Name: use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH 1R01AI33409 והמחלקה לרפואת ילדים, מכללת קארבר לרפואה, אוניברסיטת איווה.

<ol>
	<li>Lopes, J. P., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+virulence+of+Candida+albicans.">Pathogenesis and virulence of Candida albicans.</a> Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+control+of+cell+morphology+in+vivo+reveals+distinct+roles+for+yeast+and+filamentous+forms+of+Candida+albicans+during+infection.">Engineered control of cell morphology in vivo reveals distinct roles for yeast and filamentous forms of Candida albicans during infection.</a> Eukaryotic Cell. 2 (5), 1053-1060 (2003).</li><li>Arita, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+associated+proteins+involved+in+filamentation+with+impact+on+the+virulence+of+Candida+albicans.">Cell wall associated proteins involved in filamentation with impact on the virulence of Candida albicans.</a> Microbiological Research. 258, 126996 (2022).</li><li>Rai, L. S., Wijlick, L. V., Bougnoux, M. E., Bachellier-Bassi, S., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+commensal+and+pathogenic+life-styles+of+an+opportunistic+fungus-Candida+albicans.">Regulators of commensal and pathogenic life-styles of an opportunistic fungus-Candida albicans.</a> Yeast. 38 (4), 243-250 (2021).</li><li>Sudbery, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Candida+albicans+hyphae.">Growth of Candida albicans hyphae.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).</li><li>Basso, V., d'Enfert, C., Znaidi, S., Bachellier-Bassi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+genes+to+networks:+The+regulatory+circuitry+controlling+candida+albicans+morphogenesis.">From genes to networks: The regulatory circuitry controlling candida albicans morphogenesis.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 422, 61-99 (2019).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+Candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in Candida species.</a> Elife. 10, 64682 (2021).</li><li>Mitra, S., Dolan, K., Foster, T. H., Wellington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+morphogenesis+of+Candida+albicans+during+infection+in+a+live+animal.">Imaging morphogenesis of Candida albicans during infection in a live animal.</a> Journal of Biomedical Optics. 15 (1), 010504 (2010).</li><li>Wakade, R. S., Huang, M., Mitchell, A. P., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+Candida+albicans+identifies+differential+in+vitro+and+in+vivo+filamentation+phenotypes+for+transcription+factor+deletion+mutants.">Intravital imaging of Candida albicans identifies differential in vitro and in vivo filamentation phenotypes for transcription factor deletion mutants.</a> mSphere. 6 (3), 0043621 (2021).</li><li>Wakade, R. S., Kramara, J., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+filamentation+does+not+require+the+cAMP-PKA+pathway+in+vivo.">Candida albicans filamentation does not require the cAMP-PKA pathway in vivo.</a> mBio. 13 (3), 0085122 (2022).</li><li>Bergeron, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Pseudomonas+aeruginosa+interact+to+enhance+virulence+of+mucosal+infection+in+transparent+zebrafish.">Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa interact to enhance virulence of mucosal infection in transparent zebrafish.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 00475 (2017).</li><li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+and+filaments+have+specialized,+independent+activities+in+a+zebrafish+model+of+Candida+albicans+infection.">Yeast and filaments have specialized, independent activities in a zebrafish model of Candida albicans infection.</a> Infection and Immunity. 86 (10), 00415-00418 (2018).</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 6th edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html">https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html</a> (2020)</li><li>Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotypic+profile+of+the+Candida+albicans+regulatory+network.">A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network.</a> Plos Genetics. 5 (12), 1000783 (2009).</li><li>Cullen, P. J., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+filamentous+growth+in+yeast.">The regulation of filamentous growth in yeast.</a> Genetics. 190 (1), 23-49 (2012).</li><li>Herrero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+filament+formation+in+Candida+albicans+by+polyamine+levels.">Control of filament formation in Candida albicans by polyamine levels.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4870-4878 (1999).</li><li>Ahmad Hussin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+auxotrophy+and+biotin+enhanced+germ+tube+formation+in+Candida+albicans.">Biotin auxotrophy and biotin enhanced germ tube formation in Candida albicans.</a> Microorganisms. 4 (3), 37 (2016).</li><li>Nantel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+profiling+of+Candida+albicans+cells+undergoing+the+yeast-to-hyphal+transition.">Transcription profiling of Candida albicans cells undergoing the yeast-to-hyphal transition.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3452-3465 (2002).</li><li>Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strains+and+strategies+for+large-scale+gene+deletion+studies+of+the+diploid+human+fungal+pathogen+Candida+albicans.">Strains and strategies for large-scale gene deletion studies of the diploid human fungal pathogen Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 4 (2), 298-309 (2005).</li><li>Glazier, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EFG1,+Everyone's+favorite+gene+in+Candida+albicans:+A+comprehensive+literature+review.">EFG1, Everyone's favorite gene in Candida albicans: A comprehensive literature review.</a> Frontiers in Cellular Infection and Microbiology. 12, 855229 (2022).</li><li>Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+and+diverse+regulation+of+the+Ras/cAMP/protein+kinase+A+pathway+in+Candida+albicans.">Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Chaturvedi, A. K., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+genetically+engineered+strain+to+evaluate+the+pathogenic+potential+of+yeast+cell+and+filamentous+forms+during+Candida+albicans+systemic+infection+in+immunodeficient+mice.">Use of a genetically engineered strain to evaluate the pathogenic potential of yeast cell and filamentous forms during Candida albicans systemic infection in immunodeficient mice.</a> Infection and Immunity. 76 (1), 97-102 (2008).</li><li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth.">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryotic Cell. 10 (7), 932-944 (2011).</li><li>Brothers, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase-driven+phagocyte+recruitment+controls+Candida+albicans+filamentous+growth+and+prevents+mortality.">NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003634 (2013).</li><li>Holmes, H., Kennedy, J. C., Pottier, R., Rossi, R., Weagle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recipe+for+the+preparation+of+a+rodent+food+that+eliminates+chlorophyll-based+tissue+fluorescence.">A recipe for the preparation of a rodent food that eliminates chlorophyll-based tissue fluorescence.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B: Biology. 29 (2-3), 199 (1995).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

