Name: use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00
Duration: 9 min 24 s
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इस काम को एनआईएच अनुदान 1आर01एआई 33409 और बाल रोग विभाग, कार्वर कॉलेज ऑफ मेडिसिन, आयोवा विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।

<ol>
	<li>Lopes, J. P., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+virulence+of+Candida+albicans.">Pathogenesis and virulence of Candida albicans.</a> Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+control+of+cell+morphology+in+vivo+reveals+distinct+roles+for+yeast+and+filamentous+forms+of+Candida+albicans+during+infection.">Engineered control of cell morphology in vivo reveals distinct roles for yeast and filamentous forms of Candida albicans during infection.</a> Eukaryotic Cell. 2 (5), 1053-1060 (2003).</li><li>Arita, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+associated+proteins+involved+in+filamentation+with+impact+on+the+virulence+of+Candida+albicans.">Cell wall associated proteins involved in filamentation with impact on the virulence of Candida albicans.</a> Microbiological Research. 258, 126996 (2022).</li><li>Rai, L. S., Wijlick, L. V., Bougnoux, M. E., Bachellier-Bassi, S., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+commensal+and+pathogenic+life-styles+of+an+opportunistic+fungus-Candida+albicans.">Regulators of commensal and pathogenic life-styles of an opportunistic fungus-Candida albicans.</a> Yeast. 38 (4), 243-250 (2021).</li><li>Sudbery, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Candida+albicans+hyphae.">Growth of Candida albicans hyphae.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).</li><li>Basso, V., d'Enfert, C., Znaidi, S., Bachellier-Bassi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+genes+to+networks:+The+regulatory+circuitry+controlling+candida+albicans+morphogenesis.">From genes to networks: The regulatory circuitry controlling candida albicans morphogenesis.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 422, 61-99 (2019).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+Candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in Candida species.</a> Elife. 10, 64682 (2021).</li><li>Mitra, S., Dolan, K., Foster, T. H., Wellington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+morphogenesis+of+Candida+albicans+during+infection+in+a+live+animal.">Imaging morphogenesis of Candida albicans during infection in a live animal.</a> Journal of Biomedical Optics. 15 (1), 010504 (2010).</li><li>Wakade, R. S., Huang, M., Mitchell, A. P., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+Candida+albicans+identifies+differential+in+vitro+and+in+vivo+filamentation+phenotypes+for+transcription+factor+deletion+mutants.">Intravital imaging of Candida albicans identifies differential in vitro and in vivo filamentation phenotypes for transcription factor deletion mutants.</a> mSphere. 6 (3), 0043621 (2021).</li><li>Wakade, R. S., Kramara, J., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+filamentation+does+not+require+the+cAMP-PKA+pathway+in+vivo.">Candida albicans filamentation does not require the cAMP-PKA pathway in vivo.</a> mBio. 13 (3), 0085122 (2022).</li><li>Bergeron, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Pseudomonas+aeruginosa+interact+to+enhance+virulence+of+mucosal+infection+in+transparent+zebrafish.">Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa interact to enhance virulence of mucosal infection in transparent zebrafish.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 00475 (2017).</li><li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+and+filaments+have+specialized,+independent+activities+in+a+zebrafish+model+of+Candida+albicans+infection.">Yeast and filaments have specialized, independent activities in a zebrafish model of Candida albicans infection.</a> Infection and Immunity. 86 (10), 00415-00418 (2018).</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 6th edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html">https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html</a> (2020)</li><li>Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotypic+profile+of+the+Candida+albicans+regulatory+network.">A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network.</a> Plos Genetics. 5 (12), 1000783 (2009).</li><li>Cullen, P. J., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+filamentous+growth+in+yeast.">The regulation of filamentous growth in yeast.</a> Genetics. 190 (1), 23-49 (2012).</li><li>Herrero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+filament+formation+in+Candida+albicans+by+polyamine+levels.">Control of filament formation in Candida albicans by polyamine levels.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4870-4878 (1999).</li><li>Ahmad Hussin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+auxotrophy+and+biotin+enhanced+germ+tube+formation+in+Candida+albicans.">Biotin auxotrophy and biotin enhanced germ tube formation in Candida albicans.</a> Microorganisms. 4 (3), 37 (2016).</li><li>Nantel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+profiling+of+Candida+albicans+cells+undergoing+the+yeast-to-hyphal+transition.">Transcription profiling of Candida albicans cells undergoing the yeast-to-hyphal transition.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3452-3465 (2002).</li><li>Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strains+and+strategies+for+large-scale+gene+deletion+studies+of+the+diploid+human+fungal+pathogen+Candida+albicans.">Strains and strategies for large-scale gene deletion studies of the diploid human fungal pathogen Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 4 (2), 298-309 (2005).</li><li>Glazier, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EFG1,+Everyone's+favorite+gene+in+Candida+albicans:+A+comprehensive+literature+review.">EFG1, Everyone's favorite gene in Candida albicans: A comprehensive literature review.</a> Frontiers in Cellular Infection and Microbiology. 12, 855229 (2022).</li><li>Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+and+diverse+regulation+of+the+Ras/cAMP/protein+kinase+A+pathway+in+Candida+albicans.">Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Chaturvedi, A. K., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+genetically+engineered+strain+to+evaluate+the+pathogenic+potential+of+yeast+cell+and+filamentous+forms+during+Candida+albicans+systemic+infection+in+immunodeficient+mice.">Use of a genetically engineered strain to evaluate the pathogenic potential of yeast cell and filamentous forms during Candida albicans systemic infection in immunodeficient mice.</a> Infection and Immunity. 76 (1), 97-102 (2008).</li><li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth.">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryotic Cell. 10 (7), 932-944 (2011).</li><li>Brothers, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase-driven+phagocyte+recruitment+controls+Candida+albicans+filamentous+growth+and+prevents+mortality.">NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003634 (2013).</li><li>Holmes, H., Kennedy, J. C., Pottier, R., Rossi, R., Weagle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recipe+for+the+preparation+of+a+rodent+food+that+eliminates+chlorophyll-based+tissue+fluorescence.">A recipe for the preparation of a rodent food that eliminates chlorophyll-based tissue fluorescence.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B: Biology. 29 (2-3), 199 (1995).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

