Name: use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo NIH grant 1R01AI33409 e pelo Departamento de Pediatria, Carver College of Medicine, Universidade de Iowa.

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	<li>Lopes, J. P., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+virulence+of+Candida+albicans.">Pathogenesis and virulence of Candida albicans.</a> Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+control+of+cell+morphology+in+vivo+reveals+distinct+roles+for+yeast+and+filamentous+forms+of+Candida+albicans+during+infection.">Engineered control of cell morphology in vivo reveals distinct roles for yeast and filamentous forms of Candida albicans during infection.</a> Eukaryotic Cell. 2 (5), 1053-1060 (2003).</li><li>Arita, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+associated+proteins+involved+in+filamentation+with+impact+on+the+virulence+of+Candida+albicans.">Cell wall associated proteins involved in filamentation with impact on the virulence of Candida albicans.</a> Microbiological Research. 258, 126996 (2022).</li><li>Rai, L. S., Wijlick, L. V., Bougnoux, M. E., Bachellier-Bassi, S., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+commensal+and+pathogenic+life-styles+of+an+opportunistic+fungus-Candida+albicans.">Regulators of commensal and pathogenic life-styles of an opportunistic fungus-Candida albicans.</a> Yeast. 38 (4), 243-250 (2021).</li><li>Sudbery, P. 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C., Pottier, R., Rossi, R., Weagle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recipe+for+the+preparation+of+a+rodent+food+that+eliminates+chlorophyll-based+tissue+fluorescence.">A recipe for the preparation of a rodent food that eliminates chlorophyll-based tissue fluorescence.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B: Biology. 29 (2-3), 199 (1995).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Este modelo utiliza microscopia confocal para obter imagens de organismos de C. albicans à medida que crescem dentro do tecido de um hospedeiro mamífero, permitindo-nos avaliar fenótipos de morfogênese durante a infecção ativa. O processo de morfogênese é central para a patogênese de C. albicans e tem sido amplamente estudado utilizando uma variedade de ensaios in vitro 2,3,4. No entanto, nenhum ensaio in vitro pode modelar completamente o complexo ambiente bioquímico e estrutural do hospedeiro.
O protocolo descrito aqui está focado no uso deste sistema de imagem in vivo para rastrear uma série/biblioteca de mutantes de C. albicans para identificar os genes envolvidos na morfogênese durante a infecção. O uso de cepas de C. albicans expressando diferentes proteínas fluorescentes nos permite quantificar a morfogênese in vivo de cepas mutantes de C. albicans em comparação com a de uma cepa de referência. Comparar a morfogênese no mutante com a cepa de referência dentro da mesma área de infecção garante que os organismos sejam expostos a ambientes idênticos. Isso permite a medição quantitativa da porcentagem de células submetidas à filamentação, bem como a extensão da filamentação. A normalização das medidas da(s) estirpe(s) mutante(s) para as da estirpe de referência permite-nos comparar melhor o desempenho de uma estirpe mutante com outra.
Os resultados representativos aqui apresentados demonstram o potencial de discrepância significativa entre os fenótipos in vitro e in vivo. A cepa mutante de C. albicans efg1ΔΔ é frequentemente utilizada como controle negativo para ensaios de morfogênese, pois não consegue filamentar em quase todas as condições in vitro 20. Embora os resultados in vivo tenham sido muito semelhantes aos resultados in vitro , mesmo essa cepa severamente prejudicada ocasionalmente formou filamentos no ambiente do tecido hospedeiro (Figura 3). Isso enfatiza a força do ambiente do hospedeiro no desencadeamento da morfogênese.