מודל זה משתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לקבל תמונות של אורגניזמים מסוג C. albicans כשהם גדלים בתוך רקמה של פונדקאי של יונקים, ובכך מאפשר לנו להעריך פנוטיפים של מורפוגנזה במהלך זיהום פעיל. תהליך המורפוגנזה הוא מרכזי בפתוגנזה של C. albicans ונחקר באופן נרחב באמצעות מגוון של מבחנים במבחנה 2,3,4. עם זאת, שום בדיקה במבחנה אינה יכולה לדגום באופן מלא את הסביבה הביוכימית והמבנית המורכבת של המארח.
הפרוטוקול המתואר כאן מתמקד בשימוש במערכת הדמיה in vivo זו כדי להקרין סדרה/ספרייה של מוטציות C. albicans כדי לזהות את הגנים המעורבים במורפוגנזה במהלך זיהום. השימוש בזני C. albicans המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים שונים מאפשר לנו לכמת מורפוגנזה in vivo של זנים מוטנטיים של C. albicans בהשוואה לזן ייחוס. השוואת מורפוגנזה במוטציה לזן הייחוס באותו אזור של זיהום מבטיחה שהאורגניזמים ייחשפו לסביבות זהות. זה מאפשר מדידה כמותית של אחוז התאים העוברים נימה, כמו גם את מידת הנימה. הנורמליזציה של המדידות של הזן המוטנטי לאלה של זן הייחוס מאפשרת לנו להשוות טוב יותר את הביצועים של מוטנט אחד למשנהו.
התוצאות המייצגות המוצגות כאן מדגימות את הפוטנציאל לפער משמעותי בין הפנוטיפים in vitro ו - in vivo . הזן המוטנטי C. albicans efg1ΔΔ משמש לעתים קרובות כבקרה שלילית עבור מבחני מורפוגנזה מכיוון שהוא אינו מצליח לנחם כמעט בכל התנאים במבחנה 20. אף על פי שתוצאות ה-in vivo היו דומות מאוד לתוצאות במבחנה , אפילו הזן הקשה הזה יצר מדי פעם חוטים בסביבת הרקמה המארחת (איור 3). זה מדגיש את כוחה של הסביבה המארחת בהפעלת מורפוגנזה.
לעומת זאת, הזן המוטנטי cyr1ΔΔ מדגים מחלוקת משמעותית בין גידול במבחנה לגידול in vivo; אף על פי שאף אחד מהתאים המוטנטים לא עובר נימה במבחנה, כמחצית מהתאים גדלים כחוטים in vivo (איור 4)10,21. באופן מעניין, חוטים אלה היו קצרים משמעותית מאלו שנוצרו על ידי זן הייחוס, מה שמרמז על כך ש- CYR1 תורם לקצב צמיחת החוטים או ליכולת לשמור על פנוטיפ נימה. כדי להקל על ניתוח אורך החוטים, אורך נתיב העקומה של החוטים נמדד באמצעות הקרנה דו-ממדית של התמונות. בהיטלים דו-ממדיים של חוטים הגדלים בשלושה ממדים, כל נימה הגדלה על ציר שאינו מקביל למישור xy תקרין כקצרה מאורכה האמיתי. מכיוון שהתחזות זו מתרחשת גם עבור זן הייחוס, הערכת התפלגות אורכי החוטים בהקרנה דו-ממדית עדיין מאפשרת השוואה כמותית בין זני הייחוס לזנים המוטנטיים. ניתוח אורך החוט בשניים ולא בשלושה ממדים דורש ניתוח תמונה פחות אינטנסיבי; לכן, זה יכול להתבצע במהירות יחסית על מחשב שולחני טיפוסי. שימוש בניתוח פשוט יותר זה מאפשר לכלול את התפלגות אורך החוטים כחלק מפרוטוקול סינון, ומעניק הבנה מעמיקה יותר של היכולת של כל מוטציה לעבור מורפוגנזה מבלי לגרום לעיכובים משמעותיים בתפוקה.
המחקרים המייצגים שהוצגו כאן בוצעו באמצעות עכברי DBA2/N, אשר יש להם פגם במערכת המשלים שלהם הגורם לכשל בגיוס נויטרופילים לאתר של זיהום C. albicans 22. מטרת המחקרים הללו הייתה לחקור מנגנונים של ויסות נימה C. albicans בתוך הרקמה המארחת. לכן נעשה שימוש בעכברי DBA2/N כדי להימנע מבלבול התוצאות בגלל רגישות או עמידות של זן בודד לנויטרופילים. מכיוון שתגובת הנויטרופילים נגד C. אלביקנס יכולה להשפיע על נימה23, גיוס נויטרופילים לאתר ההדבקה עלול להשפיע על התוצאות של בדיקת מורפוגנזה. אם זן מסוים מסוגל לנימה in vivo אך מעוכב מאוד מ-filamentation כאשר קיימים נויטרופילים, נימה תזוהה בעכברי DBA2/N, אך לא סביר שניתן יהיה לראות אותה בעת שימוש בעכברים עם כימוטקסיס נויטרופילי שלם. לכן, המתח של העכבר המשמש כמארח הוא גורם חשוב בעת שימוש בפרוטוקול זה.