कैंडिडा अल्बिकन्स एक आम मानव कवक रोगज़नक़ है, जिससे म्यूकोक्यूटेनियस रोग, प्रसारित रोग और स्थानीय ऊतक संक्रमणहोता है। अल्बिकन्स फिजियोलॉजी की एक प्रमुख विशेषता इसकी जटिल बहुरूपी वृद्धि है, जो एक कॉमेंसल और एक रोगज़नक़ 2,3,4 दोनों के रूप में इसकी भूमिका से जुड़ी हुई है। 30 डिग्री सेल्सियस पर विट्रो में समृद्ध पोषक तत्वों की स्थिति के तहत, यह आमतौर पर एक ओवॉइड नवोदित खमीर के रूप में बढ़ता है। पोषक तत्वों की कमी, पीएच परिवर्तन, 37 डिग्री सेल्सियस पर वृद्धि, सीरम के संपर्क में, और अगर में एम्बेडेड होने पर विकास सहित विभिन्न प्रकार के पर्यावरणीय ट्रिगर्स के परिणामस्वरूप ध्रुवीकृत विकास पैटर्न में संक्रमण होता है, जिसके परिणामस्वरूप सच्चे हाइफे और / या स्यूडोहिफे5 का गठन होता है। ध्रुवीकृत विकास की शुरुआत और फिलामेंटस जीवों के परिणामस्वरूप विकास को मोर्फोजेनेसिस के रूप में जाना जाता है।
जीव की उग्रता में मोर्फोजेनेसिस के महत्व के कारण, हाइफल गठन के विनियमन का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है 6,7. सिग्नलिंग मार्गों और ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन का एक जटिल नेटवर्क है जो मॉर्फोजेनेसिस को ट्रिगर करता है। रोगजनन के साथ सी अल्बिकन्स मॉर्फोजेनेसिस के संबंध के बावजूद, मॉर्फोजेनेसिस की जांच करने वाले अधिकांश अध्ययनों ने हाइफल गठन को ट्रिगर करने के लिए इन विट्रो उत्तेजनाओं का उपयोग किया है। यह तेजी से स्पष्ट हो रहा है कि फिलामेंटेशन के विभिन्न इन विट्रो मॉडल उत्तेजित व्यक्तिगत नियामक मार्गों के संदर्भ में समान नहीं हैं। इसके अलावा, कोई भी इन विट्रो विकास की स्थिति मेजबान के जटिल वातावरण के साथ कसकर मेल नहीं खाती है। मानव रोगज़नक़ के रूप में सी अल्बिकन्स के महत्व को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मध्यम थ्रूपुट वाली प्रणाली का उपयोग करके स्तनधारी मेजबान में सक्रिय संक्रमण के दौरान इसके मोर्फोजेनेसिस की जांच करना है, इस प्रकार एक अन्वेषक को सी अल्बिकन्स उत्परिवर्ती पुस्तकालयों की जांच करने की अनुमति मिलती है।
इन जांचों को सुविधाजनक बनाने के लिए, एक इनविवो इमेजिंग सिस्टम विकसित किया गया था जो हमें उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप 8,9,10 का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड माउस के पिन्ना के संक्रमण के दौरान सी अल्बिकन्स कोशिकाओं की उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने की अनुमति देता है। क्योंकि पिन्ना की त्वचा काफी पतली है, इन छवियों को ऊतक विच्छेदन की आवश्यकता के बिना प्राप्त किया जा सकता है। इस प्रकार, मात्रात्मक फेनोटाइप डेटा को मेजबान ऊतक के भीतर सक्रिय संक्रमण की साइट पर मापा जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट11,12 के साथ एक संदर्भ तनाव और एक या अधिक उत्परिवर्ती उपभेदों का परिवर्तन शामिल है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन-व्यक्त उपभेदों को तब मिश्रित किया जाता है और इंट्राडर्मल रूप से सह-इंजेक्शन दिया जाता है। संक्रमण स्थापित होने के बाद, कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग फिलामेंटेशन की आवृत्ति और गठित फिलामेंट्स की लंबाई दोनों को मापने के लिए किया जाता है। उत्परिवर्ती उपभेदों से प्राप्त डेटा को संदर्भ तनाव से प्राप्त किया जाता है, जो एक ही ऊतक क्षेत्र में मौजूद होता है, इस प्रकार एक आंतरिक नियंत्रण प्रदान करता है। इस प्रणाली ने हमें सी अल्बिकन्स उत्परिवर्ती उपभेदों की कई श्रृंखलाओं को सफलतापूर्वक स्क्रीन करने की अनुमति दी है, जिनमें से कई में विट्रो 9,10 में मॉर्फोजेनेसिस दोष हैं। इनमें से कई उपभेदों में विवो में आसानी से फिलामेंट होता है, जो मोर्फोजेनेसिस की जांच के लिए विवो मॉडल के महत्व पर प्रकाश डालता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 coverslips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>20811</td>
			<td>large enough to cover the universal stage opening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 mL Insulin syringes</td>
			<td>EXELint</td>
			<td>26018</td>
			<td>Can use syringes that are 5/16&#34;&#8211;1/2&#34; long and 29&#8211;32 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.7% formaldehyde in dPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBJ5734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol/30% water</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>A05061001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.albicans reference strain and experimental strains</td>
			<td>SN250</td>
			<td>FGSC Online Catalog</td>
			<td>The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyl free mouse chow</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2920x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7050</td>
			<td>Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicator</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>76200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBA2/N (6-12 week old mice)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.&#160; The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.&#160; This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.&#160; It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.&#160; 
			Examples:&#160; 
			https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-40 
			https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174320&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-26 
			https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Must be sterile; open a new container for every experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze pad</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>P157112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel eye lurbicant</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ or FIJI analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ (FIJI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>J119005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8 (SP8)</td>
			<td>The objective lens&#160; (Leica 11506375) used here&#160; is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. 
			The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free&#160; spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. 
			The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific International</td>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair hair remover lotion</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Over the counter depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AB-101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent protein expression transformation constructs&#160; generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensitive laboratory tape</td>
			<td>Tape &#38; Label Graphic Systems Inc</td>
			<td>1007910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 cell culture medium</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>To safely hold the animals ear during injectinos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host

