Name: use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH-stipend 1R01AI33409 og Institutt for pediatri, Carver College of Medicine, University of Iowa.

<ol>
	<li>Lopes, J. P., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+virulence+of+Candida+albicans.">Pathogenesis and virulence of Candida albicans.</a> Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+control+of+cell+morphology+in+vivo+reveals+distinct+roles+for+yeast+and+filamentous+forms+of+Candida+albicans+during+infection.">Engineered control of cell morphology in vivo reveals distinct roles for yeast and filamentous forms of Candida albicans during infection.</a> Eukaryotic Cell. 2 (5), 1053-1060 (2003).</li><li>Arita, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+associated+proteins+involved+in+filamentation+with+impact+on+the+virulence+of+Candida+albicans.">Cell wall associated proteins involved in filamentation with impact on the virulence of Candida albicans.</a> Microbiological Research. 258, 126996 (2022).</li><li>Rai, L. S., Wijlick, L. V., Bougnoux, M. E., Bachellier-Bassi, S., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+commensal+and+pathogenic+life-styles+of+an+opportunistic+fungus-Candida+albicans.">Regulators of commensal and pathogenic life-styles of an opportunistic fungus-Candida albicans.</a> Yeast. 38 (4), 243-250 (2021).</li><li>Sudbery, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Candida+albicans+hyphae.">Growth of Candida albicans hyphae.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).</li><li>Basso, V., d'Enfert, C., Znaidi, S., Bachellier-Bassi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+genes+to+networks:+The+regulatory+circuitry+controlling+candida+albicans+morphogenesis.">From genes to networks: The regulatory circuitry controlling candida albicans morphogenesis.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 422, 61-99 (2019).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+Candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in Candida species.</a> Elife. 10, 64682 (2021).</li><li>Mitra, S., Dolan, K., Foster, T. H., Wellington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+morphogenesis+of+Candida+albicans+during+infection+in+a+live+animal.">Imaging morphogenesis of Candida albicans during infection in a live animal.</a> Journal of Biomedical Optics. 15 (1), 010504 (2010).</li><li>Wakade, R. S., Huang, M., Mitchell, A. P., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+Candida+albicans+identifies+differential+in+vitro+and+in+vivo+filamentation+phenotypes+for+transcription+factor+deletion+mutants.">Intravital imaging of Candida albicans identifies differential in vitro and in vivo filamentation phenotypes for transcription factor deletion mutants.</a> mSphere. 6 (3), 0043621 (2021).</li><li>Wakade, R. S., Kramara, J., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+filamentation+does+not+require+the+cAMP-PKA+pathway+in+vivo.">Candida albicans filamentation does not require the cAMP-PKA pathway in vivo.</a> mBio. 13 (3), 0085122 (2022).</li><li>Bergeron, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Pseudomonas+aeruginosa+interact+to+enhance+virulence+of+mucosal+infection+in+transparent+zebrafish.">Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa interact to enhance virulence of mucosal infection in transparent zebrafish.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 00475 (2017).</li><li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+and+filaments+have+specialized,+independent+activities+in+a+zebrafish+model+of+Candida+albicans+infection.">Yeast and filaments have specialized, independent activities in a zebrafish model of Candida albicans infection.</a> Infection and Immunity. 86 (10), 00415-00418 (2018).</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 6th edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html">https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html</a> (2020)</li><li>Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotypic+profile+of+the+Candida+albicans+regulatory+network.">A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network.</a> Plos Genetics. 5 (12), 1000783 (2009).</li><li>Cullen, P. J., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+filamentous+growth+in+yeast.">The regulation of filamentous growth in yeast.</a> Genetics. 190 (1), 23-49 (2012).</li><li>Herrero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+filament+formation+in+Candida+albicans+by+polyamine+levels.">Control of filament formation in Candida albicans by polyamine levels.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4870-4878 (1999).</li><li>Ahmad Hussin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+auxotrophy+and+biotin+enhanced+germ+tube+formation+in+Candida+albicans.">Biotin auxotrophy and biotin enhanced germ tube formation in Candida albicans.</a> Microorganisms. 4 (3), 37 (2016).</li><li>Nantel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+profiling+of+Candida+albicans+cells+undergoing+the+yeast-to-hyphal+transition.">Transcription profiling of Candida albicans cells undergoing the yeast-to-hyphal transition.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3452-3465 (2002).