Em contraste, a cepa mutante cyr1ΔΔ demonstra uma discordância substancial entre o crescimento in vitro e in vivo; embora nenhuma das células mutantes sofra filamentação in vitro, aproximadamente metade das células cresce como filamentos in vivo (Figura 4)10,21. Curiosamente, esses filamentos eram significativamente mais curtos do que os formados pela cepa de referência, sugerindo que o CYR1 contribui para a taxa de crescimento do filamento ou para a capacidade de manter um fenótipo filamentoso. Para facilitar a análise do comprimento do filamento, o comprimento do caminho da curva dos filamentos foi medido usando uma projeção bidimensional das imagens. Em projeções bidimensionais de filamentos que crescem em três dimensões, qualquer filamento que cresça em um eixo que não seja paralelo ao plano xy se projetará tão menor do que seu comprimento real. Como esse encurtamento também ocorre para a cepa de referência, avaliar a distribuição dos comprimentos dos filamentos em uma projeção bidimensional ainda permite uma comparação quantitativa entre as cepas de referência e mutantes. A análise do comprimento do filamento em duas dimensões em vez de três requer uma análise de imagem menos intensiva; assim, ele pode ser realizado de forma relativamente rápida em um computador desktop típico. O uso dessa análise mais simples permite a inclusão da distribuição do comprimento do filamento como parte de um protocolo de triagem, dando uma compreensão mais sutil da capacidade de cada mutante de sofrer morfogênese sem causar atrasos substanciais no rendimento.
Os estudos representativos aqui apresentados foram realizados utilizando camundongos DBA2/N, que apresentam um defeito em seu sistema complemento causando uma falha no recrutamento de neutrófilos para o local da infecção por C. albicans 22. O objetivo desses estudos foi investigar mecanismos de regulação da filamentação de C. albicans no interior do tecido hospedeiro. Portanto, camundongos DBA2/N foram usados para evitar confundir os resultados devido à suscetibilidade ou resistência de uma cepa individual aos neutrófilos. Como a resposta anti-C. albicans de neutrófilos pode afetar a filamentação23, o recrutamento de neutrófilos para o local da infecção pode afetar os resultados de um ensaio de morfogênese. Se uma estirpe é capaz de filamentar in vivo , mas é fortemente inibida da filamentação quando os neutrófilos estão presentes, a filamentação seria detectada em ratinhos DBA2/N, mas seria improvável que fosse vista quando se usassem ratinhos com quimiotaxia de neutrófilos intacta. Assim, a tensão do mouse usado como host é um fator importante ao usar esse protocolo.
É improvável que a observação de que a estirpe mutante efg1ΔΔ não se filamenta in vivo esteja relacionada com as respostas dos neutrófilos do hospedeiro, porque esta estirpe também não consegue filamentar in vitro. A filamentação observada in vivo com a estirpe cyr1ΔΔ é discordante com a sua falha na filamentação in vitro. Dados do modelo de peixe-zebra da infecção por C. albicans indicam que os neutrófilos respondentes são importantes na prevenção da morfogênese24. Portanto, é improvável que o uso de camundongos DBA2/N, que não possuem respostas de neutrófilos, seja responsável pelo aumento da filamentação do cyr1ΔΔ in vivo em comparação com in vitro. No entanto, o ambiente in vivo está claramente impactando a morfogênese da cepa cyr1ΔΔ; assim, uma investigação mais aprofundada dessa cepa pode fornecer informações importantes sobre a regulação da morfogênese de C. albicans durante infecções ativas. O protocolo aqui descrito é projetado como um ensaio de triagem para identificar cepas como a cepa cyr1ΔΔ a ser usada em estudos futuros.
