidtape (modetape). (F) Close-up van intradermale injectie. Een bleke bubbel wordt gevormd in de huid, wat een teken is van een succesvolle intradermale plaatsing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg"> Figuur 2: Voorbereiding voor beeldvorming. (A) Microscoopstadium voorbereid voor beeldvorming. De anesthesieneuskegel is op zijn plaats vastgezet. Een coverslip wordt op het podium geplakt dat de lensopening bedekt. Extra stukjes tape zijn beschikbaar. Het verwarmde stadium wordt voorverwarmd tot 37 °C (niet aangegeven). (B) Plaatsing van de verdoofde muis in de anesthesieneuskegel. (C) De muis wordt iets gedraaid zodat de kant van het oor die is ingeënt naar de onderste coverlip / objectieflens is gericht. Het oor wordt vervolgens afgeplat tegen de onderste coverslip en op zijn plaats vastgezet door een tweede coverslip bovenop het oor te plaatsen. (D) De bovenste coverslip wordt op het podium geplakt om het oor op zijn plaats te houden ten opzichte van het microscoopstadium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg"> Figuur 3: In vitro en in vivo morfologie van de efg1ΔΔ mutantenstam. (A) Widefield-afbeelding van WT- en efg1ΔΔ-mutante stammen na in vitro inductie van filamentatie door groeiende cellen in RPMI + 10% serum bij 37 °C gedurende 4 uur. Schaalbalken vertegenwoordigen 10 μm. Het beeldcontrast werd aangepast met behulp van fotobewerkingssoftware om het bekijken te vergemakkelijken. (B) Percentage filamentatie in vitro waargenomen in de WT- en efg1ΔΔ-mutantenstammen. Und = niet detecteerbaar (er werden geen filamenten gedetecteerd). Staafhoogte vertegenwoordigt het mediane percentage filamenteuze cellen uit drie onafhankelijke experimenten waarin ten minste 100 cellen werden gekwantificeerd. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan (resultaten vergeleken door de t-toets van de student, p < 0,001). C) Confocale micrografie van WT (groen) en de efg1ΔΔ mutant (rood) die in vivo 24 uur na inenting groeit. Pijlen geven voorbeelden aan van efg1ΔΔ-mutante cellen die voldoen aan onze definitie van "filamenteus". Schaalstaaf vertegenwoordigt 50 μm. (D) Percentage filamentatie in vivo waargenomen in de WT- en efg1ΔΔ-mutante stammen. Staafhoogte vertegenwoordigt het mediane percentage filamenteuze cellen uit twee onafhankelijke experimenten. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan (resultaten vergeleken door de t-toets van de student, p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg"> Figuur 4: In vitro en in vivo morfologie van de cyr1ΔΔ mutantenstam. (A) Widefield-afbeelding van de cyr1ΔΔ mutante stam na in vitro inductie van filamentatie door groeiende cellen in RPMI + 10% serum bij 37 °C gedurende 4 uur. De schaalbalk staat voor 10 μm. Het beeldcontrast werd aangepast met behulp van fotobewerkingssoftware om het bekijken te vergemakkelijken. (B) Percentage filamentatie in vitro waargenomen in de mutantenstammen WT en cyr1ΔΔ. Und = niet detecteerbaar (er werden geen filamenten gedetecteerd). Staafhoogte vertegenwoordigt het mediane percentage filamenteuze cellen uit drie onafhankelijke experimenten waarin ten minste 100 cellen werden gekwantificeerd. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan (resultaten vergeleken door de t-toets van de student, p < 0,001). (C) Confocale micrografie van WT (groen) en de cyr1ΔΔ mutant (rood) die in vivo 24 uur na inenting groeit. De schaalbalk vertegenwoordigt 50 μm. (D) Percentage filamentatie in vivo waargenomen in de mutantenstammen WT en cyr1ΔΔ. Staafhoogte vertegenwoordigt het mediane percentage filamenteuze cellen uit twee onafhankelijke experimenten. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan (resultaten vergeleken door de t-toets van de student, p < 0,001). (E) Verdeling van de filamentlengte in vivo, zoals gemeten aan de hand van de lengte van het curvepad in een tweedimensionale projectie van de z-stack. Elke stip vertegenwoordigt de lengte van één filament. Cellen die als gist groeiden, werden niet in deze analyse opgenomen. De balk geeft de mediane filamentlengte aan. De verdeling van lengtes is significant verschillend wanneer geanalyseerd met behulp van een Mann-Whitney U-test (p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Dit manuscript beschrijft een methode voor het screenen van middelgrote Candida albicans mutante bibliotheken op morfogenese fenotypes tijdens actieve infectie in een zoogdier gastheer met behulp van niet-invasieve confocale microscopie.

