Name: use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la subvention 1R01AI33409 des NIH et le département de pédiatrie du Carver College of Medicine de l’Université de l’Iowa.

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Ce modèle utilise la microscopie confocale pour obtenir des images des organismes de C. albicans lorsqu’ils se développent dans le tissu d’un hôte mammifère, ce qui nous permet d’évaluer les phénotypes de morphogenèse au cours d’une infection active. Le processus de morphogenèse est au cœur de la pathogenèse de C. albicans et a été largement étudié à l’aide d’une variété d’essais in vitro 2,3,4. Cependant, aucun essai in vitro ne peut modéliser complètement l’environnement biochimique et structurel complexe de l’hôte.
Le protocole décrit ici est axé sur l’utilisation de ce système d’imagerie in vivo pour cribler une série / bibliothèque de mutants de C. albicans afin d’identifier les gènes impliqués dans la morphogenèse au cours de l’infection. L’utilisation de souches de C. albicans exprimant différentes protéines fluorescentes permet de quantifier la morphogenèse in vivo des souches mutantes de C. albicans par rapport à celle d’une souche de référence. La comparaison de la morphogenèse chez le mutant à la souche de référence dans la même zone d’infection garantit que les organismes sont exposés à des environnements identiques. Cela permet de mesurer quantitativement le pourcentage de cellules subissant une filamentation, ainsi que l’étendue de la filamentation. La normalisation des mesures de la ou des souches mutantes à celles de la souche de référence permet de mieux comparer les performances d’un mutant à un autre.
Les résultats représentatifs présentés ici démontrent le potentiel d’un écart important entre les phénotypes in vitro et in vivo . La souche mutante de C. albicans efg1ΔΔ est souvent utilisée comme témoin négatif pour les essais de morphogenèse car elle ne parvient pas à filamenter dans presque toutes les conditions in vitro 20. Bien que les résultats in vivo aient été très similaires aux résultats in vitro , même cette souche gravement entravée a parfois formé des filaments dans l’environnement du tissu hôte (Figure 3). Cela souligne la force de l’environnement hôte dans le déclenchement de la morphogenèse.
En revanche, la souche mutante cyr1ΔΔ présente une discordance substantielle entre la croissance in vitro et in vivo; Bien qu’aucune des cellules mutantes ne subisse de filamentation in vitro, environ la moitié des cellules se développent sous forme de filaments in vivo (Figure 4)10,21. Fait intéressant, ces filaments étaient significativement plus courts que ceux formés par la souche de référence, ce qui suggère que CYR1 contribue soit au taux de croissance du filament, soit à la capacité de maintenir un phénotype filamenteux. Pour faciliter l’analyse de la longueur du filament, la longueur du trajet de courbe des filaments a été mesurée à l’aide d’une projection bidimensionnelle des images. Dans les projections bidimensionnelles de filaments se développant en trois dimensions, tout filament croissant sur un axe qui n’est pas parallèle au plan xy se projettera comme plus court que sa longueur réelle. Comme ce raccourcissement se produit également pour la déformation de référence, l’évaluation de la distribution des longueurs de filament dans une projection bidimensionnelle permet toujours une comparaison quantitative entre les souches de référence et mutantes. L’analyse de la longueur du filament en deux dimensions plutôt qu’en trois dimensions nécessite une analyse d’image moins intensive; Ainsi, il peut être effectué relativement rapidement sur un ordinateur de bureau typique. L’utilisation de cette analyse plus simple permet d’inclure la distribution de la longueur du filament dans le cadre d’un protocole de dépistage, ce qui donne une compréhension plus nuancée de la capacité de chaque mutant à subir une morphogenèse sans causer de retards substantiels dans le débit.