कैंडिडा अल्बिकन्स एक महत्वपूर्ण मानव रोगज़नक़ है। आकृति विज्ञान रूपों के बीच स्विच करने की इसकी क्षमता इसके रोगजनन के लिए केंद्रीय है; इन आकृति विज्ञान परिवर्तनों को पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के जवाब में नियंत्रित एक जटिल सिग्नलिंग नेटवर्क द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इन नियामक घटकों का अत्यधिक अध्ययन किया गया है, लेकिन लगभग सभी अध्ययन फिलामेंटेशन को ट्रिगर करने के लिए विभिन्न प्रकार के इन विट्रो उत्तेजनाओं का उपयोग करते हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि रोगजनन प्रक्रिया के दौरान मोर्फोजेनेसिस को कैसे विनियमित किया जाता है, हमने स्तनधारी मेजबान के भीतर हाइफल गठन से गुजरने वाले जीवों की उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने के लिए एक इनविवो माइक्रोस्कोपी सिस्टम विकसित किया। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सी अल्बिकन्स उत्परिवर्ती उपभेदों के छोटे संग्रह को स्क्रीन करने के लिए इस प्रणाली के उपयोग का वर्णन करता है, जिससे हमें मॉर्फोजेनेसिस के प्रमुख नियामकों की पहचान करने की अनुमति मिलती है क्योंकि यह संक्रमण की साइट पर होता है। प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किए जाते हैं, यह दर्शाते हुए कि मॉर्फोजेनेसिस के कुछ नियामक, जैसे कि ट्रांसक्रिप्शनल नियामक ईएफजी 1, में विट्रो और विवो में लगातार फेनोटाइप होते हैं, जबकि अन्य नियामकों, जैसे कि एडेनिल साइक्लेज (साइर 1) में इन विट्रो की तुलना में विवो में काफी अलग फेनोटाइप होते हैं।