התצפית שלפיה הזן המוטנטי efg1ΔΔ אינו מצליח ליצור נימה in vivo אינה קשורה לתגובות נויטרופילים מארחים, מאחר שגם זן זה אינו מצליח ליצור נימה במבחנה. החוט שנצפה in vivo עם זן cyr1ΔΔ הוא מחלוקת עם כישלונו נימה במבחנה. נתונים ממודל דגי הזברה של זיהום C. albicans מצביעים על כך שנויטרופילים מגיבים חשובים במניעת מורפוגנזה24. לכן, השימוש בעכברי DBA2/N, שאין להם תגובות נויטרופילים, לא צפוי להסביר את העלייה בנימה של cyr1ΔΔ in vivo בהשוואה ל- in vitro. אף על פי כן, סביבת in vivo משפיעה בבירור על המורפוגנזה של זן cyr1ΔΔ; לפיכך, חקירה נוספת של זן זה עשויה לספק מידע חשוב על הרגולציה של C. albicans morphogenesis במהלך זיהומים פעילים. הפרוטוקול המתואר כאן נועד לשמש כבדיקת סינון לזיהוי זנים כגון זן cyr1ΔΔ שישמש במחקרים עתידיים.
השימוש במערכת הרדמה של גז בזרימה נמוכה עוזר מאוד לפרוטוקול הזה (איור 1A,B). במהלך הפיתוח הראשוני של פרוטוקול זה, עכברים הורדו באמצעות קוקטייל הרדמה בהזרקה של קטמין מעורבב עם קסילזין. בעוד שניתן היה לבצע הדמיה מוגבלת בשיטת הרדמה זו, משך ההרדמה היה בלתי צפוי, ודרש סיום מהיר של מפגשי ההדמיה כדי למנוע מהעכבר להתאושש מההרדמה במהלך ההדמיה. מערכות הרדמה מסורתיות בשאיפה הן מגושמות ודורשות קצב זרימה גבוה של גזי הרדמה, שלעתים קרובות דורשים שימוש בהם בתוך מכסה אדים. לפיכך, מערכות הרדמה מסורתיות בשאיפה יהיו קשות מאוד לשימוש עם אילוצי החלל של מיקרוסקופ קונפוקלי מבלי לחשוף בשוגג את החוקרים לחומרי ההרדמה. השימוש במערכת הרדמה בשאיפה בזרימה נמוכה מאפשר הרדמה עקבית של החיה תוך שמירה על סביבה בטוחה לחוקר. חרטום האף בעל הזרימה הנמוכה מאפשר מיקום קל של החיה הן לחיסון והן למיקרוסקופיה. צינורות ההובלה הקטנים בנפח נמוך מאפשרים שימוש בצינורות ארוכים יחסית, מה שמאפשר למקם את מכונת ההרדמה במרחק מספיק כדי לא להפריע למיקרוסקופיה.
הכלורופיל שנמצא בצ'או עכברי טיפוסי מוביל לאוטופלואורסצנציה משמעותית של רקמות25. הדבר יוצר רעש משמעותי בתמונות, ומקשה על השגת תמונות באיכות גבוהה וברזולוציה מרחבית גבוהה. כאשר בעלי חיים הוזנו בצ'או ללא כלורופיל במשך 7 ימים לפני ההדמיה, הרקע מאוטופלואורסצנציה פחת באופן משמעותי ברקמות, אך כלורופיל שהופקד בשיער המשיך להיות בעייתי. הסרת השיער מהפינה באמצעות קרם דפילציה כימי ללא מרשם יעילה במזעור האוטופלואורסצנטיות בשיער (איור 1C,D). לפיכך, השילוב של צ'או ללא כלורופיל והסרת שיער נאותה הפחית באופן משמעותי את ה-autofluorescence ושיפר את איכות התמונה באופן דרמטי. מכיוון שהשיער מוסר מהאוזן לפני ההדמיה, צבע השיער של החיה אינו משפיע על מערכת זו. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לחקר זיהומים מסוג C. albicans בעכברי BALB/c (לבן), C57BL/6 (שחור) ו-DBA2/N (חום). ניתן להשתמש בפרוטוקול גם עם עכברי נוקאאוט C57BL/6 הסובלים ממחסור בגנים מארחים שונים; זה יאפשר חקירות עתידיות של האופן שבו מערכת החיסון של היונקים המארחים משפיעה על נימה. מאפיין אחד של מודל זה שלא נדון בפרוטוקול זה הוא שמכיוון שמערכת הדמיה זו אינה פולשנית, ניתן לדמות את אותה חיה שוב ושוב במשך מספר ימים, מה שמאפשר לעקוב אחר התקדמות ההדבקה הבודדת לאורך זמן. סביר להניח שתכונה זו תשחק תפקיד מפתח במחקרים עתידיים על האינטראקציה בין המארח לפתוגן.
לסיכום, פרוטוקול זה מביא לתמונות ברזולוציה מרחבית גבוהה של C. albicans הגדלים ברקמה של פונדקאי יונק חי, ומאפשר הערכה מדויקת של מורפוגנזה בזנים מוטנטיים 8,9,10. התוצאות המוצגות כאן מדגימות כיצד ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לסנן ספרייה של מוטנטים של C. albicans. מבין המוטנטים של C. albicans שנבדקו עד כה, חלק גדול מהמוטנטים עם פגמים ידועים במורפוגנזה במבחנה עוברים בקלות נימה in vivo 9,10. זה מדגיש את החשיבות של הכללת מערכת in vivo כמו זו בניסויים שנועדו להבהיר את המנגנונים של C. albicans פתוגנזה.