</li><li>Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strains+and+strategies+for+large-scale+gene+deletion+studies+of+the+diploid+human+fungal+pathogen+Candida+albicans.">Strains and strategies for large-scale gene deletion studies of the diploid human fungal pathogen Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 4 (2), 298-309 (2005).</li><li>Glazier, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EFG1,+Everyone's+favorite+gene+in+Candida+albicans:+A+comprehensive+literature+review.">EFG1, Everyone's favorite gene in Candida albicans: A comprehensive literature review.</a> Frontiers in Cellular Infection and Microbiology. 12, 855229 (2022).</li><li>Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+and+diverse+regulation+of+the+Ras/cAMP/protein+kinase+A+pathway+in+Candida+albicans.">Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Chaturvedi, A. K., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+genetically+engineered+strain+to+evaluate+the+pathogenic+potential+of+yeast+cell+and+filamentous+forms+during+Candida+albicans+systemic+infection+in+immunodeficient+mice.">Use of a genetically engineered strain to evaluate the pathogenic potential of yeast cell and filamentous forms during Candida albicans systemic infection in immunodeficient mice.</a> Infection and Immunity. 76 (1), 97-102 (2008).</li><li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth.">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryotic Cell. 10 (7), 932-944 (2011).</li><li>Brothers, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase-driven+phagocyte+recruitment+controls+Candida+albicans+filamentous+growth+and+prevents+mortality.">NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003634 (2013).</li><li>Holmes, H., Kennedy, J. C., Pottier, R., Rossi, R., Weagle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recipe+for+the+preparation+of+a+rodent+food+that+eliminates+chlorophyll-based+tissue+fluorescence.">A recipe for the preparation of a rodent food that eliminates chlorophyll-based tissue fluorescence.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B: Biology. 29 (2-3), 199 (1995).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Denne modellen benytter konfokal mikroskopi for å få bilder av C. albicans organismer når de vokser i vevet til en pattedyrvert, slik at vi kan evaluere morfogenesefenotyper under aktiv infeksjon. Prosessen med morfogenese er sentral for C. albicans patogenese og har blitt mye studert ved hjelp av en rekke in vitro analyser 2,3,4. Imidlertid kan ingen in vitro-analyse fullt ut modellere det komplekse biokjemiske og strukturelle miljøet til verten.
Protokollen beskrevet her er fokusert på bruk av dette in vivo bildebehandlingssystemet for å skjerme en serie / bibliotek av C. albicans mutanter for å identifisere gener involvert i morfogenese under infeksjon. Bruken av C. albicans-stammer som uttrykker forskjellige fluorescerende proteiner gjør at vi kan kvantifisere in vivo morfogenese av C. albicans mutantstammer sammenlignet med en referansestamme. Sammenligning av morfogenese i mutanten med referansestammen innenfor samme infeksjonsområde sikrer at organismene blir utsatt for identiske miljøer. Dette muliggjør kvantitativ måling av prosentandelen celler som gjennomgår filamentasjon, samt omfanget av filamentasjon. Normalisering av målingene av mutantstammen (e) til referansestammen (e) gjør at vi bedre kan sammenligne ytelsen til en mutant til en annen.
De representative resultatene som presenteres her viser potensialet for et signifikant avvik mellom in vitro og in vivo fenotyper. C. albicans efg1ΔΔ mutantstamme brukes ofte som en negativ kontroll for morfogeneseanalyser, da den ikke klarer å filament i nesten alle in vitro-forhold 20. Selv om in vivo-resultatene var svært lik in vitro-resultatene , dannet selv denne sterkt hemmede stammen av og til filamenter i vertsvevsmiljøet (figur 3). Dette understreker vertsmiljøets styrke i å utløse morfogenese.
I kontrast demonstrerer cyr1ΔΔ mutantstammen en betydelig uenighet mellom in vitro og in vivo vekst; Selv om ingen av mutantcellene gjennomgår filamentasjon in vitro, vokser omtrent halvparten av cellene som filamenter in vivo (figur 4)10,21. Interessant nok var disse filamentene signifikant kortere enn de som ble dannet av referansestammen, noe som tyder på at CYR1 bidrar til enten filamentveksten eller evnen til å opprettholde en filamentøs fenotype. For å lette analysen av filamentlengden ble kurvebanelengden til filamentene målt ved hjelp av en todimensjonal projeksjon av bildene. I todimensjonale projeksjoner av filamenter som vokser i tre dimensjoner, vil ethvert filament som vokser på en akse som ikke er parallell med xy-planet, projisere som kortere enn den sanne lengden. Siden denne forkortingen også forekommer for referansestammen, tillater evaluering av fordelingen av filamentlengder i en todimensjonal projeksjon fortsatt en kvantitativ sammenligning mellom referanse- og mutantstammene. Analyse av filamentlengde i to snarere enn tre dimensjoner krever mindre intensiv bildeanalyse; Dermed kan den utføres relativt raskt på en typisk stasjonær datamaskin. Ved å bruke denne enklere analysen kan man inkludere filamentlengdefordeling som en del av en screeningprotokoll, noe som gir en mer nyansert forståelse av hver mutants evne til å gjennomgå morfogenese uten å forårsake betydelige forsinkelser i gjennomstrømningen.