O uso de um sistema de anestesia gasosa de baixo fluxo é muito útil para este protocolo (Figura 1A,B). Durante o desenvolvimento inicial deste protocolo, os camundongos foram anestesiados usando um coquetel anestésico injetável de cetamina misturado com xilazina. Embora tenha sido possível realizar imagens limitadas com esse método anestésico, a duração da anestesia foi imprevisível, exigindo que as sessões de imagem fossem encerradas rapidamente para evitar que o camundongo se recuperasse da anestesia durante a imagem. Os sistemas anestésicos inalados tradicionais são volumosos e exigem altas taxas de fluxo de gases anestésicos, muitas vezes exigindo que eles sejam usados dentro de um exaustor. Assim, os sistemas anestésicos inalatórios tradicionais seriam muito difíceis de usar com as restrições de espaço de um microscópio confocal sem inadvertidamente expor os investigadores aos agentes anestésicos. O uso de um sistema anestésico inalatório de baixo fluxo permite a anestesia consistente do animal, mantendo um ambiente seguro para o investigador. O cone nasal de baixo fluxo permite fácil posicionamento do animal tanto para inoculação quanto para microscopia. A tubulação de entrega de pequeno calibre e baixo volume permite o uso de tubos relativamente longos, o que permite que a máquina de anestesia seja colocada a uma distância suficiente para não interferir na microscopia.
A clorofila presente na ração típica de camundongos leva a uma autofluorescência tecidual significativa25. Isso cria um ruído substancial nas imagens, dificultando a obtenção de imagens de alta qualidade e alta resolução espacial. Quando os animais foram alimentados com ração livre de clorofila por 7 dias antes da imagem, o fundo da autofluorescência foi substancialmente diminuído no tecido, mas a clorofila depositada no cabelo continuou a ser problemática. A remoção do pelo nos pinos usando um creme depilatório químico de venda livre é eficaz para minimizar a autofluorescência no cabelo (Figura 1C,D). Assim, a combinação de ração livre de clorofila e depilação adequada diminuiu substancialmente a autofluorescência e melhorou drasticamente a qualidade da imagem. Como o pelo é removido da orelha antes da imagem, a cor do pelo do animal não afeta esse sistema. Este protocolo tem sido usado com sucesso para estudar infecções por C. albicans em camundongos BALB/c (branco), C57BL/6 (preto) e DBA2/N (marrom). O protocolo também pode ser usado com camundongos knockout C57BL/6 que são deficientes em vários genes hospedeiros; Isso permitirá futuras investigações sobre como o sistema imunológico do hospedeiro de mamíferos afeta a filamentação. Uma característica deste modelo não discutida neste protocolo é que, como este sistema de imagem não é invasivo, o mesmo animal pode ser fotografado repetidamente ao longo de vários dias, permitindo acompanhar o progresso da infecção individual ao longo do tempo. Essa característica provavelmente desempenhará um papel fundamental em estudos futuros sobre a interação hospedeiro-patógeno.
Em resumo, esse protocolo resulta em imagens de alta resolução espacial de C. albicans crescendo no tecido de um hospedeiro vivo de mamíferos, permitindo uma avaliação precisa da morfogênese em cepas mutantes 8,9,10. Os resultados aqui apresentados demonstram como esse protocolo pode ser utilizado para triagem de uma biblioteca de mutantes de C. albicans. Dos mutantes de C. albicans testados até o momento, grande parte dos mutantes com defeitos conhecidos na morfogênese in vitro prontamente submetem-se à filamentação in vivo 9,10. Isso destaca a importância de incluir um sistema in vivo como este em experimentos destinados a elucidar os mecanismos da patogênese de C. albicans.