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Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

यह पांडुलिपि गैर-इनवेसिव कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके स्तनधारी मेजबान में सक्रिय संक्रमण के दौरान मॉर्फोजेनेसिस फेनोटाइप के लिए मध्यम आकार के कैंडिडा अल्बिकन्स उत्परिवर्ती पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए एक विधि का वर्णन करती है।

स्तनधारी मेजबान में सक्रिय संक्रमण के दौरान कैंडिडा अल्बिकन्स उत्परिवर्ती उपभेदों में मॉर्फोजेनेसिस फेनोटाइप्स के लिए स्क्रीन करने के लिए विवो इमेजिंग में उपयोग

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

कैंडिडा अल्बिकन्स मॉर्फोजेनेसिस पर्यावरणीय संकेतों के असंख्य द्वारा ट्रिगर किया जाता है। विवो में मोर्फोजेनेसिस का अध्ययन करके, हम यह निर्धारित कर रहे हैं कि जीव इन सभी पर्यावरणीय संकेतों को कैसे एकीकृत और प्रतिक्रिया देता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह हमें पूर्वाग्रह या कलाकृतियों की अनुपस्थिति में मॉर्फोजेनेसिस का अध्ययन करने की अनुमति देता है जिसे इन विट्रो मॉडल सिस्टम का उपयोग करके पेश किया जा सकता है।बहुत कम लोगों को इंट्राडर्मल इंजेक्शन का अनुभव होता है। मैं दृढ़ता से अनुशंसा करता हूं कि इस तकनीक के लिए कोई नया व्यक्ति इसे सीखने में मदद के लिए अपने पशु संसाधन पशु चिकित्सक से संपर्क करे। प्रक्रिया का प्रदर्शन रोहन वाकाडे करेंगे, जो हमारे प्रयोगशाला समूह के एक पोस्ट-डॉक्टरेट फेलो हैं।टीकाकरण से पहले कम से कम सात दिनों के लिए क्लोरोफिल-मुक्त चाउ खिलाकर पशु को टीकाकरण के लिए तैयार करना शुरू करें। इंजेक्शन से एक दिन पहले, टूथपिक का उपयोग करके एक कॉलोनी से कनाडा अल्बिकन्स कोशिकाओं का एक डाब लें। वाईपीडी के 25 मिलीलीटर को टीका लगाएं और कई अलग-अलग कॉलोनियों से कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए इस प्रक्रिया को कई बार दोहराएं।175 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर इनक्यूबेटर में 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संस्कृति को इनक्यूबेट करें। 500 x g पर दो मिनट के लिए एक मिलीलीटर संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर खमीर को बाँझ DPBS के एक मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं। बाँझ डीपीबीएस के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें और 1 से 100 पर संस्कृति को पतला करें।हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और तदनुसार सेल घनत्व को समायोजित करें। इसके बाद, संदर्भित और प्रयोगात्मक तनाव की समान मात्रा को मिलाकर इंजेक्शन के लिए इनोकुलम बनाएं। कॉटन टिप्ड स्वैब का उपयोग करके, एक एनेस्थेटाइज्ड जानवर के दोनों कानों की आंतरिक और बाहरी सतह पर उदारतापूर्वक एक ओवर-द-काउंटर डेपिलेटरी क्रीम लागू करें।