De representative studiene som presenteres her ble utført ved bruk av DBA2 / N-mus, som har en defekt i komplementsystemet som forårsaker manglende rekruttering av nøytrofiler til stedet for C. albicans-infeksjon 22. Målet med disse studiene var å undersøke mekanismer for regulering av C. albicans filamentasjon i vertsvevet. Derfor ble DBA2 / N-mus brukt for å unngå å forstyrre resultatene på grunn av en individuell stammes følsomhet eller motstand mot nøytrofiler. Siden nøytrofil anti-C. albicans respons kan påvirke filamentasjon23, kan nøytrofil rekruttering til infeksjonsstedet påvirke resultatene av en morfogeneseanalyse. Hvis en stamme er i stand til å filamentering in vivo , men er sterkt hemmet fra filamentasjon når nøytrofiler er tilstede, vil filamentasjon bli detektert i DBA2 / N-mus, men det er usannsynlig å bli sett ved bruk av mus med intakt nøytrofil kjemotaksis. Dermed er belastningen av musen som brukes som vert en viktig faktor når du bruker denne protokollen.
Observasjonen om at efg1ΔΔ-mutantstammen ikke klarer å filament in vivo , er usannsynlig å være relatert til vertsnøytrofile responser, fordi denne stammen heller ikke klarer å filament in vitro. Filamentasjonen observert in vivo med cyr1ΔΔ-stammen er uoverensstemmende med dens manglende filamentasjon in vitro. Data fra sebrafiskmodellen for C. albicans-infeksjon indikerer at responderende nøytrofiler er viktige for å forebygge morfogenese24. Det er derfor lite sannsynlig at bruk av DBA2/N-mus, som mangler nøytrofil respons, vil forklare økningen i filamentasjon av cyr1ΔΔ in vivo sammenlignet med in vitro. Likevel påvirker in vivo-miljøet tydelig morfogenesen til cyr1ΔΔ-stammen; Dermed kan videre undersøkelser av denne stammen gi viktig informasjon om reguleringen av C. albicans morfogenese under aktive infeksjoner. Protokollen beskrevet her er utformet som en screeninganalyse for å identifisere stammer som cyr1ΔΔ-stammen som skal brukes i fremtidige studier.
Bruken av et lavstrømnings gassbedøvelsessystem er svært nyttig for denne protokollen (figur 1A, B). Under den første utviklingen av denne protokollen ble mus bedøvet ved hjelp av en injiserbar bedøvelsescocktail av ketamin blandet med xylazin. Mens det var mulig å utføre begrenset bildebehandling med den bedøvelsesmetoden, var anestesiens varighet uforutsigbar, noe som krevde at bildebehandlingsøkter ble avsluttet raskt for å unngå at musen gjenoppretter fra anestesi under avbildning. Tradisjonelle inhalerte bedøvelsessystemer er store og krever høye strømningshastigheter av bedøvelsesgasser, noe som ofte krever at de brukes i en avtrekksvifte. Dermed ville tradisjonelle inhalerte bedøvelsessystemer være svært vanskelig å bruke med plassbegrensningene til et konfokalt mikroskop uten utilsiktet å utsette etterforskerne for bedøvelsesmidlene. Bruken av et lav-flow inhalert bedøvelsessystem tillater konsekvent anestesi av dyret samtidig som det opprettholder et trygt miljø for etterforskeren. Nosecone med lav strømning tillater enkel posisjonering av dyret for både inokulering og mikroskopi. Den lille kaliber, lavvolum leveringsslangen tillater bruk av relativt lange rør, noe som gjør at anestesimaskinen kan plasseres i tilstrekkelig avstand for ikke å forstyrre mikroskopi.
Klorofyllet som er tilstede i typisk mus chow fører til betydelig vevsautofluorescens25. Dette skaper betydelig støy i bildene, noe som gjør det vanskelig å få tak i bilder av høy kvalitet med høy romlig oppløsning. Når dyr ble matet klorofyllfri chow i 7 dager før avbildning, ble bakgrunnen fra autofluorescens betydelig redusert i vev, men klorofyll avsatt i håret fortsatte å være problematisk. Fjerning av håret på pinnae ved hjelp av en over-the-counter kjemisk hårfjerningskrem er effektiv for å minimere autofluorescens i håret (figur 1C, D). Dermed reduserte kombinasjonen av klorofyllfri chow og tilstrekkelig hårfjerning betydelig autofluorescens og forbedret bildekvaliteten dramatisk. Fordi håret fjernes fra øret før avbildning, påvirker ikke fargen på dyrets hår dette systemet. Denne protokollen har blitt brukt med hell for å studere C. albicans infeksjoner i BALB / c (hvit), C57BL / 6 (svart) og DBA2 / N (brun) mus. Protokollen kan også brukes med C57BL/6 knockoutmus som mangler ulike vertsgener; Dette vil tillate fremtidige undersøkelser av hvordan pattedyrets vertsimmunsystem påvirker filamentasjon. Et trekk ved denne modellen som ikke er diskutert i denne protokollen, er at fordi dette bildebehandlingssystemet er ikke-invasivt, kan det samme dyret avbildes gjentatte ganger over flere dager, slik at man kan følge utviklingen av individuell infeksjon over tid. Denne funksjonen vil trolig spille en nøkkelrolle i fremtidige studier på vert-patogen-interaksjonen.