Candida albicans é um patógeno fúngico humano comum, causando doença mucocutânea, doença disseminada e infecções teciduais localizadas1. Uma característica fundamental da fisiologia de C. albicans é o seu complexo crescimento polimórfico, que está ligado ao seu papel como comensal e patógeno 2,3,4. Sob ricas condições nutricionais in vitro a 30 °C, normalmente cresce como uma levedura de brotamento ovoide. Uma variedade de gatilhos ambientais, incluindo privação de nutrientes, alterações de pH, crescimento a 37 °C, exposição ao soro e crescimento quando incorporado em ágar, resultam na transição para um padrão de crescimento polarizado, resultando na formação de hifas verdadeiras e/ou pseudo-hifas5. O início do crescimento polarizado e o crescimento resultante de organismos filamentosos é referido como morfogênese.
Devido à importância da morfogênese na virulência do organismo, a regulação da formação de hifas tem sido extensivamente estudada 6,7. Existe uma complexa rede de vias de sinalização e regulação transcricional que desencadeia a morfogênese. Apesar da relação da morfogênese de C. albicans com a patogênese, a maioria dos estudos que investigam a morfogênese tem utilizado estímulos in vitro para desencadear a formação de hifas. Está se tornando cada vez mais claro que os vários modelos in vitro de filamentação não são idênticos em termos das vias reguladoras individuais estimuladas. Além disso, nenhuma condição de crescimento in vitro corresponde fortemente ao ambiente complexo do hospedeiro. Dada a importância de C. albicans como patógeno humano, o objetivo deste protocolo é investigar sua morfogênese durante a infecção ativa em um hospedeiro mamífero usando um sistema com rendimento moderado, permitindo assim que um investigador rastreie bibliotecas mutantes de C. albicans. 
Para facilitar essas investigações, foi desenvolvido um sistema de imagem in vivo que permite obter imagens de alta resolução espacial de células de C. albicans durante a infecção do pavilhão auricular de um camundongo anestesiado utilizando microscópio confocal invertido8,9,10. Como a pele do pavilhão auricular é bastante fina, essas imagens podem ser obtidas sem a necessidade de dissecção tecidual. Assim, os dados quantitativos do fenótipo podem ser medidos no local das infecções ativas dentro do tecido hospedeiro. O protocolo aqui descrito envolve a transformação de uma cepa de referência e uma ou mais cepas mutantes com diferentes fluorescentes de expressão proteica11,12. As cepas fluorescentes que expressam proteínas são então misturadas e co-injetadas por via intradérmica. Depois que a infecção é estabelecida, a imagem confocal é usada para quantificar a frequência de filamentação e o comprimento dos filamentos formados. Os dados obtidos das cepas mutantes são normalizados aos obtidos a partir da cepa de referência, que está presente na mesma região tecidual, proporcionando assim um controle interno. Este sistema permitiu-nos rastrear com sucesso várias séries de estirpes mutantes de C. albicans, muitas das quais apresentam defeitos de morfogénese in vitro 9,10. Muitas dessas cepas filamentam prontamente in vivo, destacando a importância de modelos in vivo para a investigação da morfogênese.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 coverslips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>20811</td>
			<td>large enough to cover the universal stage opening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 mL Insulin syringes</td>
			<td>EXELint</td>
			<td>26018</td>
			<td>Can use syringes that are 5/16&#34;&#8211;1/2&#34; long and 29&#8211;32 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.7% formaldehyde in dPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBJ5734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol/30% water</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>A05061001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.albicans reference strain and experimental strains</td>
			<td>SN250</td>
			<td>FGSC Online Catalog</td>
			<td>The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyl free mouse chow</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2920x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7050</td>
			<td>Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicator</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>76200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBA2/N (6-12 week old mice)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.&#160; The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.&#160; This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.&#160; It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.&#160; 
			Examples:&#160; 
			https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-40 
			https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174320&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-26 
			https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Must be sterile; open a new container for every experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze pad</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>P157112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel eye lurbicant</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ or FIJI analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ (FIJI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>J119005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8 (SP8)</td>
			<td>The objective lens&#160; (Leica 11506375) used here&#160; is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. 
			The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free&#160; spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. 
			The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific International</td>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair hair remover lotion</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Over the counter depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AB-101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent protein expression transformation constructs&#160; generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensitive laboratory tape</td>
			<td>Tape &#38; Label Graphic Systems Inc</td>
			<td>1007910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 cell culture medium</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>To safely hold the animals ear during injectinos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host