Les études représentatives présentées ici ont été réalisées sur des souris DBA2/N, qui présentent un défaut dans leur système du complément entraînant un échec du recrutement des neutrophiles sur le site de l’infection à C. albicans 22. Le but de ces études était d’étudier les mécanismes de régulation de la filamentation de C. albicans dans le tissu hôte. Par conséquent, des souris DBA2/N ont été utilisées pour éviter de confondre les résultats en raison de la sensibilité ou de la résistance d’une souche individuelle aux neutrophiles. Comme la réponse anti-C. albicans des neutrophiles peut avoir un impact sur la filamentation23, le recrutement des neutrophiles sur le site d’infection pourrait avoir un impact sur les résultats d’un test de morphogenèse. Si une souche est capable de filamenter in vivo mais est fortement inhibée par la filamentation lorsque des neutrophiles sont présents, la filamentation serait détectée chez les souris DBA2/N, mais il serait peu probable qu’elle soit observée lors de l’utilisation de souris ayant une chimiotaxie neutrophile intacte. Ainsi, la souche de la souris utilisée comme hôte est un facteur important lors de l’utilisation de ce protocole.
Il est peu probable que l’observation selon laquelle la souche mutante efg1ΔΔ ne parvient pas à filamenter in vivo soit liée aux réponses des neutrophiles de l’hôte, car cette souche ne parvient pas non plus à filamenter in vitro. La filamentation observée in vivo avec la souche cyr1ΔΔ est discordante avec son échec de filamentation in vitro. Les données du modèle de l’infection à C. albicans chez le poisson zèbre indiquent que les neutrophiles réagissant sont importants dans la prévention de la morphogenèse24. Par conséquent, il est peu probable que l’utilisation de souris DBA2/N, qui n’ont pas de réponses neutrophiles, explique l’augmentation de la filamentation du cyr1ΔΔ in vivo par rapport à in vitro. Néanmoins, l’environnement in vivo a clairement un impact sur la morphogenèse de la souche cyr1ΔΔ ; par conséquent, une étude plus approfondie de cette souche peut fournir des informations importantes sur la régulation de la morphogenèse de C. albicans au cours d’infections actives. Le protocole décrit ici est conçu comme un test de dépistage pour identifier des souches telles que la souche cyr1ΔΔ à utiliser dans de futures études.
L’utilisation d’un système d’anesthésie gazeuse à faible débit est très utile pour ce protocole (Figure 1A,B). Au cours du développement initial de ce protocole, les souris ont été anesthésiées à l’aide d’un cocktail anesthésique injectable de kétamine mélangé à de la xylazine. Bien qu’il ait été possible d’effectuer une imagerie limitée avec cette méthode anesthésique, la durée de l’anesthésie était imprévisible, nécessitant la fin rapide des séances d’imagerie pour éviter que la souris ne se remette de l’anesthésie pendant l’imagerie. Les systèmes anesthésiques inhalés traditionnels sont encombrants et nécessitent des débits élevés de gaz anesthésiques, ce qui nécessite souvent leur utilisation dans une hotte. Ainsi, les systèmes anesthésiques inhalés traditionnels seraient très difficiles à utiliser avec les contraintes d’espace d’un microscope confocal sans exposer par inadvertance les chercheurs aux agents anesthésiques. L’utilisation d’un système anesthésique inhalé à faible débit permet une anesthésie constante de l’animal tout en maintenant un environnement sécuritaire pour l’investigateur. Le nez à faible débit permet un positionnement facile de l’animal pour l’inoculation et la microscopie. Le tube d’administration de petit calibre et de faible volume permet l’utilisation de tubes relativement longs, ce qui permet de placer l’appareil d’anesthésie à une distance suffisante pour ne pas interférer avec la microscopie.