קנדידה אלביקנס היא פתוגן פטרייתי אנושי נפוץ, הגורם למחלות רירית, מחלה מופצת וזיהומים מקומיים ברקמות1. תכונה מרכזית של הפיזיולוגיה של C. albicans היא הצמיחה הפולימורפית המורכבת שלה, הקשורה לתפקידה הן כקומנסל והן כפתוגן 2,3,4. בתנאים מזינים עשירים במבחנה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, הוא גדל בדרך כלל כשמרים ניצני ביצית. מגוון של טריגרים סביבתיים, כולל מחסור בחומרים מזינים, שינויי pH, צמיחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, חשיפה לסרום וגדילה כאשר הם מוטמעים באגר, גורמים למעבר לדפוס גדילה מקוטב, וכתוצאה מכך נוצרים היפאה אמיתית ו/או פסאודו-היפאה5. התחלת הצמיחה המקוטבת והצמיחה הנובעת מכך של אורגניזמים נימה מכונה מורפוגנזה.
בגלל החשיבות של מורפוגנזה באלימות של האורגניזם, הוויסות של היווצרות hyphal נחקר בהרחבה 6,7. קיימת רשת מורכבת של מסלולי איתות וויסות שעתוק המפעילה מורפוגנזה. למרות הקשר בין מורפוגנזה של C. albicans לבין פתוגנזה, רוב המחקרים שחקרו מורפוגנזה השתמשו בגירויים חוץ-גופיים כדי לעורר היווצרות היפלים. מתברר יותר ויותר כי המודלים השונים של נימה במבחנה אינם זהים מבחינת המסלולים הרגולטוריים האינדיבידואליים המגורה. יתר על כן, תנאי גידול במבחנה אינם תואמים באופן הדוק את הסביבה המורכבת של המארח. בהתחשב בחשיבותו של C. albicans כפתוגן אנושי, מטרת פרוטוקול זה היא לחקור את המורפוגנזה שלו במהלך זיהום פעיל בפונדקאי יונק באמצעות מערכת עם תפוקה מתונה, ובכך לאפשר לחוקר לסנן ספריות מוטנטיות של C. albicans. 
כדי להקל על חקירות אלה, פותחה מערכת הדמיה in vivo המאפשרת לנו לקבל תמונות ברזולוציה מרחבית גבוהה של תאי C. albicans במהלך זיהום של פינה של עכבר מורדם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך 8,9,10. מכיוון שהעור של הפינה הוא דק למדי, תמונות אלה ניתן להשיג ללא צורך דיסקציה רקמות. לפיכך, נתוני פנוטיפ כמותיים ניתן למדוד באתר של זיהומים פעילים בתוך הרקמה המארחת. הפרוטוקול המתואר כאן כולל טרנספורמציה של זן ייחוס וזן מוטנטי אחד או יותר עם קלטות ביטוי חלבון פלואורסצנטיות שונות11,12. לאחר מכן, הזנים המבטאים חלבון פלואורסצנטי מעורבבים ומוזרקים יחד באופן תוך-עורי. לאחר ההדבקה, הדמיה confocal משמש לכמת הן את תדירות החוטים ואת אורך החוטים שנוצרו. הנתונים המתקבלים מהזנים המוטנטיים מנורמלים לאלה המתקבלים מזן הייחוס, הנמצא באותו אזור רקמות, ובכך מספקים בקרה פנימית. מערכת זו אפשרה לנו לסנן בהצלחה מספר סדרות של זנים מוטנטיים מסוג C. albicans, שלרבים מהם יש פגמים במורפוגנזה במבחנה 9,10. רבים מהזנים האלה נימה בקלות in vivo, מה שמדגיש את החשיבות של מודלים in vivo לחקר מורפוגנזה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 coverslips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>20811</td>
			<td>large enough to cover the universal stage opening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 mL Insulin syringes</td>
			<td>EXELint</td>
			<td>26018</td>
			<td>Can use syringes that are 5/16&#34;&#8211;1/2&#34; long and 29&#8211;32 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.7% formaldehyde in dPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBJ5734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol/30% water</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>A05061001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.albicans reference strain and experimental strains</td>
			<td>SN250</td>
			<td>FGSC Online Catalog</td>
			<td>The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyl free mouse chow</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2920x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7050</td>
			<td>Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicator</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>76200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBA2/N (6-12 week old mice)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.&#160; The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.&#160; This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.&#160; It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.&#160; 
			Examples:&#160; 
			https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-40 
			https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174320&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-26 
			https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Must be sterile; open a new container for every experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze pad</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>P157112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel eye lurbicant</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ or FIJI analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ (FIJI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>J119005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8 (SP8)</td>
			<td>The objective lens&#160; (Leica 11506375) used here&#160; is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. 
			The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free&#160; spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. 
			The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific International</td>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair hair remover lotion</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Over the counter depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AB-101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent protein expression transformation constructs&#160; generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensitive laboratory tape</td>
			<td>Tape &#38; Label Graphic Systems Inc</td>
			<td>1007910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 cell culture medium</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>To safely hold the animals ear during injectinos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host