Candida albicans é um importante patógeno humano. Sua capacidade de alternar entre formas morfológicas é central para sua patogênese; essas alterações morfológicas são reguladas por uma complexa rede de sinalização controlada em resposta a estímulos ambientais. Esses componentes reguladores têm sido altamente estudados, mas quase todos os estudos usam uma variedade de estímulos in vitro para desencadear a filamentação. Para determinar como a morfogênese é regulada durante o processo de patogênese, desenvolvemos um sistema de microscopia in vivo para obter imagens de alta resolução espacial de organismos submetidos à formação de hifas dentro do hospedeiro mamífero. O protocolo aqui apresentado descreve o uso deste sistema para rastrear pequenas coleções de cepas mutantes de C. albicans, permitindo identificar os principais reguladores da morfogênese à medida que ocorre no local da infecção. Resultados representativos são apresentados, demonstrando que alguns reguladores da morfogênese, como o regulador transcricional Efg1, têm fenótipos consistentes in vitro e in vivo, enquanto outros reguladores, como a adenil ciclase (Cyr1), têm fenótipos in vivo significativamente diferentes em comparação com in vitro.

Os resultados aqui apresentados baseiam-se em relatos publicados anteriormente 9,10. O objetivo desta análise é avaliar quantitativamente a capacidade de cepas mutantes de C. albicans de sofrerem morfogênese durante infecções ativas. Os parâmetros típicos que distinguem pseudo-hifas de hifas podem ser difíceis de avaliar em organismos que crescem em três dimensões em um ambiente complexo in vivo. Isto é particularmente verdadeiro quando se olha para as seções transversais bidimensionais criadas por imagens confocais. Portanto, esta análise de triagem está focada na identificação de organismos que crescem como filamentosos versus leveduras. Para estudos de acompanhamento usando uma análise mais aprofundada, incluindo reconstruções tridimensionais, esse método poderia ser adaptado para discriminar leveduras, hifas e pseudo-hifas.
A expressão de uma proteína fluorescente em uma cepa de referência ou mutante de C. albicans permite a detecção direta da morfologia da cepa in vivo (Figura 3 e Figura 4). Em geral, a análise quantitativa de microscopia de luz é melhor realizada quando poucos ou nenhum dos pixels na imagem estão saturados. Para este protocolo, no entanto, uma saturação da imagem muitas vezes simplifica a análise. A localização de proteínas fluorescentes não é uniforme em toda a célula e é frequentemente maior na levedura mãe do que nos filamentos. Felizmente, para a investigação da morfogênese, a distribuição espacial do sinal, em vez de sua intensidade, define o resultado. Portanto, a obtenção de imagens em que muitos pixels estão saturados melhora a capacidade de quantificar a morfogênese neste ensaio.
Para ilustrar a importância da avaliação da morfogênese in vivo, são apresentados resultados representativos para a cepa de referência (SN250) e dois mutantes: um sem o fator de transcrição Efg1 e outro sem adenilil ciclase Cyr1. In vitro, nenhuma dessas cepas cresce como filamentos20,21. Quando cultivada in vitro em meio RPMI suplementado com 10% de soro, a cepa de referência forma rapidamente filamentos, enquanto as cepas efg1ΔΔ e cyr1ΔΔ não o fazem (Figura 3 e Figura 4). Nessas condições, o mutante efg1ΔΔ exibe um crescimento um pouco polarizado, com as células filhas sendo ligeiramente alongadas em comparação com as células-mãe. Isso enfatiza a importância de usar uma definição clara de filamentação. Qualquer definição desse tipo é, por padrão, arbitrária, mas é necessária para uma avaliação consistente do fenótipo. Para estes estudos, um padrão filamentoso de crescimento é definido como um organismo com a dimensão mais longa de uma célula filha mais do que o dobro da célula-mãe. Usando esta definição, as células efg1ΔΔ alongadas não são filamentosas.
Consistente com seu fenótipo in vitro, o efg1 ΔΔ apresenta um defeito de filamentação significativo in vivo: aproximadamente 9% das células efg1ΔΔ cresceram como filamentos in vivo (Figura 3). Em contraste, 53% das células mutantes cyr1ΔΔ cresceram como filamentos in vivo (Figura 4). Embora o número de células mutantes cyr1 ΔΔ submetidas à filamentação in vivo tenha sido significativamente menor do que a cepa de referência, a capacidade do mutante cyr1ΔΔ de formar filamentos in vivo representa uma mudança substancial em relação à sua completa falta de morfogênese in vitro. Visualmente, os filamentos formados pelo mutante cyr1ΔΔ pareciam ser mais curtos do que a cepa de referência. Para avaliar isso quantitativamente, o comprimento do trajeto da curva das células filamentosas foi medido por meio de uma projeção bidimensional das imagens in vivo (Figura 4E). O comprimento mediano dos filamentos cyr1ΔΔ foi 29% menor do que os filamentos da cepa de referência.