Oppsummert resulterer denne protokollen i bilder med høy romlig oppløsning av C. albicans som vokser i vevet til en levende pattedyrvert, noe som muliggjør nøyaktig evaluering av morfogenese i mutantstammer 8,9,10. Resultatene som presenteres her viser hvordan denne protokollen kan brukes til å skjerme et bibliotek med C. albicans mutanter. Av C. albicans mutanter testet til dags dato, gjennomgår en stor del av mutanter med kjente defekter i morfogenese in vitro lett filamentasjon in vivo 9,10. Dette fremhever viktigheten av å inkludere et in vivo-system som dette i eksperimenter designet for å belyse mekanismene til C. albicans patogenese.

Candida albicans er et vanlig humant sopppatogen, som forårsaker mukokutan sykdom, disseminert sykdom og lokaliserte vevsinfeksjoner1. Et sentralt trekk ved C. albicans fysiologi er dens komplekse polymorfe vekst, som er knyttet til dens rolle som både en commensal og et patogen 2,3,4. Under rike næringsforhold in vitro ved 30 ° C vokser det vanligvis som en ovoid spirende gjær. En rekke miljøutløsere, inkludert næringsdeprivasjon, pH-endringer, vekst ved 37 ° C, eksponering for serum og vekst når de er innebygd i agar, resulterer i overgangen til et polarisert vekstmønster, noe som resulterer i dannelse av ekte hyfer og / eller pseudohyphae5. Initiering av polarisert vekst og den resulterende veksten av filamentøse organismer refereres til som morfogenese.
På grunn av betydningen av morfogenese i organismens virulens, har reguleringen av hyphaldannelse blitt grundig studert 6,7. Det er et komplekst nettverk av signalveier og transkripsjonsregulering som utløser morfogenese. Til tross for forholdet mellom C. albicans morfogenese og patogenese, har de fleste studier som undersøker morfogenese brukt in vitro stimuli for å utløse hyphaldannelse. Det blir stadig tydeligere at de ulike in vitro-modellene for filamentasjon ikke er identiske når det gjelder de individuelle reguleringsveiene som stimuleres. Videre samsvarer ingen in vitro vekstforhold tett med vertens komplekse miljø. Gitt betydningen av C. albicans som et humant patogen, er målet med denne protokollen å undersøke dens morfogenese under aktiv infeksjon i en pattedyrvert ved hjelp av et system med moderat gjennomstrømning, slik at en etterforsker kan skjerme C. albicans mutantbiblioteker.
For å lette disse undersøkelsene ble det utviklet et in vivo bildebehandlingssystem som lar oss oppnå bilder med høy romlig oppløsning av C. albicans-celler under infeksjon av pinna av en bedøvet mus ved hjelp av et omvendt konfokalt mikroskop 8,9,10. Fordi huden på pinna er ganske tynn, kan disse bildene oppnås uten behov for vevsdisseksjon. Dermed kan kvantitative fenotypedata måles på stedet for aktive infeksjoner i vertsvevet. Protokollen beskrevet her innebærer transformasjon av en referansestamme og en eller flere mutantstammer med forskjellige fluorescerende proteinuttrykkskassetter11,12. De fluorescerende proteinuttrykkende stammene blandes deretter og injiseres samtidig intradermalt. Etter at infeksjonen er etablert, brukes konfokal avbildning til å kvantifisere både frekvensen av filamentasjon og lengden på de dannede filamentene. Dataene oppnådd fra mutantstammene normaliseres til det som er oppnådd fra referansestammen, som er tilstede i samme vevsområde, og gir dermed en intern kontroll. Dette systemet har gjort det mulig for oss å skjerme flere serier av C. albicans mutantstammer, hvorav mange har morfogenesedefekter in vitro 9,10. Mange av disse stammene filament lett in vivo, og fremhever viktigheten av in vivo-modeller for undersøkelse av morfogenese.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 coverslips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>20811</td>
			<td>large enough to cover the universal stage opening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 mL Insulin syringes</td>
			<td>EXELint</td>
			<td>26018</td>
			<td>Can use syringes that are 5/16&#34;&#8211;1/2&#34; long and 29&#8211;32 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.7% formaldehyde in dPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBJ5734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol/30% water</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>A05061001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.albicans reference strain and experimental strains</td>
			<td>SN250</td>
			<td>FGSC Online Catalog</td>
			<td>The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyl free mouse chow</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2920x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7050</td>
			<td>Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicator</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>76200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBA2/N (6-12 week old mice)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.&#160; The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.&#160; This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.&#160; It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.&#160; 
			Examples:&#160; 
			https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-40 
			https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174320&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-26 
			https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Must be sterile; open a new container for every experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze pad</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>P157112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel eye lurbicant</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ or FIJI analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ (FIJI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>J119005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8 (SP8)</td>
			<td>The objective lens&#160; (Leica 11506375) used here&#160; is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. 