La chlorophylle présente dans le chow typique de la souris conduit à une autofluorescence tissulaire significative25. Cela crée un bruit important dans les images, ce qui rend difficile l’obtention d’images de haute qualité et de haute résolution spatiale. Lorsque les animaux ont été nourris avec du chow exempt de chlorophylle pendant 7 jours avant l’imagerie, le bruit de fond de l’autofluorescence a été considérablement diminué dans les tissus, mais la chlorophylle déposée dans les poils a continué à être problématique. L’épilation des pennes à l’aide d’une crème dépilatoire chimique en vente libre est efficace pour minimiser l’autofluorescence des cheveux (Figure 1C,D). Ainsi, la combinaison de chow sans chlorophylle et d’épilation adéquate a considérablement réduit l’autofluorescence et amélioré considérablement la qualité de l’image. Parce que les poils sont retirés de l’oreille avant l’imagerie, la couleur des poils de l’animal n’a pas d’impact sur ce système. Ce protocole a été utilisé avec succès pour étudier les infections à C. albicans chez les souris BALB/c (blanche), C57BL/6 (noire) et DBA2/N (brune). Le protocole peut également être utilisé avec des souris knockout C57BL/6 déficientes en divers gènes de l’hôte; Cela permettra d’étudier à l’avenir l’impact du système immunitaire de l’hôte mammifère sur la filamentation. Une caractéristique de ce modèle non abordée dans ce protocole est que, parce que ce système d’imagerie est non invasif, le même animal peut être imagé à plusieurs reprises sur plusieurs jours, ce qui permet de suivre la progression de l’infection individuelle au fil du temps. Cette caractéristique jouera probablement un rôle clé dans les futures études sur l’interaction hôte-pathogène.
En résumé, ce protocole permet d’obtenir des images à haute résolution spatiale de C. albicans poussant dans le tissu d’un mammifère hôte vivant, ce qui permet une évaluation précise de la morphogenèse des souches mutantes 8,9,10. Les résultats présentés ici démontrent comment ce protocole peut être utilisé pour cribler une bibliothèque de mutants de C. albicans. Parmi les mutants de C. albicans testés à ce jour, une grande partie des mutants présentant des défauts connus de morphogenèse in vitro subissent facilement une filamentation in vivo 9,10. Cela souligne l’importance d’inclure un système in vivo comme celui-ci dans des expériences conçues pour élucider les mécanismes de la pathogenèse de C. albicans.

Candida albicans est un pathogène fongique humain commun, causant des maladies cutanéo-muqueuses, des maladies disséminées et des infections tissulaires localisées1. Une caractéristique clé de la physiologie de C. albicans est sa croissance polymorphe complexe, qui est liée à son rôle à la fois de commensal et d’agent pathogène 2,3,4. Dans des conditions nutritives riches in vitro à 30 °C, il se développe généralement comme une levure bourgeonnante ovoïde. Une variété de déclencheurs environnementaux, y compris la privation de nutriments, les changements de pH, la croissance à 37 ° C, l’exposition au sérum et la croissance lorsqu’il est incorporé dans l’agar-agar, entraînent la transition vers un modèle de croissance polarisé, entraînant la formation de vrais hyphes et / ou de pseudohyphes5. L’initiation de la croissance polarisée et la croissance résultante des organismes filamenteux est appelée morphogenèse.
En raison de l’importance de la morphogenèse dans la virulence de l’organisme, la régulation de la formation des hyphes a été largement étudiée 6,7. Il existe un réseau complexe de voies de signalisation et de régulation transcriptionnelle qui déclenche la morphogenèse. Malgré la relation entre la morphogenèse de C. albicans et la pathogenèse, la plupart des études portant sur la morphogenèse ont utilisé des stimuli in vitro pour déclencher la formation d’hyphes. Il devient de plus en plus clair que les différents modèles in vitro de filamentation ne sont pas identiques en termes de voies de régulation individuelles stimulées. De plus, aucune condition de croissance in vitro ne correspond étroitement à l’environnement complexe de l’hôte. Compte tenu de l’importance de C. albicans en tant qu’agent pathogène humain, l’objectif de ce protocole est d’étudier sa morphogenèse au cours d’une infection active chez un hôte mammifère en utilisant un système à débit modéré, permettant ainsi à un chercheur de cribler les bibliothèques de mutants de C. albicans. 