दो से तीन मिनट के बाद, धीरे से सूखी धुंध के साथ कान को पोंछें, इसके बाद बाँझ पानी में संतृप्त धुंध पैड को पूरी तरह से हटाने के लिए डिपिलेटरी क्रीम अवशेषों को अच्छी तरह से हटा दें। 70% इथेनॉल के साथ कान की सतह को स्टरलाइज़ करने के बाद, शीशी को कई बार मोड़कर या इसे भंवर करके इनोकुलम को अच्छी तरह से मिलाएं। इंसुलिन सिरिंज में इनोकुलम के 20 से 30 माइक्रोलीटर खींचें।सुई को सीधी स्थिति में रखें और सिरिंज को धीरे से टैप करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि बैरल में कोई भी हवा शीर्ष पर है। सावधानी से हवा और अतिरिक्त इनोकुलम को इनोकुलम ट्यूब या अपशिष्ट ट्यूब में वापस निकालें ताकि प्लंजर 10 माइक्रोलीटर के निशान पर हो। काउंटर डबल-साइडेड स्किन टेप पर एक छोटे शंक्वाकार या गोल-तल वाली प्लास्टिक ट्यूब पर लागू करें और एनेस्थीसिया नाक शंकु को हटाने से बचते हुए टेप के पार कान को लपेटें।सिरिंज सुई को त्वचा के लगभग समानांतर रखते हुए और किसी भी बड़ी नसों से बचने के लिए, सुई की नोक को त्वचा की सबसे बाहरी परत में डालें जब तक कि बेवेल सिर्फ कवर न हो जाए और धीरे-धीरे इनोकुलम को इंट्राडर्मल रूप से इंजेक्ट करें। एक अच्छा इंट्राडर्मल इंजेक्शन त्वचा में एक छोटा बुलबुला उठाएगा। रिसाव को कम करने के लिए सुई को कान से हटाने से पहले 15 से 20 सेकंड के लिए रखें।संस्थागत प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, पिंजरे को बायोहाजार्ड लेबल के साथ चिह्नित करें जो दर्शाता है कि पिंजरे में जानवर कैंडिडा अल्बिकन्स से संक्रमित हैं। इनोकुलम तैयार करने के लिए उपयोग की जाने वाली उसी धुली हुई संस्कृतियों का उपयोग करके, आरपीएमआई 1640 में कोशिकाओं का 1 से 50 कमजोर पड़ना बनाएं, 10% गर्मी के साथ पूरक और सक्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और चार घंटे के लिए टंबलिंग के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। माइक्रोस्कोप का उपयोग करके नमूने की जांच करें।कम से कम 100 कोशिकाओं की गणना करें, प्रत्येक तनाव के लिए खमीर और फिलामेंटस कोशिकाओं की संख्या रिकॉर्ड करें। लंबी कार्य दूरी के उद्देश्य को जगह में घुमाएं और लेंस पर विसर्जन द्रव की एक बूंद रखें। कवर स्लिप रखते समय संभावित नुकसान से बचने के लिए लेंस को कम करें।मंच खोलने के ऊपर नंबर 1.5 कवर स्लिप रखें और इसे जगह पर टेप करें। उद्देश्य को ऊपर उठाएं ताकि विसर्जन द्रव उद्देश्य लेंस और कवर स्लिप दोनों के संपर्क में हो। माइक्रोस्कोप चरण पर एक संज्ञाहरण नाक शंकु को इस तरह से सुरक्षित करें कि यह इमेजिंग के लिए स्थिति में होने पर जानवर की नाक को पूरी तरह से कवर करेगा।नाक शंकु में एक एनेस्थेटाइज्ड माउस की नाक रखें। ऑब्जेक्टिव लेंस के ऊपर कवर स्लिप पर बाँझ पानी की एक बूंद रखें। संज्ञाहरण नाक शंकु को समायोजित करें और माउस को इस तरह रखें कि माउस का कान पानी की बूंद से ऊपर हो।एक और कवर स्लिप लें और कवर स्लिप के किनारे को माउस के शरीर के समानांतर रखें, जिसमें किनारा माउस को छूता है जहां कान सिर से मिलता है। एक हिंज गति का उपयोग करके, कवर स्लिप के मुक्त किनारे को माइक्रोस्कोप चरण तक कम करें। जैसे ही कवर स्लिप माइक्रोस्कोप चरण के खिलाफ आती है, यह कान को समतल कर देगा।