			The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free&#160; spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. 
			The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific International</td>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair hair remover lotion</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Over the counter depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AB-101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent protein expression transformation constructs&#160; generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensitive laboratory tape</td>
			<td>Tape &#38; Label Graphic Systems Inc</td>
			<td>1007910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 cell culture medium</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>To safely hold the animals ear during injectinos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host

Candida albicans er et viktig humant patogen. Dens evne til å bytte mellom morfologiske former er sentral for patogenesen; Disse morfologiske endringene reguleres av et komplekst signalnettverk kontrollert som respons på miljøstimuli. Disse regulatoriske komponentene har blitt sterkt studert, men nesten alle studier bruker en rekke in vitro stimuli for å utløse filamentasjon. For å bestemme hvordan morfogenese reguleres under patogeneseprosessen, utviklet vi et in vivo mikroskopisystem for å oppnå bilder med høy romlig oppløsning av organismer som gjennomgår hyphaldannelse i pattedyrverten. Protokollen som presenteres her beskriver bruken av dette systemet for å skjerme små samlinger av C. albicans mutantstammer, slik at vi kan identifisere viktige regulatorer av morfogenese som det skjer på infeksjonsstedet. Representative resultater presenteres, og viser at noen regulatorer av morfogenese, som transkripsjonsregulatoren Efg1, har konsistente fenotyper in vitro og in vivo, mens andre regulatorer, som adenylsyklase (Cyr1), har signifikant forskjellige fenotyper in vivo sammenlignet med in vitro.

Resultatene som presenteres her er basert på tidligere publiserte rapporter 9,10. Målet med denne analysen er å kvantitativt evaluere evnen til mutante C. albicans-stammer til å gjennomgå morfogenese under aktive infeksjoner. De typiske parametrene som skiller pseudohyfer fra hyfer kan være vanskelige å evaluere i organismer som vokser i tre dimensjoner i et komplekst in vivo-miljø. Dette gjelder spesielt når man ser på de todimensjonale tverrsnittene skapt av konfokal avbildning. Derfor er denne screeninganalysen fokusert på å identifisere organismer som vokser som filamentøse versus gjær. For oppfølgingsstudier som bruker en mer grundig analyse, inkludert tredimensjonale rekonstruksjoner, kan denne metoden tilpasses for å diskriminere gjær, hyfer og pseudohypfer.
Uttrykket av et fluorescerende protein i en referanse- eller mutantstamme av C. albicans tillater enkel påvisning av stammemorfologi in vivo (figur 3 og figur 4). Generelt utføres kvantitativ lysmikroskopianalyse best når få eller ingen av pikslene i bildet er mettede. For denne protokollen forenkler imidlertid en metning av bildet ofte analysen. Fluorescerende proteinlokalisering er ikke jevn i hele cellen og er ofte høyere i modergjæren enn i filamenter. Heldigvis, for undersøkelsen av morfogenese, definerer den romlige fordeling av signalet, i stedet for dets intensitet, utfallet. Derfor, å skaffe bilder der mange piksler er mettet, forbedrer evnen til å kvantifisere morfogenese i denne analysen.
For å illustrere viktigheten av å evaluere morfogenese in vivo presenteres representative resultater for referansestammen (SN250) og to mutanter: den ene mangler transkripsjonsfaktoren Efg1 og den andre mangler adenylylsyklase Cyr1. In vitro vokser ingen av disse stammene som filamenter20,21. Når den dyrkes in vitro i RPMI-medium supplert med 10% serum, danner referansestammen raskt filamenter, mens efg1ΔΔ- og cyr1ΔΔ-stammene ikke gjør det (figur 3 og figur 4). Under disse forholdene utviser efg1ΔΔ-mutanten noe polarisert vekst, med dattercellene litt langstrakte sammenlignet med morcellene. Dette understreker viktigheten av å bruke en klar definisjon av filamentasjon. Enhver slik definisjon er som standard vilkårlig, men det er nødvendig for konsekvent evaluering av fenotypen. For disse studiene er et filamentøst vekstmønster definert som en organisme med den lengste dimensjonen av en dattercelle mer enn dobbelt så stor som morcellen. Ved hjelp av denne definisjonen er de langstrakte efg1ΔΔ-cellene ikke filamentøse.