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg"> Figura 1: Anestesia e inoculação . (A) Indução da anestesia com câmara de indução. (B) A anestesia é mantida usando um cone nasal, permitindo que o rato seja reposicionado conforme necessário. (C) O creme de depilação é aplicado usando um aplicador com ponta de algodão. Gel de lubrificação ocular foi aplicado para proteger os olhos durante a anestesia. (D) Depilação eficaz da orelha direita. Compare com a orelha esquerda não tratada. (E) Injeção intradérmica de C. albicans na orelha do rato. A orelha é mantida no lugar usando a ponta de um tubo cônico envolto com fita de pele de dupla face (fita de moda). (F) Close up da injeção intradérmica. Uma bolha pálida é formada na pele, o que é um sinal de uma colocação intradérmica bem-sucedida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg"> Figura 2: Preparação para imagem. (A) Estágio de microscópio preparado para imagem. O cone do nariz da anestesia é fixado no lugar. Uma tampa é colada no palco que cobre a abertura da lente. Peças adicionais de fita estão disponíveis. O estádio aquecido é pré-aquecido a 37 °C (não mostrado). (B) Colocação do camundongo anestesiado no cone nasal anestésico. (C) O rato é ligeiramente rodado de modo a que o lado da orelha que foi inoculado esteja virado para a tampa inferior/lente objetiva. A orelha é então achatada contra a tampa inferior e presa no lugar, colocando uma segunda tampa na parte superior da orelha. (D) A tampa superior é colada ao palco para fixar a orelha no lugar em relação ao estágio do microscópio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg"> Figura 3: Morfologia in vitro e in vivo da estirpe mutante efg1ΔΔ. (A) Imagem de campo largo de cepas mutantes WT e efg1ΔΔ após indução in vitro de filamentação por células em crescimento em RPMI + soro a 10% a 37 °C por 4 h. As barras de escala representam 10 μm. O contraste da imagem foi ajustado usando um software de edição de fotos para facilitar a visualização. (B) Percentagem de filamentação in vitro observada nas estirpes mutantes WT e efg1ΔΔ. Und = indetectável (não foram detectados filamentos). A altura da barra representa a porcentagem mediana de células filamentosas de três experimentos independentes em que pelo menos 100 células foram quantificadas. As barras de erro indicam desvio padrão (resultados comparados pelo teste t de student, p < 0,001). (C) Micrografia confocal de WT (verde) e do mutante efg1ΔΔ (vermelho) crescendo in vivo 24 h após a inoculação. As setas indicam exemplos de células mutantes efg1ΔΔ que atendem à nossa definição de "filamentosas". A barra de escala representa 50 μm. (D) Porcentagem de filamentação in vivo observada nas cepas mutantes WT e efg1ΔΔ. A altura da barra representa a porcentagem mediana de células filamentosas de dois experimentos independentes. As barras de erro indicam desvio padrão (resultados comparados pelo teste t de Student, p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg"> Figura 4: Morfologia in vitro e in vivo da estirpe mutante cyr1 ΔΔ. (A) Imagem widefield da estirpe mutante cyr1ΔΔ após indução in vitro da filamentação por células em crescimento em RPMI + soro a 10% a 37 °C durante 4 h. A barra de escala representa 10 μm. O contraste da imagem foi ajustado usando um software de edição de fotos para facilitar a visualização. (B) Percentagem de filamentação in vitro observada nas estirpes mutantes WT e cyr1ΔΔ. Und = indetectável (não foram detectados filamentos). A altura da barra representa a porcentagem mediana de células filamentosas de três experimentos independentes em que pelo menos 100 células foram quantificadas. As barras de erro indicam desvio padrão (resultados comparados pelo teste t de Student, p < 0,001). (C) Micrografia confocal de WT (verde) e do mutante cyr1ΔΔ (vermelho) crescendo in vivo 24 h após a inoculação. A barra de escala representa 50 μm. (D) Percentagem de filamentação in vivo observada nas estirpes mutantes WT e cyr1ΔΔ. A altura da barra representa a porcentagem mediana de células filamentosas de dois experimentos independentes. As barras de erro indicam desvio padrão (resultados comparados pelo teste t de Student, p < 0,001). (E) Distribuição do comprimento do filamento in vivo, medido pelo comprimento do caminho da curva numa projecção bidimensional da pilha z. Cada ponto representa o comprimento de um filamento. As células que crescem como levedura não foram incluídas nesta análise. A barra indica o comprimento médio do filamento. A distribuição dos comprimentos é significativamente diferente quando analisada pelo teste U de Mann-Whitney (p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Este manuscrito descreve um método para triagem de bibliotecas mutantes de Candida albicans de tamanho moderado para fenótipos de morfogênese durante a infecção ativa em um hospedeiro mamífero usando microscopia confocal não invasiva.