Pour faciliter ces investigations, un système d’imagerie in vivo a été développé qui nous permet d’obtenir des images à haute résolution spatiale des cellules de C. albicans lors de l’infection du pavillon d’une souris anesthésiée à l’aide d’un microscope confocale inversé 8,9,10. Parce que la peau du pavillon est assez mince, ces images peuvent être obtenues sans avoir besoin de dissection tissulaire. Ainsi, les données quantitatives de phénotype peuvent être mesurées sur le site des infections actives dans le tissu hôte. Le protocole décrit ici implique la transformation d’une souche de référence et d’une ou plusieurs souches mutantes avec différentes cassettes d’expression protéique fluorescente11,12. Les souches exprimant des protéines fluorescentes sont ensuite mélangées et co-injectées par voie intradermique. Une fois l’infection établie, l’imagerie confocale est utilisée pour quantifier à la fois la fréquence de filamentation et la longueur des filaments formés. Les données obtenues à partir des souches mutantes sont normalisées à celles obtenues à partir de la souche de référence, qui est présente dans la même région tissulaire, assurant ainsi un contrôle interne. Ce système nous a permis de cribler avec succès plusieurs séries de souches mutantes de C. albicans, dont beaucoup présentent des défauts de morphogenèse in vitro 9,10. Beaucoup de ces souches filamentent facilement in vivo, ce qui souligne l’importance des modèles in vivo pour l’étude de la morphogenèse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 coverslips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>20811</td>
			<td>large enough to cover the universal stage opening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 mL Insulin syringes</td>
			<td>EXELint</td>
			<td>26018</td>
			<td>Can use syringes that are 5/16&#34;&#8211;1/2&#34; long and 29&#8211;32 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.7% formaldehyde in dPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBJ5734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol/30% water</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>A05061001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.albicans reference strain and experimental strains</td>
			<td>SN250</td>
			<td>FGSC Online Catalog</td>
			<td>The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyl free mouse chow</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2920x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7050</td>
			<td>Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicator</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>76200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBA2/N (6-12 week old mice)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.&#160; The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.&#160; This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.&#160; It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.&#160; 
			Examples:&#160; 
			https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-40 
			https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174320&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-26 
			https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Must be sterile; open a new container for every experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze pad</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>P157112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel eye lurbicant</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ or FIJI analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ (FIJI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>J119005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8 (SP8)</td>
			<td>The objective lens&#160; (Leica 11506375) used here&#160; is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. 
			The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free&#160; spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. 
			The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific International</td>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair hair remover lotion</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Over the counter depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AB-101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent protein expression transformation constructs&#160; generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensitive laboratory tape</td>
			<td>Tape &#38; Label Graphic Systems Inc</td>
			<td>1007910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 cell culture medium</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>To safely hold the animals ear during injectinos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host

Candida albicans est un agent pathogène humain important. Sa capacité à basculer entre les formes morphologiques est au cœur de sa pathogenèse; Ces changements morphologiques sont régulés par un réseau de signalisation complexe contrôlé en réponse à des stimuli environnementaux. Ces composants régulateurs ont été très étudiés, mais presque toutes les études utilisent une variété de stimuli in vitro pour déclencher la filamentation. Pour déterminer comment la morphogenèse est régulée au cours du processus de pathogenèse, nous avons développé un système de microscopie in vivo pour obtenir des images à haute résolution spatiale d’organismes subissant la formation d’hyphes chez l’hôte mammifère. Le protocole présenté ici décrit l’utilisation de ce système pour dépister de petites collections de souches mutantes de C. albicans, ce qui nous permet d’identifier les principaux régulateurs de la morphogenèse telle qu’elle se produit sur le site de l’infection. Des résultats représentatifs sont présentés, démontrant que certains régulateurs de la morphogenèse, tels que le régulateur transcriptionnel Efg1, ont des phénotypes cohérents in vitro et in vivo, tandis que d’autres régulateurs, tels que l’adénylcyclase (Cyr1), ont des phénotypes significativement différents in vivo par rapport à in vitro.

Les résultats présentés ici sont basés sur des rapports publiés antérieurement 9,10. Le but de cette analyse est d’évaluer quantitativement la capacité des souches mutantes de C. albicans à subir une morphogenèse au cours d’infections actives. Les paramètres typiques qui distinguent les pseudohyphes des hyphes peuvent être difficiles à évaluer chez les organismes poussant en trois dimensions dans un environnement complexe in vivo. Cela est particulièrement vrai lorsque l’on examine les sections transversales bidimensionnelles créées par l’imagerie confocale. Par conséquent, cette analyse préalable est axée sur l’identification des organismes qui se développent sous forme de filamenteux par rapport à la levure. Pour les études de suivi utilisant une analyse plus approfondie, y compris les reconstructions tridimensionnelles, cette méthode pourrait être adaptée pour discriminer les levures, les hyphes et les pseudohyphes.