קנדידה אלביקנס היא פתוגן אנושי חשוב. יכולתו לעבור בין צורות מורפולוגיות היא מרכזית לפתוגנזה שלו; שינויים מורפולוגיים אלה מווסתים על ידי רשת איתות מורכבת הנשלטת בתגובה לגירויים סביבתיים. רכיבים רגולטוריים אלה נחקרו מאוד, אך כמעט כל המחקרים משתמשים במגוון גירויים במבחנה כדי להפעיל נימה. כדי לקבוע כיצד מורפוגנזה מווסתת במהלך תהליך הפתוגנזה, פיתחנו מערכת מיקרוסקופיה in vivo כדי לקבל תמונות ברזולוציה מרחבית גבוהה של אורגניזמים העוברים היווצרות היפאלית בתוך פונדקאי היונקים. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את השימוש במערכת זו כדי לסנן אוספים קטנים של זנים מוטנטיים של C. albicans , ומאפשר לנו לזהות רגולטורים מרכזיים של מורפוגנזה כפי שהיא מתרחשת באתר ההדבקה. מוצגות תוצאות מייצגות, המוכיחות כי לחלק מהרגולטורים של מורפוגנזה, כגון רגולטור השעתוק Efg1, יש פנוטיפים עקביים במבחנה וב- in vivo , בעוד שלרגולטורים אחרים, כגון אדניל ציקלאז (Cyr1), יש פנוטיפים שונים באופן משמעותי in vivo בהשוואה ל- in vitro.