Uso de imagens in vivo para rastrear fenótipos de morfogênese em cepas mutantes de Candida albicans durante a infecção ativa em um hospedeiro mamífero

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

A morfogênese de Candida albicans é desencadeada por uma miríade de sinais ambientais. Ao estudar a morfogênese in vivo, estamos determinando como o organismo se integra e responde a todos esses sinais ambientais. A principal vantagem desta técnica é que ela nos permite estudar a morfogênese na ausência de viés ou artefatos que possam ser introduzidos usando sistemas de modelos in vitro.Muito poucas pessoas têm experiência com injeções intradérmicas. Eu recomendo fortemente que alguém novo nesta técnica entre em contato com seu veterinário de recursos animais para ajudar a aprendê-la. Demonstrando o procedimento estará Rohan Wakade, um pós-doutorando do nosso grupo de laboratório.Comece por preparar o animal para a inoculação alimentando ração sem clorofila durante pelo menos sete dias antes da inoculação. Um dia antes da injeção, tome um pouco de células albicans do Canadá de uma colônia usando um palito de dente. Inocular 25 mililitros de YPD e repita este processo várias vezes para obter células de várias colônias diferentes.Incubar a cultura durante a noite a 30 graus Celsius em uma incubadora de agitadores orbitais a 175 RPM. Centrifugar um mililitro de cultura por dois minutos a 500 x g, depois lavar a levedura três vezes com um mililitro de DPBS estéril. Ressuscite o pellet em um mililitro de DPBS estéril e dilua a cultura em 1 a 100.Conte as células usando um hemocitômetro e, consequentemente, ajuste a densidade celular. Em seguida, crie o inóculo para injeção misturando volumes iguais da cepa referenciada e experimental. Usando um cotonete com ponta de algodão, aplique um creme depilatório sem receita médica liberalmente na superfície interna e externa de ambas as orelhas de um animal anestesiado.Após dois a três minutos, limpe suavemente a orelha com uma gaze seca seguida de compressas saturadas em água estéril para remover completamente o resíduo de creme depilatório. Depois de esterilizar a superfície das orelhas com etanol a 70%, misture bem o inóculo invertendo o frasco para injetáveis várias vezes ou vortexando-o. Desenhe 20 a 30 microlitros de inóculo numa seringa de insulina.Segure a agulha na posição vertical e toque suavemente na seringa para garantir que qualquer ar no cano esteja no topo. Ejete cuidadosamente o ar e o excesso de inóculo de volta para o tubo de inóculo ou um tubo de resíduos para que o êmbolo esteja na marca de 10 microlitros. Aplique sobre o balcão fita de pele de dupla face em um pequeno tubo de plástico cônico ou de fundo redondo e passe a orelha através da fita, evitando desalojar o cone do nariz da anestesia.Mantendo a agulha da seringa quase paralela à pele e evitando grandes veias, insira a ponta da agulha na camada mais externa da pele até que o bisel esteja apenas coberto e injete lentamente o inóculo por via intradérmica. Uma boa injeção intradérmica levantará uma pequena bolha na pele. Mantenha a agulha no lugar por 15 a 20 segundos antes de removê-la da orelha para minimizar o vazamento.Seguindo os protocolos institucionais, marque a gaiola com rótulos de risco biológico indicando que os animais na gaiola estão infectados com Candida albicans. Usando as mesmas culturas lavadas que foram usadas para preparar o inóculo, criar uma diluição de 1 a 50 células em RPMI 1640, suplementado com 10% de calor e soro fetal bovino ativado e incubar a 37 graus Celsius com tombo por quatro horas. Examine a amostra usando um microscópio.Conte pelo menos 100 células, registrando o número de leveduras e células filamentosas para cada cepa. Gire a objetiva de longa distância de trabalho no lugar e coloque uma gota de fluido de imersão na lente. Abaixe a lente para evitar possíveis danos ao colocar a tampa.Coloque a tampa número 1.5 deslize sobre a abertura do palco e cole-a no lugar. Levante a objetiva para que o fluido de imersão esteja em contato com a lente objetiva e com a tampa. Prenda um cone de anestesia no estágio do microscópio de tal forma que cubra totalmente o nariz do animal quando estiver em posição para imagem.Coloque o nariz de um rato anestesiado no cone do nariz. Coloque uma gota de água estéril na tampa deslize acima da lente objetiva. Ajuste o cone do nariz de anestesia e