कान को सपाट रखने के लिए पर्याप्त दबाव रखने के लिए शीर्ष कवर स्लिप को सुरक्षित रूप से टेप करें और टेप में माउस के बाल या मूंछों को पकड़ने से बचें। जब तक एक पर्यावरणीय कक्ष के साथ माइक्रोस्कोप का उपयोग नहीं किया जाता है, तब तक एक सामान्य थर्मिक वातावरण बनाए रखने के लिए माउस के शरीर को बाँझ ड्रेप के साथ शिथिल रूप से कवर करें। सफेद प्रकाश, वाइडफील्ड इमेजिंग का उपयोग करके, फोकस प्लेन को कान के ऊतकों में समायोजित करें और रक्त वाहिकाओं में चलने वाली लाल रक्त कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें।शोर अनुपात के लिए एक मजबूत पर्याप्त संकेत प्राप्त करने के लिए ताकि आकृति विज्ञान को दृश्य के क्षेत्र में सभी कोशिकाओं के लिए निर्धारित किया जा सके, लेजर शक्ति या इमेजिंग गति को समायोजित करें। ऊतक क्षति से बचने के लिए, सबसे कम संभव लेजर शक्ति का उपयोग करें। संदर्भित तनाव में स्पष्ट फिलामेंट गठन के साथ दृश्य का एक क्षेत्र चुनें और जहां अधिकांश जीव पर्याप्त रूप से फैले हुए हैं कि उनकी आकृति विज्ञान निर्धारित किया जा सकता है।जेड-स्टैक के लिए फोकस के शीर्ष और निचले विमानों को सेट करें। संक्रमित क्षेत्र की पूरी गहराई को कवर करना आवश्यक नहीं है, लेकिन ध्यान रखें कि छवि की मात्रा के शीर्ष या नीचे के जीवों को आमतौर पर विश्लेषण से बाहर रखा जाता है। प्रत्येक तनाव को अलग करने और चैनलों को ओवरले करने के लिए जेड-स्टैक छवियों, छद्म रंग प्रत्येक चैनल का अधिग्रहण करें।छवियों को सहेजें। जेड-स्टैक के दो-आयामी छवि में अधिकतम प्रक्षेपण करने के लिए इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। तनाव प्रकार और आकृति विज्ञान द्वारा अधिकतम प्रक्षेपण छवियों में देखे गए प्रत्येक जीव की गणना करें।संदर्भित तनाव तेजी से विट्रो में फिलामेंट्स बनाता है। जबकि EFG1 Null फिलामेंट्स बनाने में विफल रहा। ईएफजी 1 नल विवो में भी एक महत्वपूर्ण फिलामेंटेशन दोष प्रदर्शित करता है।ईएफजी 1 नल कोशिकाओं का लगभग 9% विवो में फिलामेंट्स के रूप में विकसित हुआ। इसी तरह, CYR1 नल उत्परिवर्ती स्ट्रेन ने संदर्भित तनाव की तुलना में विट्रो में एक फिलामेंटेशन दोष दिखाया। इसके विपरीत, CYR1 नल उत्परिवर्ती कोशिकाओं का 53% विवो में फिलामेंट्स के रूप में विकसित हुआ।CYR1 नल उत्परिवर्ती द्वारा गठित फिलामेंट्स संदर्भित तनाव से छोटे थे। टीकाकरण के दौरान सुई को त्वचा के समानांतर रखना महत्वपूर्ण है। लक्ष्य इनोकुलम को त्वचा की बाहरी परत के नीचे रखना है।इस तकनीक का उपयोग माउस उपभेदों के साथ भी किया जा सकता है जो मेजबान कोशिकाओं में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं जिससे हमें विवो में मेजबान रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने की अनुमति मिलती है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