L’expression d’une protéine fluorescente dans une souche de référence ou mutante de C. albicans permet une détection directe de la morphologie de la souche in vivo (Figure 3 et Figure 4). En général, l’analyse quantitative par microscopie optique est mieux effectuée lorsque peu ou pas de pixels de l’image sont saturés. Pour ce protocole, cependant, une saturation de l’image simplifie souvent l’analyse. La localisation des protéines fluorescentes n’est pas uniforme dans toute la cellule et est souvent plus élevée dans la levure mère que dans les filaments. Heureusement, pour l’étude de la morphogenèse, la distribution spatiale du signal, plutôt que son intensité, définit le résultat. Par conséquent, l’obtention d’images dans lesquelles de nombreux pixels sont saturés améliore la capacité de quantifier la morphogenèse dans ce test.
Pour illustrer l’importance de l’évaluation de la morphogenèse in vivo, des résultats représentatifs sont présentés pour la souche de référence (SN250) et deux mutants : l’un dépourvu du facteur de transcription Efg1 et l’autre dépourvus d’adénylyl cyclase Cyr1. In vitro, aucune de ces souches ne se développe sous forme de filaments20,21. Lorsqu’elle est cultivée in vitro en milieu RPMI complété par 10% de sérum, la souche de référence forme rapidement des filaments, contrairement aux souches efg1ΔΔ et cyr1ΔΔ (Figure 3 et Figure 4). Dans ces conditions, le mutant efg1ΔΔ présente une croissance quelque peu polarisée, les cellules filles étant légèrement allongées par rapport aux cellules mères. Cela souligne l’importance d’utiliser une définition claire de la filamentation. Une telle définition est par défaut arbitraire, mais elle est nécessaire pour une évaluation cohérente du phénotype. Pour ces études, un modèle filamenteux de croissance est défini comme un organisme avec la plus longue dimension d’une cellule fille plus de deux fois celle de la cellule mère. En utilisant cette définition, les cellules EFG1ΔΔ allongées ne sont pas filamenteuses.
Conformément à son phénotype in vitro, l’efg1 ΔΔ présente un défaut de filamentation important in vivo : environ 9 % des cellules efg1ΔΔ se sont développées sous forme de filaments in vivo (Figure 3). En revanche, 53% des cellules mutantes cyr1ΔΔ se sont développées sous forme de filaments in vivo (Figure 4). Bien que le nombre de cellules mutantes cyr1 ΔΔ subissant une filamentation in vivo soit significativement inférieur à la souche de référence, la capacité du mutant cyr1ΔΔ à former des filaments in vivo représente un changement substantiel par rapport à son absence totale de morphogenèse in vitro. Visuellement, les filaments formés par le mutant cyr1ΔΔ semblaient plus courts que la souche de référence. Pour évaluer cela quantitativement, la longueur du trajet de la courbe des cellules filamenteuses a été mesurée à l’aide d’une projection bidimensionnelle des images in vivo (Figure 4E). La longueur médiane des filaments cyr1ΔΔ était 29 % plus courte que celle des filaments de la souche de référence.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg"> Figure 1 : Anesthésie et inoculation. (A) Induction de l’anesthésie à l’aide d’une chambre d’induction. (B) L’anesthésie est maintenue à l’aide d’un cône nasal, ce qui permet à la souris d’être repositionnée au besoin. (C) La crème dépilatoire est appliquée à l’aide d’un applicateur à embout de coton. Un gel lubrifiant pour les yeux a été appliqué pour protéger les yeux pendant l’anesthésie. (D) Épilation efficace de l’oreille droite. Comparer à l’oreille gauche non traitée. (E) Injection intradermique de C. albicans dans l’oreille de la souris. L’oreille est maintenue en place à l’aide de l’extrémité d’un tube conique enveloppé de ruban adhésif double face (ruban de mode). (F) Gros plan de l’injection intradermique. Une bulle pâle se forme dans la peau, signe d’un placement intradermique réussi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg"> Figure 2 : Préparation pour l’imagerie. (A) Étage de microscope préparé pour l’imagerie. Le cône nasal d’anesthésie est fixé en place. Un capuchon est collé sur la scène recouvrant l’ouverture de l’objectif. D’autres morceaux de ruban adhésif sont disponibles. L’étage chauffé est préchauffé à 37 °C (non représenté). (B) Mise en place de la souris anesthésiée dans le cône nasal d’anesthésie. (C) La souris est légèrement tournée de sorte que le côté de l’oreille inoculée soit orienté vers la lentille inférieure du couvercle. L’oreille est ensuite aplatie contre le couvercle inférieur et fixée en place en plaçant une deuxième lamelle de couverture sur le dessus de l’oreille. (D) La lamelle supérieure est collée à la scène pour maintenir l’oreille en place par rapport à l’étage du microscope. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg"> Figure 3 : Morphologie in vitro et in vivo de la souche mutante efg1ΔΔ. (A) Image grand champ de souches mutantes WT et efg1ΔΔ après induction in vitro de filamentation par des cellules en croissance dans RPMI + sérum à 10 % à 37 °C pendant 4 h. Les barres d’échelle représentent 10 μm. Le contraste de l’image a été ajusté à l’aide d’un logiciel de retouche photo pour faciliter la visualisation. (B) Pourcentage de filamentation in vitro observé chez les souches mutantes WT et efg1ΔΔ. Und = indétectable (aucun filament n’a été détecté). La hauteur de la barre représente le pourcentage médian de cellules filamenteuses provenant de trois expériences indépendantes dans lesquelles au moins 100 cellules ont été quantifiées. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type (résultats comparés par test t de Student, p < 0,001). (C) Micrographie confocale de WT (vert) et du mutant efg1ΔΔ (rouge) poussant in vivo 24 heures après l’inoculation. Les flèches indiquent des exemples de cellules mutantes efg1ΔΔ qui répondent à notre définition de « filamenteux ». La barre d’échelle représente 50 μm. (D) Pourcentage de filamentation in vivo observé dans les souches mutantes WT et efg1ΔΔ. La hauteur de la barre représente le pourcentage médian de cellules filamenteuses provenant de deux expériences indépendantes. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type (résultats comparés par le test t de Student, p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg"> Figure 4 : Morphologie in vitro et in vivo de la souche mutante cyr1 ΔΔ. (A) Image grand champ de la souche mutante cyr1ΔΔ après induction in vitro de filamentation par des cellules en croissance dans RPMI + sérum à 10 % à 37 °C pendant 4 h. La barre d’échelle représente 10 μm. Le contraste de l’image a été ajusté à l’aide d’un logiciel de retouche photo pour faciliter la visualisation. (B) Pourcentage de filamentation in vitro observé chez les souches mutantes WT et cyr1ΔΔ. Und = indétectable (aucun filament n’a été détecté). La hauteur de la barre représente le pourcentage médian de cellules filamenteuses provenant de trois expériences indépendantes dans lesquelles au moins 100 cellules ont été quantifiées. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type (résultats comparés par test t de Student, p < 0,001). (C) Micrographie confocale de WT (vert) et du mutant cyr1ΔΔ (rouge) poussant in vivo 24 heures après l’inoculation. La barre d’échelle représente 50 μm. (D) Pourcentage de filamentation in vivo observé dans les souches mutantes WT et cyr1ΔΔ. La hauteur de la barre représente le pourcentage médian de cellules filamenteuses provenant de deux expériences indépendantes. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type (résultats comparés par test t de Student, p < 0,001). (E) Distribution de la longueur du filament in vivo, mesurée par la longueur du trajet de la courbe dans une projection bidimensionnelle de la pile Z. Chaque point représente la longueur d’un filament. Les cellules se développant sous forme de levure n’ont pas été incluses dans cette analyse. La barre indique la longueur médiane du filament. La distribution des longueurs est significativement différente lorsqu’elle est analysée à l’aide d’un test U de Mann-Whitney (p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Ce manuscrit décrit une méthode de criblage de banques mutantes de Candida albicans de taille moyenne pour les phénotypes de morphogenèse au cours d’une infection active chez un hôte mammifère en utilisant la microscopie confocale non invasive.