I samsvar med sin in vitro fenotype utviser efg1 ΔΔ en signifikant filamentasjonsdefekt in vivo: ca. 9 % av efg1ΔΔ-cellene vokste som filamenter in vivo (figur 3). Derimot vokste 53 % av cyr1ΔΔ-mutantcellene som filamenter in vivo (figur 4). Selv om antallet cyr1 ΔΔ mutantceller som gjennomgår filamentasjon in vivo var signifikant lavere enn referansestammen, representerer cyr1ΔΔ-mutantens evne til å danne filamenter in vivo en betydelig endring fra dens fullstendige mangel på morfogenese in vitro. Visuelt syntes filamentene dannet av cyr1ΔΔ-mutanten å være kortere enn referansestammen. For å evaluere dette kvantitativt ble kurvebanelengden til de filamentøse cellene målt ved hjelp av en todimensjonal projeksjon av in vivo-bildene (figur 4E). Median lengde på cyr1ΔΔ-filamenter var 29 % kortere enn filamenter av referansestammen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg"> Figur 1: Anestesi og inokulasjon . (A) Induksjon av anestesi ved bruk av et induksjonskammer. (B) Anestesi opprettholdes ved hjelp av en nesekegle, slik at musen kan flyttes etter behov. (C) Hårfjerningskrem påføres med en bomullsspisset applikator. Øyesmøregel har blitt brukt for å beskytte øynene under anestesi. (D) Effektiv hårfjerning av høyre øre. Sammenlign med det ubehandlede venstre øret. (E) Intradermal injeksjon av C. albicans i museøret. Øret holdes på plass ved hjelp av spissen av et konisk rør innpakket med dobbeltsidig hudbånd (motebånd). (F) Nærbilde av intradermal injeksjon. En blek boble dannes i huden, noe som er et tegn på en vellykket intradermal plassering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg"> Figur 2: Forberedelse for bildebehandling . (A) Mikroskopstadium klargjort for avbildning. Anestesi nesekjeglen er sikret på plass. En coverslip er teipet til scenen som dekker linseåpningen. Ytterligere stykker tape er tilgjengelig. Det oppvarmede trinnet er forvarmet til 37 °C (ikke vist). (B) Plassering av den bedøvede musen i anestesi nesekeglen. (C) Musen roteres litt slik at den siden av øret som ble inokulert, vender mot bunndekselet/objektivlinsen. Øret blir deretter flatet mot bunndekselet og festet på plass ved å plassere en annen coverslip på toppen av øret. (D) Toppdekselet teipes til scenen for å sikre øret på plass i forhold til mikroskopstadiet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg"> Figur 3: In vitro og in vivo morfologi av efg1ΔΔ mutantstammen. (A) Widefield-bilde av WT- og efg1ΔΔ-mutantstammer etter in vitro-induksjon av filamentasjon ved å dyrke celler i RPMI + 10 % serum ved 37 °C i 4 timer. Skalastenger representerer 10 μm. Bildekontrasten ble justert ved hjelp av fotoredigeringsprogramvare for å lette visningen. (B) Prosentandel av filamentasjon in vitro observert i WT og efg1ΔΔ mutantstammer. Und = kan ikke oppdages (ingen filamenter ble oppdaget). Barhøyde representerer medianprosenten av filamentøse celler fra tre uavhengige eksperimenter hvor minst 100 celler ble kvantifisert. Feilfeltene angir standardavvik (resultater sammenliknet med studentens t-test, p < 0,001). (C) Konfokal mikrografi av WT (grønn) og efg1ΔΔ mutant (rød) vokser in vivo 24 timer etter inokulering. Pilene indikerer eksempler på efg1ΔΔ mutantceller som oppfyller vår definisjon av "filamentøs". Skala bar representerer 50 μm. (D) Prosentandel av filamentasjon in vivo observert i WT og efg1ΔΔ mutantstammer. Barhøyde representerer medianprosenten av filamentøse celler fra to uavhengige eksperimenter. Feilfeltene angir standardavvik (resultater sammenliknet med studentens t-test, p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg"> Figur 4: In vitro og in vivo morfologi av cyr1 ΔΔ mutantstammen. (A) Widefield-bilde av cyr1ΔΔ mutantstammen etter in vitro induksjon av filamentasjon ved å vokse celler i RPMI + 10 % serum ved 37 °C i 4 timer. Skalalinjen representerer 10 μm. Bildekontrasten ble justert ved hjelp av fotoredigeringsprogramvare for å lette visningen. (B) Prosentandel av filamentasjon in vitro observert i WT og cyr1ΔΔ mutantstammer. Und = kan ikke oppdages (ingen filamenter ble oppdaget). Barhøyde representerer medianprosenten av filamentøse celler fra tre uavhengige eksperimenter hvor minst 100 celler ble kvantifisert. Feilfeltene angir standardavvik (resultater sammenliknet med studentens t-test, p < 0,001). (C) Konfokal