התוצאות המוצגות כאן מבוססות על דוחות 9,10 שפורסמו בעבר. מטרת ניתוח זה היא להעריך באופן כמותי את יכולתם של זני C. albicans מוטנטיים לעבור מורפוגנזה במהלך זיהומים פעילים. קשה להעריך את הפרמטרים האופייניים המבדילים בין פסאודוהיפאה ל-hyphae באורגניזמים הגדלים בשלושה ממדים בסביבת in vivo מורכבת. זה נכון במיוחד כאשר מסתכלים על חתכים דו מימדיים שנוצרו על ידי הדמיה confocal. לכן, ניתוח סינון זה מתמקד בזיהוי אורגניזמים הגדלים כנימים לעומת שמרים. עבור מחקרי המשך באמצעות ניתוח מעמיק יותר, כולל שחזורים תלת מימדיים, ניתן להתאים שיטה זו כדי להפלות שמרים, hyphae ו pseudohyphae.
הביטוי של חלבון פלואורסצנטי בזן ייחוס או מוטנטי של C. albicans מאפשר זיהוי ישיר של מורפולוגיה של זן in vivo (איור 3 ואיור 4). באופן כללי, ניתוח מיקרוסקופיית אור כמותית מבוצע בצורה הטובה ביותר כאשר מעטים עד אף אחד מהפיקסלים בתמונה רוויים. עבור פרוטוקול זה, עם זאת, רוויה של התמונה לעתים קרובות מפשט את הניתוח. לוקליזציה של חלבונים פלואורסצנטיים אינה אחידה בכל התא ולעתים קרובות היא גבוהה יותר בשמרים האם מאשר בחוטים. למרבה המזל, לצורך חקירת המורפוגנזה, ההתפלגות המרחבית של האות, ולא עוצמתו, מגדירה את התוצאה. לכן, קבלת תמונות שבהן רוויים פיקסלים רבים משפרת את היכולת לכמת מורפוגנזה בבדיקה זו.
כדי להמחיש את החשיבות של הערכת מורפוגנזה in vivo, מוצגות תוצאות מייצגות עבור זן הייחוס (SN250) ושני מוטאנטים: האחד חסר את גורם השעתוק Efg1 והשני חסר אדניליל ציקלאז Cyr1. במבחנה, אף אחד מהזנים הללו לא גדל כחוטים20,21. כאשר מגדלים אותו במבחנה במדיום RPMI בתוספת סרום של 10%, זן הייחוס יוצר במהירות חוטים, בעוד שהזנים efg1ΔΔ ו-cyr1ΔΔ אינם (איור 3 ואיור 4). בתנאים אלה, המוטציה efg1ΔΔ מציגה צמיחה מקוטבת במקצת, כאשר תאי הבת מוארכים מעט בהשוואה לתאי האם. זה מדגיש את החשיבות של שימוש בהגדרה ברורה של נימה. כל הגדרה כזו היא כברירת מחדל שרירותית, אך היא הכרחית להערכה עקבית של הפנוטיפ. עבור מחקרים אלה, תבנית נימה של גדילה מוגדרת כאורגניזם עם הממד הארוך ביותר של תא בת יותר מפי שניים מזה של תא האם. באמצעות הגדרה זו, תאי efg1ΔΔ המוארכים אינם נימה.
בהתאם לפנוטיפ ה-in vitro שלו, ה-efg1 ΔΔ מציג פגם נימה משמעותי ב-vivo: כ-9% מתאי ה-EFG1ΔΔ גדלו כחוטים in vivo (איור 3). לעומת זאת, 53% מהתאים המוטנטיים cyr1ΔΔ גדלו כחוטים in vivo (איור 4). אף על פי שמספר התאים המוטנטים cyr1 ΔΔ שעברו נימה in vivo היה נמוך משמעותית מזן הייחוס, היכולת של מוטנט cyr1ΔΔ ליצור חוטים in vivo מייצגת שינוי משמעותי מהיעדר מוחלט של מורפוגנזה במבחנה. מבחינה חזותית, החוטים שנוצרו על ידי מוטנט cyr1ΔΔ נראו קצרים יותר מזן הייחוס. כדי להעריך זאת באופן כמותי, אורך נתיב העקומה של התאים הננימים נמדד באמצעות הקרנה דו-ממדית של תמונות in vivo (איור 4E). האורך החציוני של חוטי cyr1ΔΔ היה קצר ב-29% מהחוטים של זן הייחוס.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg"> איור 1: הרדמה וחיסון . (A) אינדוקציה של הרדמה באמצעות תא אינדוקציה. (B) ההרדמה נשמרת באמצעות חרוט אף, המאפשר למקם מחדש את העכבר לפי הצורך. (C) קרם להסרת שיער נמרח באמצעות אפליקטור בעל קצה כותנה. ג'ל סיכה לעיניים הוחל כדי להגן על העיניים במהלך הרדמה. (D) הסרת שיער יעילה של אוזן ימין. השווה לאוזן שמאל שלא טופלה. (E) הזרקה תוך-עורית של C. albicans לתוך אוזן העכבר. האוזן מוחזקת במקומה באמצעות קצה של צינור חרוטי עטוף בסרט עור דו צדדי (סרט אופנה). (F) תקריב של הזרקה תוך-עורית. בועה חיוורת