Utilisation de l’imagerie in vivo pour dépister les phénotypes de morphogenèse chez les souches mutantes de Candida albicans au cours d’une infection active chez un mammifère hôte

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

La morphogenèse de Candida albicans est déclenchée par une myriade de signaux environnementaux. En étudiant la morphogenèse in vivo, nous déterminons comment l’organisme intègre et répond à tous ces signaux environnementaux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet d’étudier la morphogenèse en l’absence de biais ou d’artefacts qui pourraient être introduits à l’aide de systèmes modèles in vitro.Très peu de gens ont de l’expérience avec les injections intradermiques. Je recommande fortement à quelqu’un de nouveau dans cette technique de contacter son vétérinaire de ressources animales pour obtenir de l’aide pour l’apprendre. Rohan Wakade, un boursier postdoctoral de notre groupe de laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Commencez par préparer l’animal à l’inoculation en nourrissant le chow exempt de chlorophylle pendant au moins sept jours avant l’inoculation. Un jour avant l’injection, prenez une noisette de cellules de Canada albicans d’une colonie à l’aide d’un cure-dent. Inoculer 25 millilitres de YPD et répéter ce processus plusieurs fois pour obtenir des cellules de plusieurs colonies différentes.Incuber la culture pendant la nuit à 30 degrés Celsius dans un incubateur à agitateur orbital à 175 RPM. Centrifuger un millilitre de culture pendant deux minutes à 500 x g, puis laver la levure trois fois avec un millilitre de DPBS stérile. Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de DPBS stérile et diluez la culture entre 1 et 100.Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez en conséquence la densité cellulaire. Ensuite, créez l’inoculum pour injection en mélangeant des volumes égaux de la souche référencée et expérimentale. À l’aide d’un coton-tige, appliquez généreusement une crème dépilatoire en vente libre sur la surface interne et externe des deux oreilles d’un animal anesthésié.Après deux à trois minutes, essuyez doucement l’oreille avec une gaze sèche suivie de tampons de gaze saturés d’eau stérile pour éliminer complètement les résidus de crème dépilatoire. Après avoir stérilisé la surface des oreilles avec de l’éthanol à 70%, mélangez bien l’inoculum en inversant le flacon plusieurs fois ou en le tourbillonnant. Aspirez 20 à 30 microlitres d’inoculum dans une seringue à insuline.Tenez l’aiguille en position verticale et tapotez doucement la seringue pour vous assurer que l’air dans le canon est en haut. Éjectez soigneusement l’air et l’excès d’inoculum dans le tube d’inoculum ou un tube de déchets afin que le piston soit à la marque de 10 microlitres. Appliquer sur le ruban adhésif double face sur un petit tube en plastique conique ou à fond rond et draper l’oreille sur le ruban, en évitant de déloger le cône nasal d’anesthésie.En gardant l’aiguille de seringue presque parallèle à la peau et en évitant les grosses veines, insérez la pointe de l’aiguille dans la couche la plus externe de la peau jusqu’à ce que le biseau soit juste couvert et injectez lentement l’inoculum par voie intradermique. Une bonne injection intradermique fera monter une petite bulle dans la peau. Gardez l’aiguille en place pendant 15 à 20 secondes avant de la retirer de l’oreille pour minimiser les fuites.Conformément aux protocoles institutionnels, marquer la cage avec des étiquettes de risque biologique indiquant que les animaux dans la cage sont infectés par Candida albicans. En utilisant les mêmes cultures lavées que celles utilisées pour préparer l’inoculum, créer une dilution de 1 à 50 cellules dans RPMI 1640, complétée par 10% de chaleur et de sérum bovin fœtal activé et incuber à 37 degrés Celsius avec culbutage pendant quatre heures. Examinez l’échantillon à l’aide d’un microscope.Comptez au moins 100 cellules, en notant le nombre de cellules de levure et de filamenteuses pour chaque souche. Faites