mikrograf av WT (grønn) og cyr1ΔΔ mutant (rød) vokser in vivo 24 timer etter inokulasjon. Skalalinjen representerer 50 μm. (D) Prosentandel av filamentasjon in vivo observert i WT og cyr1ΔΔ mutantstammer. Barhøyde representerer medianprosenten av filamentøse celler fra to uavhengige eksperimenter. Feilfeltene angir standardavvik (resultater sammenliknet med student t-test, p < 0,001). (E) Fordeling av filamentlengde in vivo, målt ved kurvebanelengde i en todimensjonal projeksjon av z-stacken. Hver prikk representerer lengden på ett filament. Celler som vokser som gjær ble ikke inkludert i denne analysen. Bar indikerer median filamentlengde. Fordelingen av lengder er signifikant forskjellig når den analyseres ved hjelp av en Mann-Whitney U-test (p < 0, 001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Dette manuskriptet beskriver en metode for screening av moderat størrelse Candida albicans mutantbiblioteker for morfogenesefenotyper under aktiv infeksjon hos en pattedyrvert ved bruk av ikke-invasiv konfokal mikroskopi.

Bruk av in vivo imaging for å skjerme for morfogenese fenotyper i Candida albicans mutante stammer under aktiv infeksjon i en pattedyrvert

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

Candida albicans morfogenese utløses av et mylder av miljøsignaler. Ved å studere morfogenese in vivo, bestemmer vi hvordan organismen integrerer og reagerer på alle disse miljøsignalene. Den største fordelen med denne teknikken er at den lar oss studere morfogenese i fravær av bias eller gjenstander som kan introduseres ved hjelp av in vitro-modellsystemer.Svært få mennesker har erfaring med intradermale injeksjoner. Jeg anbefaler på det sterkeste at noen som er nye i denne teknikken, kontakter dyreressursveterinæren for å få hjelp til å lære den. Rohan Wakade, en postdoktor fra vår laboratoriegruppe, demonstrerer prosedyren.Begynn med å forberede dyret til inokulering ved å mate klorofyllfri chow i minst syv dager før inokulering. En dag før injeksjon, ta en dab av Canada albicans celler fra en koloni ved hjelp av en tannpirker. Inokulere 25 milliliter YPD og gjenta denne prosessen flere ganger for å oppnå celler fra flere forskjellige kolonier.Inkuber kulturen over natten ved 30 grader Celsius i en orbital shaker-inkubator ved 175 RPM. Sentrifuge en milliliter kultur i to minutter ved 500 x g, vask deretter gjæren tre ganger med en milliliter steril DPBS. Resuspend pelleten i en milliliter steril DPBS og fortynn kulturen ved 1 til 100.Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og juster dermed celletettheten. Deretter lager du inokulum til injeksjon ved å blande like store mengder av den refererte og eksperimentelle stammen. Bruk en bomullspinne, påfør en over-the-counter hårfjerningskrem liberalt på den indre og ytre overflaten av begge ørene til et bedøvelsesdyr.Etter to til tre minutter, tørk forsiktig øret med en tørr gasbind etterfulgt av gasbind pads mettet i sterilt vann for å fjerne hårfjerningskremrester grundig. Etter sterilisering av ørens overflate med 70% etanol, bland inokulumet godt ved å snu hetteglasset flere ganger eller vortexing det. Trekk 20 til 30 mikroliter inokulum i en insulinsprøyte.Hold nålen i stående stilling og bank forsiktig på sprøyten for å sikre at det er luft i sylinderen øverst. Kast forsiktig ut luft og overflødig inokulum tilbake i inokulumrøret eller et avfallsrør slik at stempelet er på 10 mikrolitermerket. Påfør over disken dobbeltsidig hudbånd på et lite konisk eller rundbunnet plastrør og draper øret over båndet, unngå å løsne anestesi nesekeglen.Hold sprøytenålen nesten parallelt med huden og unngå store årer, sett spissen av nålen inn i det ytterste laget av huden til skråningen bare er dekket og injiser inokulumet sakte intradermalt. En god intradermal injeksjon vil heve en liten boble i huden. Hold nålen på plass i 15 til 20 sekunder før du fjerner den fra øret for å minimere lekkasje.Etter institusjonelle protokoller, merk buret med biohazard etiketter som indikerer at dyr i buret er infisert med Candida albicans. Ved å bruke de samme vasket kulturer som ble brukt til å forberede inokulumet, lage en 1 til 50 fortynning av celler i RPMI 1640, supplert med 10% varme og aktivert føtalt bovint serum og inkubere ved 37 grader Celsius med tumbling i fire timer. Undersøk prøven ved hjelp