נוצרת בעור, המהווה סימן למיקום תוך-עורי מוצלח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg"> איור 2: הכנה להדמיה. (A) שלב מיקרוסקופ מוכן להדמיה. חרוט האף בהרדמה מאובטח במקומו. על הבמה מודבקת מכסה מכסה את פתח העדשה. פיסות קלטות נוספות זמינות. השלב המחומם מחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס (לא מוצג). (B) מיקום העכבר המרדים לתוך חרוט האף בהרדמה. (C) העכבר מסובב מעט כך שצד האוזן שחוסן פונה לכיוון המכסה התחתון/העדשה האובייקטיבית. לאחר מכן משטחים את האוזן כנגד הכיסוי התחתון ומאובטחים במקומם על ידי הנחת כיסוי שני על גבי האוזן. (D) הכיסוי העליון מודבק לבמה כדי לאבטח את האוזן במקומה ביחס לשלב המיקרוסקופ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg"> איור 3: מורפולוגיה במבחנה וב-in vivo של הזן המוטנטי efg1ΔΔ. (A) תמונת שדה רחב של זנים מוטנטיים מסוג WT ו-EFG1ΔΔ לאחר אינדוקציה במבחנה של נימה על ידי גידול תאים ב-RPMI + 10% סרום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. סרגלי קנה מידה מייצגים 10 מיקרומטר. ניגודיות התמונה הותאמה באמצעות תוכנת עריכת תמונות כדי להקל על הצפייה. (B) אחוז החוטים במבחנה שנצפו בזנים המוטנטיים WT ו-EFG1ΔΔ. Und = בלתי ניתן לגילוי (לא זוהו חוטים). גובה הבר מייצג את האחוז החציוני של תאים נימה משלושה ניסויים בלתי תלויים שבהם כימתו לפחות 100 תאים. קווי השגיאה מציינים סטיית תקן (התוצאות הושוו על-ידי מבחן t של התלמיד, p < 0.001). (C) מיקרוגרף קונפוקלי של WT (ירוק) ומוטנט EFG1ΔΔ (אדום) הגדל ב- vivo 24 שעות לאחר החיסון. חצים מציינים דוגמאות של תאים מוטנטיים מסוג EFG1ΔΔ העונים על ההגדרה שלנו של "נימה". סרגל קנה המידה מייצג 50 מיקרומטר. (D) אחוז הנימה in vivo שנצפתה בזנים המוטנטיים WT ו - efg1ΔΔ. גובה המוט מייצג את האחוז החציוני של תאים נימה משני ניסויים בלתי תלויים. קווי השגיאה מציינים סטיית תקן (התוצאות הושוו על ידי מבחן t של התלמיד, p < 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg"> איור 4: מורפולוגיה במבחנה וב-in vivo של הזן המוטנטי cyr1 ΔΔ. (A) תמונת שדה רחב של הזן המוטנטי cyr1ΔΔ לאחר אינדוקציה חוץ גופית של נימה על ידי גידול תאים בסרום RPMI + 10% בסרום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. סרגל קנה המידה מייצג 10 מיקרומטר. ניגודיות התמונה הותאמה באמצעות תוכנת עריכת תמונות כדי להקל על הצפייה. (B) אחוז החוטים במבחנה שנצפו בזנים המוטנטיים WT ו-cyr1ΔΔ. Und = בלתי ניתן לגילוי (לא זוהו חוטים). גובה הבר מייצג את האחוז החציוני של תאים נימה משלושה ניסויים בלתי תלויים שבהם כימתו לפחות 100 תאים. קווי השגיאה מציינים סטיית תקן (התוצאות הושוו על-ידי מבחן t של התלמיד, p < 0.001). (C) מיקרוגרף קונפוקלי של WT (ירוק) ומוטנט cyr1ΔΔ (אדום) הגדל ב- vivo 24 שעות לאחר החיסון. סרגל קנה המידה מייצג 50 מיקרומטר. (D) אחוז הנימה in vivo שנצפתה בזנים המוטנטיים WT ו-cyr1ΔΔ. גובה המוט מייצג את האחוז החציוני של תאים נימה משני ניסויים בלתי תלויים. קווי השגיאה מציינים סטיית תקן (התוצאות הושוו על-ידי מבחן t של התלמיד, p < 0.001). (E) התפלגות אורך החוטים in vivo, כפי שהיא נמדדת על ידי אורך נתיב העקומה בהיטל דו-ממדי של מחסנית z. כל נקודה מייצגת את אורכו של נימה אחת. תאים שגדלו כשמרים לא נכללו בניתוח זה. סרגל מציין את אורך החוט החציוני. התפלגות האורכים שונה באופן משמעותי כאשר מנתחים אותה באמצעות מבחן U של מאן-וויטני (p < 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