Gebruik van in vivo beeldvorming om te screenen op morfogenese fenotypes in Candida albicans mutante stammen tijdens actieve infectie bij een zoogdiergastheer

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

Candida albicans morfogenese wordt veroorzaakt door een groot aantal omgevingssignalen. Door morfogenese in vivo te bestuderen, bepalen we hoe het organisme al deze omgevingssignalen integreert en erop reageert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om morfogenese te bestuderen in afwezigheid van bias of artefacten die kunnen worden geïntroduceerd met behulp van in vitro modelsystemen.Zeer weinig mensen hebben ervaring met intradermale injecties. Ik raad ten zeerste aan dat iemand die nieuw is bij deze techniek contact opneemt met hun dierenarts voor dierenhulp voor hulp bij het leren ervan. De procedure wordt gedemonstreerd door Rohan Wakade, een postdoc uit onze laboratoriumgroep.Begin met het voorbereiden van het dier op inenting door chlorofylvrije chow gedurende ten minste zeven dagen vóór de inenting te voeren. Neem een dag voorafgaand aan de injectie een schar Canadese albicanscellen uit één kolonie met behulp van een tandenstoker. Ent 25 milliliter YPD en herhaal dit proces meerdere keren om cellen uit verschillende kolonies te verkrijgen.Incubeer de cultuur 's nachts bij 30 graden Celsius in een orbitale shaker incubator bij 175 RPM. Centrifugeer één milliliter cultuur gedurende twee minuten bij 500 x g en was de gist vervolgens drie keer met één milliliter steriel DPBS. Resuspendeer de pellet in één milliliter steriel DPBS en verdun de cultuur op 1 tot 100.Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en pas dienovereenkomstig de celdichtheid aan. Maak vervolgens het entmateriaal voor injectie door gelijke volumes van de gerefereerde en experimentele stam te mengen. Breng met behulp van een wattenstaafje met een vrij verkrijgbare ontharingscrème royaal aan op het binnen- en buitenoppervlak van beide oren van een verdoofd dier.Veeg na twee tot drie minuten het oor voorzichtig af met een droog gaasje gevolgd door gaasjes verzadigd met steriel water om ontharingsresten grondig te verwijderen. Nadat u het oppervlak van de oren met 70% ethanol hebt gesteriliseerd, mengt u het entmateriaal goed door de injectieflacon meerdere keren om te keren of te vortexen. Zuig 20 tot 30 microliter entmateriaal in een insulinespuit.Houd de naald rechtop en tik zachtjes op de spuit om ervoor te zorgen dat er lucht in de loop aan de bovenkant zit. Werp voorzichtig lucht en overtollig entmateriaal terug in de entafleider of een afvalbuis, zodat de zuiger zich op de 10 microliter-markering bevindt. Breng over de toonbank dubbelzijdige huidtape aan op een kleine conische of ronde bodem plastic buis en drapeer het oor over de tape, vermijd het ontwrichten van de anesthesieneuskegel.Houd de naald van de spuit bijna evenwijdig aan de huid en vermijd grote aderen, steek de punt van de naald in de buitenste laag van de huid totdat de schuine kant net bedekt is en injecteer het entmateriaal langzaam intradermaal. Een goede intradermale injectie zal een kleine bubbel in de huid verhogen. Houd de naald 15 tot 20 seconden op zijn plaats voordat u deze uit het oor verwijdert om lekkage te minimaliseren.Volg institutionele protocollen en markeer de kooi met biohazard-labels die aangeven dat dieren in de kooi zijn geïnfecteerd met Candida albicans. Met behulp van dezelfde gewassen culturen die werden gebruikt om het entmateriaal te bereiden, creëert u een verdunning van 1 tot 50 cellen in RPMI 1640, aangevuld met 10% warmte en geactiveerd foetaal runderserum en incubeert u bij 37 graden Celsius met tuimelen gedurende vier uur. Onderzoek het monster met een microscoop.Tel ten minste 100 cellen en noteer het aantal gist- en filamenteuze cellen voor elke stam. Draai het lange werkafstandsobjectief op zijn plaats en plaats een druppel onderdompelingsvloeistof op de lens. Laat de lens zakken om mogelijke schade te voorkomen bij het plaatsen van de afdeksel.Plaats nummer 1.5 cover slip over de podiumopening en plak deze op zijn plaats. Verhoog het objectief zodat de dompelvloeistof in contact komt met zowel de objectieflens als de cover slip. Beveilig een anesthesieneuskegel op het microscoopstadium op zo'n manier dat deze de neus van het dier volledig bedekt wanneer deze in positie is voor beeldvorming.Plaats de neus van een verdoofde muis in de neuskegel. Plaats een druppel steriel water op de afdekslip boven de objectieflens. Pas de