posicione o mouse de tal forma que a orelha do rato esteja acima da gota de água.Pegue outro deslize de cobertura e coloque a borda da tampa paralela ao corpo do mouse com a borda tocando o mouse onde a orelha encontra a cabeça. Usando um movimento de dobradiça, abaixe a borda livre da tampa deslize para o estágio do microscópio. À medida que o deslizamento da tampa vem contra o estágio do microscópio, ele achatará a orelha.Cole a tampa superior deslize com segurança para manter a pressão suficiente para manter a orelha plana e evitar pegar o cabelo ou os bigodes do mouse na fita. A menos que um microscópio com uma câmara ambiental seja usado, cubra frouxamente o corpo do mouse com uma cortina estéril para manter um ambiente térmico normal. Usando luz branca, imagens de campo amplo, ajuste o plano de foco no tecido do ouvido e concentre-se nos glóbulos vermelhos que se movem nos vasos sanguíneos.Para obter uma relação sinal/ruído forte o suficiente para que a morfologia possa ser determinada para todas as células no campo de visão, ajuste a potência do laser ou a velocidade de imagem. Para evitar danos nos tecidos, use a menor potência de laser possível. Escolha um campo de visão com formação clara de filamentos na cepa referenciada e onde a maioria dos organismos esteja espalhada o suficiente para que sua morfologia possa ser determinada.Defina os planos superior e inferior de foco para uma pilha Z. Cobrir toda a profundidade da área infectada não é necessário, mas tenha em mente que os organismos na parte superior ou inferior do volume fotografado são tipicamente excluídos da análise. Adquira imagens Z-stack, pseudocolora cada canal para distinguir cada cepa e sobrepor os canais.Salve as imagens. Use um software de imagem para realizar uma projeção máxima da pilha Z em uma imagem bidimensional. Conte cada organismo visto nas imagens de projeção máxima por tipo de deformação e morfologia.A estirpe referenciada forma rapidamente filamentos in vitro. Considerando que o EFG1 Nulo não conseguiu formar os filamentos. O EFG1 Null também apresenta um defeito de filamentação significativo in vivo.Aproximadamente 9% das células EFG1 Nulas cresceram como filamentos in vivo. Da mesma forma, a cepa mutante nula CYR1 apresentou um defeito de filamentação in vitro em comparação com a cepa referenciada. Em contraste, 53% das células mutantes nulas CYR1 cresceram como filamentos in vivo.Os filamentos formados pelo mutante Nulo CYR1 foram mais curtos que a cepa referenciada. É fundamental manter a agulha paralela à pele durante a inoculação. O objetivo é colocar o inóculo logo abaixo da camada externa da pele.Esta técnica também pode ser usada com cepas de camundongos que expressam uma proteína fluorescente em células hospedeiras de interesse, permitindo-nos estudar as interações do patógeno hospedeiro in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo de imagens de parasitas Leishmania transgênicas em um host ao vivo

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Imunologia e Infecção

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

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Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Uma abordagem simples e eficiente para construir vectores de vírus mutante Vaccinia

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Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

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Exame de fenótipos de acolhimento em<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Após o tratamento antibiótico

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Interação de célula de imagem latente na Mucosa traqueal durante a infecção de vírus de Influenza usando microscopia Intravital dois fotões

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

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Esclarecendo e Imagem Candida albicans Biofilmes

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

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Um ensaio ex vivo para estudar candida albicans Hórgênese Háfal no Trato Gastrointestinal

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

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Infecção recorrente do trato urinário de Escherichia coli desencadeada por gardnerella vaginalis exposição bexiga em camundongos

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...