pivoter l’objectif à longue distance de travail et placez une gouttelette de liquide d’immersion sur l’objectif. Abaissez l’objectif pour éviter d’éventuels dommages lors de la pose du bordereau de couverture.Placez le couvercle numéro 1.5 sur l’ouverture de la scène et collez-le en place. Soulevez l’objectif de sorte que le fluide d’immersion soit en contact avec la lentille de l’objectif et le glissement du couvercle. Fixez un cône nasal d’anesthésie sur la scène du microscope de manière à couvrir complètement le nez de l’animal lorsqu’il est en position pour l’imagerie.Placez le nez d’une souris anesthésiée dans le cône nasal. Placez une goutte d’eau stérile sur le couvercle au-dessus de la lentille de l’objectif. Ajustez le cône nasal d’anesthésie et positionnez la souris de manière à ce que l’oreille de la souris soit au-dessus de la gouttelette d’eau.Prenez un autre bordereau de couverture et placez le bord du bordereau de couverture parallèle au corps de la souris, le bord touchant la souris à l’endroit où l’oreille rencontre la tête. À l’aide d’un mouvement de charnière, abaissez le bord libre du couvercle jusqu’à l’étage du microscope. Lorsque le couvercle vient contre l’étage du microscope, il aplatira l’oreille.Collez solidement le couvercle supérieur pour maintenir juste assez de pression pour maintenir l’oreille à plat et éviter d’attraper les poils ou les moustaches de la souris dans le ruban. À moins qu’un microscope avec une chambre environnementale ne soit utilisé, couvrez vaguement le corps de la souris avec un champ stérile pour maintenir un environnement thermique normal. À l’aide de la lumière blanche, de l’imagerie à grand champ, ajustez le plan de mise au point dans le tissu de l’oreille et concentrez-vous sur les globules rouges qui se déplacent dans les vaisseaux sanguins.Pour obtenir un rapport signal sur bruit suffisamment fort pour que la morphologie puisse être déterminée pour toutes les cellules du champ de vision, réglez la puissance laser ou la vitesse d’imagerie. Pour éviter les dommages tissulaires, utilisez la puissance laser la plus faible possible. Choisissez un champ de vision avec une formation de filament claire dans la souche référencée et où la plupart des organismes sont suffisamment dispersés pour que leur morphologie puisse être déterminée.Définissez les plans de mise au point supérieur et inférieur d’une pile Z. Il n’est pas nécessaire de couvrir toute la profondeur de la zone infectée, mais gardez à l’esprit que les organismes situés en haut ou en bas du volume imagé sont généralement exclus de l’analyse. Acquérir des images Z-stack, pseudo colorer chaque canal pour distinguer chaque souche et superposer les canaux.Enregistrez les images. Utilisez un logiciel d’imagerie pour effectuer une projection maximale de la pile Z dans une image bidimensionnelle. Compter chaque organisme vu dans les images de projection maximale par type de souche et morphologie.La souche référencée forme rapidement des filaments in vitro. Alors que l’EFG1 Null n’a pas réussi à former les filaments. L’EFG1 Null présente également un défaut de filamentation important in vivo.Environ 9% des cellules nulles EFG1 se sont développées sous forme de filaments in vivo. De même, la souche mutante CYR1 Null a montré un défaut de filamentation in vitro par rapport à la souche référencée. En revanche, 53% des cellules mutantes nulles CYR1 se sont développées sous forme de filaments in vivo.Les filaments formés par le mutant CYR1 Null étaient plus courts que la souche référencée. Il est essentiel de garder l’aiguille parallèle à la peau pendant l’inoculation. L’objectif est de placer l’inoculum juste sous la couche externe de la peau.Cette technique peut également être utilisée avec des souches de souris qui expriment une protéine fluorescente dans les cellules hôtes d’intérêt, ce qui nous permet d’étudier les interactions entre les pathogènes de l’hôte in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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