anesthesieneuskegel aan en plaats de muis zo dat het oor van de muis zich boven de waterdruppel bevindt.Neem nog een hoeslip en plaats de rand van de cover slip parallel aan het lichaam van de muis, waarbij de rand de muis raakt waar het oor het hoofd ontmoet. Laat met behulp van een scharnierbeweging de vrije rand van de afdekslip naar de microscoopfase zakken. Als de cover slip tegen de microscoopfase komt, zal het oor worden afgevlakt.Plak de bovenste hoes goed vast om net genoeg druk vast te houden om het oor plat te houden en te voorkomen dat het haar of de snorharen van de muis in de tape worden gevangen. Tenzij een microscoop met een omgevingskamer wordt gebruikt, bedek het lichaam van de muis losjes met een steriel gordijn om een normale thermische omgeving te behouden. Met behulp van wit licht, widefield imaging, pas het focusvlak aan in het oorweefsel en focus op de rode bloedcellen die in de bloedvaten bewegen.Om een signaal-ruisverhouding te verkrijgen die sterk genoeg is, zodat de morfologie voor alle cellen in het gezichtsveld kan worden bepaald, past u het laservermogen of de beeldsnelheid aan. Om weefselschade te voorkomen, gebruikt u het laagst mogelijke laservermogen. Kies een gezichtsveld met duidelijke filamentvorming in de gerefereerde stam en waar de meeste organismen voldoende verspreid zijn om hun morfologie te bepalen.Stel de bovenste en onderste scherpstelvlakken in voor een Z-stack. Het is niet nodig om de volledige diepte van het geïnfecteerde gebied te bedekken, maar houd er rekening mee dat organismen aan de boven- of onderkant van het afgebeelde volume meestal worden uitgesloten van de analyse. Verkrijg Z-stack-afbeeldingen, pseudokleur elk kanaal om elke stam te onderscheiden en overlay de kanalen.Sla de afbeeldingen op. Gebruik beeldbewerkingssoftware om een maximale projectie van de Z-stack uit te voeren in een tweedimensionaal beeld. Tel elk organisme dat in de maximale projectiebeelden wordt gezien per stamtype en morfologie.De gerefereerde stam vormt in vitro snel filamenten. Terwijl de EFG1 Null er niet in slaagde de filamenten te vormen. De EFG1 Null vertoont ook in vivo een significant filamentatiedefect.Ongeveer 9% van de EFG1 Null-cellen groeide in vivo als filamenten. Evenzo vertoonde de CYR1 Null-mutante stam een filamentatiedefect in vitro in vergelijking met de verwezen stam. Daarentegen groeide 53% van de CYR1 Null-mutantcellen in vivo als filamenten.De filamenten gevormd door de CYR1 Null-mutant waren korter dan de referentiestam. Het is van cruciaal belang om de naald parallel aan de huid te houden tijdens de inenting. Het doel is om het entmateriaal net onder de buitenste laag van de huid te plaatsen.Deze techniek kan ook worden gebruikt met muizenstammen die een fluorescerend eiwit tot expressie brengen in gastheercellen van belang, waardoor we gastheerpathogeeninteracties in vivo kunnen bestuderen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo imaging van transgene Leishmania parasieten in een Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Niet-invasieve beeldvorming van Leukocyte Homing en migratie In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Het gebruik van kunstmatige Sputum Middelgrote tot antibiotica werkzaamheid te testen tegen<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In Voorwaarden relevanter voor de Cystic Fibrosis Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Bestuderen van microbiële gemeenschappen<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen<em&gt; Candida albicans</em&gt; En<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In het Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Een eenvoudige en efficiënte aanpak Mutant Vaccinia Virus vectoren Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Onderzoek van Host Phenotypes in<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Na een behandeling met antibiotica

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Imaging-cel interactie in tracheale Mucosa tijdens Influenza virusinfectie met behulp van twee-foton Intravital microscopie

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Verduidelijken en beeldvorming Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Een Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in het maag-darmkanaal

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Terugkerende Escherichia coli urineweginfectie veroorzaakt door Gardnerella vaginalis blaasblootstelling bij muizen

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...