av et mikroskop.Telle minst 100 celler, registrere antall gjær og filamentøse celler for hver stamme. Roter målet for lang arbeidsavstand på plass og legg en dråpe nedsenkningsvæske på linsen. Senk linsen for å unngå mulig skade når du plasserer dekselet.Plasser deksel nummer 1.5 over sceneåpningen og teip det på plass. Løft målet slik at nedsenkningsvæsken er i kontakt med både objektivlinsen og dekselet. Sikre en anestesi nesekjegle på mikroskopstadiet på en slik måte at den vil dekke dyrets nese fullt ut når den er på plass for avbildning.Plasser nesen til en bedøvet mus i nesekeglen. Plasser en dråpe sterilt vann på dekselet over objektivlinsen. Juster anestesi nesekeglen og plasser musen slik at musens øre er over vanndråpen.Ta en annen dekselslipp og plasser dekselets kant parallelt med musens kropp med kanten som berører musen der øret møter hodet. Bruk en hengselbevegelse til å senke den frie kanten av dekselet til mikroskoptrinnet. Når dekselet glir mot mikroskopstadiet, vil det flate øret.Teip toppdekselet godt for å holde akkurat nok trykk til å holde øret flatt og unngå å fange musens hår eller værhår i båndet. Med mindre et mikroskop med et miljøkammer brukes, dekk musens kropp løst med en steril drapering for å opprettholde et normalt termisk miljø. Ved hjelp av hvitt lys, widefield-bildebehandling, juster fokusplanet inn i ørevevet og fokuser på de røde blodcellene som beveger seg i blodkarene.For å oppnå et sterkt nok signal / støyforhold slik at morfologi kan bestemmes for alle celler i synsfeltet, juster lasereffekten eller bildehastigheten. For å unngå vevskader, bruk lavest mulig lasereffekt. Velg et synsfelt med tydelig filamentdannelse i den refererte stammen og hvor de fleste organismer er spredt ut nok til at deres morfologi kan bestemmes.Angi fokus øverst og nederst for en Z-stakk. Det er ikke nødvendig å dekke hele dybden av det infiserte området, men husk at organismer øverst eller nederst i bildevolumet vanligvis utelukkes fra analysen. Skaff Z-stack-bilder, pseudofarge hver kanal for å skille hver belastning og overlegg kanalene.Lagre bildene. Bruk bildebehandlingsprogramvare til å utføre en maksimal projeksjon av Z-stakken i et todimensjonalt bilde. Tell hver organisme sett i de maksimale projeksjonsbildene etter belastningstype og morfologi.Den refererte stammen danner raskt filamenter in vitro. Mens EFG1 Null ikke klarte å danne filamenter. EFG1 Null utviser også en betydelig filamentasjonsdefekt in vivo.Omtrent 9 % av EFG1 Null-celler vokste som filamenter in vivo. På samme måte viste CYR1 Null mutantstammen en filamentasjonsdefekt in vitro sammenlignet med den refererte stammen. Derimot vokste 53 % av CYR1 Null mutantcellene som filamenter in vivo.Filamentene dannet av CYR1 Null-mutanten var kortere enn den refererte stammen. Det er viktig å holde nålen parallell med huden under inokulasjon. Målet er å plassere inokulum like under det ytre laget av huden.Denne teknikken kan også brukes med musestammer som uttrykker et fluorescerende protein i vertsceller av interesse, slik at vi kan studere vertspatogeninteraksjoner in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Bruk av kunstig Oppspytt Medium til Test antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Forhold mer relevant for Cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studere mikrobielle samfunn<em&gt; I Vivo</em&gt;: En modell av Host-mediert samhandling mellom<em&gt; Candida albicans</em&gt; Og<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel og effektiv tilnærming til Konstruer Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Undersøkelse av Host fenotyper i<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Etter antibiotikabehandling

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Bildebehandling celle interaksjon i Tracheal Mucosa under influensa Virus smitte med to-fotonet Intravital mikroskopi

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Avklare og imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

En Ex vivo analyse for å studere Candida albicans bindestrek morfogenese i mage-tarmkanalen

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Tilbakevendende Escherichia coli urinveisinfeksjon utløst av Gardnerella vaginalis Blære eksponering hos mus

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...