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ट्रांसजेनिक लीशमैनिया परजीवियों की एक लाइव होस्ट में vivo इमेजिंग में

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

ल्युकोसैट घर वापस आना और प्रवासन की गैर इनवेसिव इमेजिंग Vivo में</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

कृत्रिम थूक मध्यम का प्रयोग खिलाफ टेस्ट एंटीबायोटिक प्रभावकारिता<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; सिस्टिक फाइब्रोसिस फेफड़े अधिक प्रासंगिक शर्तों में

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

माइक्रोबियल समुदायों का अध्ययन<em&gt; Vivo</em&gt;: बीच होस्ट की मध्यस्थता बातचीत का एक मॉडल<em&gt; Candida Albicans</em&gt; और<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; एयरवेज में

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

एक सरल और कुशल दृष्टिकोण उत्परिवर्ती चेचक वायरस वैक्टर का निर्माण करने के लिए

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

में होस्ट phenotypes की परीक्षा<em&gt; Gambusia एफिनिस</em&gt; के बाद एंटीबायोटिक उपचार

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

इमेजिंग सेल सांस म्यूकोसा में संपर्क के दौरान इंफ्लूएंजा वायरस के संक्रमण का उपयोग कर दो-फोटॉन Intravital माइक्रोस्कोपी

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

स्पष्ट और इमेजिंग कैंडिडा एल्बिकान बायोफिल्म्स

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में कैंडिडा एल्बिकान हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक पूर्व वीवो परख

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

चूहों में गार्डनेरेला योनि मूत्राशय एक्सपोजर द्वारा ट्रिगर आवर्तक एस्चेरिचिया कोलाई मूत्र पथ संक्रमण

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...