כתב יד זה מתאר שיטה לסינון ספריות מוטנטיות בגודל בינוני של קנדידה אלביקנס עבור פנוטיפים של מורפוגנזה במהלך זיהום פעיל בפונדקאי של יונקים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לא פולשנית.

שימוש בהדמיית in vivo לבדיקת פנוטיפים של מורפוגנזה בזנים מוטנטיים של קנדידה אלביקנס במהלך זיהום פעיל בפונדקאי של יונקים

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

המורפוגנזה של קנדידה אלביקנס מופעלת על ידי מספר עצום של אותות סביבתיים. על-ידי חקירת מורפוגנזה in vivo, אנו קובעים כיצד האורגניזם משתלב ומגיב לכל האותות הסביבתיים האלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לחקור מורפוגנזה בהיעדר הטיה או ממצאים שעשויים להיות מוצגים באמצעות מערכות מודל במבחנה.מעט מאוד אנשים יש ניסיון עם זריקות intradermal. אני ממליץ בחום למישהו חדש בטכניקה זו ליצור קשר עם הווטרינר של משאבי בעלי החיים שלו לקבלת עזרה בלמידה. מי שידגים את ההליך יהיה רוהאן וואקאדה, פוסט-דוקטורנט מקבוצת המעבדה שלנו.התחילו בהכנת בעל החיים לחיסון על ידי האכלת צ'או נטול כלורופיל במשך שבעה ימים לפחות לפני החיסון. יום אחד לפני ההזרקה, קח דאב של תאי אלביקנס מקנדה ממושבה אחת באמצעות קיסם. לחסן 25 מיליליטר של YPD ולחזור על תהליך זה מספר פעמים כדי לקבל תאים מכמה מושבות שונות.דגירה של התרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס באינקובטור שייקר מסלולי ב-175 סל"ד. צנטריפוגה מיליליטר אחד של תרבית במשך שתי דקות ב 500 x גרם, ולאחר מכן לשטוף את השמרים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של DPBS סטרילי. יש להשעות את הכדור במיליליטר אחד של DPBS סטרילי ולדלל את התרבית ב-1 עד 100.לספור את התאים באמצעות hemocytometer ובהתאם להתאים את צפיפות התא. לאחר מכן, צור את האינוקולום להזרקה על ידי ערבוב נפחים שווים של הזן המוזכר והניסיוני. באמצעות צמר גפן, יש למרוח קרם דפילציה ללא מרשם בנדיבות על פני השטח הפנימיים והחיצוניים של שתי האוזניים של חיה מורדמת.לאחר שתיים עד שלוש דקות, נגבו בעדינות את האוזן עם גזה יבשה ואחריה רפידות גזה רוויות במים סטריליים כדי להסיר ביסודיות שאריות קרם דפילציה. לאחר עיקור פני השטח של האוזניים עם 70% אתנול, מערבבים היטב את האינוקולום על ידי היפוך הבקבוקון מספר פעמים או מערבולת אותו. ציירו 20 עד 30 מיקרוליטרים של אינוקולום לתוך מזרק אינסולין.החזיקו את המחט במצב זקוף וטפחו על המזרק בעדינות כדי לוודא שכל האוויר בחבית נמצא בחלק העליון. יש לפלוט בזהירות אוויר ועודפי אינוקולום בחזרה לצינור האינוקולום או לצינור פסולת, כך שהבוכנה תהיה בסימן 10 מיקרוליטר. יש למרוח ללא מרשם סרט עור דו-צדדי על צינור פלסטיק חרוטי קטן או בעל תחתית עגולה ולעטוף את האוזן על פני הקלטת, תוך הימנעות מהסרת חרוט האף בהרדמה.שמירה על מחט המזרק כמעט במקביל לעור והימנעות מכל ורידים גדולים, להחדיר את קצה המחט לתוך השכבה החיצונית ביותר של העור עד השיקוע הוא רק מכוסה לאט לאט להזריק את inoculum intradermally. הזרקה תוך-עורית טובה תעלה בועה קטנה בעור. יש לשמור את המחט במקומה למשך 15 עד 20 שניות לפני הסרתה מהאוזן כדי למזער את הדליפה.בהתאם לפרוטוקולים המוסדיים, סמנו את הכלוב בתוויות ביו-האזר המציינות כי בעלי החיים בכלוב נגועים בקנדידה אלביקנס. באמצעות אותן תרביות שטופות ששימשו להכנת האינוקולום, יוצרות דילול של 1 עד 50 תאים ב-RPMI 1640, בתוספת 10% חום וסרום בקר עוברי פעיל ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רטט במשך ארבע שעות. בחן את הדגימה באמצעות מיקרוסקופ.סופרים לפחות 100 תאים, ורושמים את מספר תאי השמרים והתאים הננימים עבור כל זן. סובבו את מטרת מרחק העבודה הארוך למקומה והניחו טיפה של נוזל טבילה על העדשה. הנמיכו את העדשה כדי למנוע נזק אפשרי בעת הנחת הכיסוי.מניחים את הכיסוי מספר 1.5 מחליקים מעל פתח הבמה ומדביקים אותו למקומו. הרם את המטרה כך שנוזל הטבילה יהיה במגע הן עם העדשה האובייקטיבית והן עם החלקת הכיסוי. אבטחו חרוט אף הרדמה על במת המיקרוסקופ באופן כזה שהוא יכסה את האף של החיה במלואה כאשר היא נמצאת במצב הדמיה.מקם את אפו של עכבר מורדם לתוך חרוט האף. הניחו טיפת מים סטריליים על הכיסוי מעל העדשה האובייקטיבית. התאם את חרוט האף בהרדמה ומקם את העכבר כך שאוזנו של העכבר תהיה מעל טיפת המים.קח תלוש כיסוי נוסף והנח את קצה הכיסוי במקביל לגוף העכבר כאשר הקצה נוגע בעכבר במקום שבו האוזן פוגשת את הראש. באמצעות תנועת ציר, הורידו את הקצה החופשי של הכיסוי אל שלב המיקרוסקופ. כאשר החלקת הכיסוי מגיעה כנגד שלב המיקרוסקופ, היא תשטח את האוזן.הדביקו את הכיסוי העליון כדי להחזיק מספיק לחץ כדי לשמור על האוזן שטוחה ולהימנע מלתפוס את שיער העכבר או שפמו בקלטת. אלא אם כן נעשה שימוש במיקרוסקופ עם תא סביבתי, לכסות באופן רופף את גוף העכבר עם וילון סטרילי כדי לשמור על סביבה תרמית רגילה. באמצעות אור לבן, הדמיית שדה רחב, התאמת מישור המיקוד לרקמת האוזן והתמקדות בתאי הדם האדומים הנעים בכלי הדם.כדי לקבל יחס אות לרעש חזק מספיק כך שניתן יהיה לקבוע מורפולוגיה עבור כל התאים בשדה הראייה, התאם את עוצמת הלייזר או את מהירות ההדמיה. כדי למנוע נזק לרקמות, השתמש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית. בחרו שדה ראייה עם היווצרות נימה ברורה בזן המוזכר ושבו רוב האורגניזמים מפוזרים מספיק כדי שניתן יהיה לקבוע את המורפולוגיה שלהם.הגדר את מישור המיקוד העליון והתחתון עבור ערימת Z. כיסוי כל עומק האזור הנגוע אינו הכרחי, אך יש לזכור כי אורגניזמים בחלק העליון או התחתון של נפח התמונה בדרך כלל אינם נכללים בניתוח. רכשו תמונות Z-stack, צבע מדומה בכל ערוץ כדי להבחין בין כל זן ולכסות את הערוצים.שמור את התמונות. השתמש בתוכנת הדמיה כדי לבצע הקרנה מרבית של מחסנית Z לתמונה דו-ממדית. ספרו כל אורגניזם שנראה בתמונות ההקרנה המרביות לפי סוג זן ומורפולוגיה.הזן המוזכר יוצר במהירות חוטים במבחנה. ואילו EFG1 Null לא הצליח ליצור את החוטים. EFG1 Null מציג פגם נימה משמעותי in vivo גם כן.כ-9% מתאי EFG1 Null גדלו כחוטים in vivo. באופן דומה, הזן המוטנטי CYR1 Null הראה פגם נימה במבחנה בהשוואה לזן שאליו התייחסו. לעומת זאת, 53% מהתאים המוטנטיים של CYR1 Null גדלו כחוטים in vivo.החוטים שנוצרו על ידי מוטנט CYR1 Null היו קצרים יותר מהזן המוזכר. חשוב לשמור על המחט במקביל לעור במהלך החיסון. המטרה היא למקם את האינוקולום ממש מתחת לשכבה החיצונית של העור.ניתן להשתמש בטכניקה זו גם עם זני עכברים המבטאים חלבון פלואורסצנטי בתאים מארחים בעלי עניין, מה שמאפשר לנו לחקור אינטראקציות של פתוגנים מארחים in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

בתחום ההדמיה vivo של טפילים טראנסגנטי שושנת יריחו שורה חיים

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

בחינת פנוטיפים מארח ב<em&gt; Affinis Gambusia</em&gt; בעקבות טיפול אנטיביוטי

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

הבהרת והדמיה של קנדידה ביוביאמים

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Ex vivo Assay לחקר קנדידה אלביקנים מקף מורפוגנזה במערכת העיכול

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

זיהום חוזר בדרכי השתן של Escherichia coli שנגרם על ידי גרדנרלה וגינליס חשיפה לשלפוחית השתן בעכברים

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...