Name: use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом NIH 1R01AI33409 и кафедрой педиатрии Медицинского колледжа Карвера Университета Айовы.

<ol>
	<li>Lopes, J. P., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+virulence+of+Candida+albicans.">Pathogenesis and virulence of Candida albicans.</a> Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+control+of+cell+morphology+in+vivo+reveals+distinct+roles+for+yeast+and+filamentous+forms+of+Candida+albicans+during+infection.">Engineered control of cell morphology in vivo reveals distinct roles for yeast and filamentous forms of Candida albicans during infection.</a> Eukaryotic Cell. 2 (5), 1053-1060 (2003).</li><li>Arita, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+associated+proteins+involved+in+filamentation+with+impact+on+the+virulence+of+Candida+albicans.">Cell wall associated proteins involved in filamentation with impact on the virulence of Candida albicans.</a> Microbiological Research. 258, 126996 (2022).</li><li>Rai, L. S., Wijlick, L. V., Bougnoux, M. E., Bachellier-Bassi, S., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+commensal+and+pathogenic+life-styles+of+an+opportunistic+fungus-Candida+albicans.">Regulators of commensal and pathogenic life-styles of an opportunistic fungus-Candida albicans.</a> Yeast. 38 (4), 243-250 (2021).</li><li>Sudbery, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Candida+albicans+hyphae.">Growth of Candida albicans hyphae.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).</li><li>Basso, V., d'Enfert, C., Znaidi, S., Bachellier-Bassi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+genes+to+networks:+The+regulatory+circuitry+controlling+candida+albicans+morphogenesis.">From genes to networks: The regulatory circuitry controlling candida albicans morphogenesis.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 422, 61-99 (2019).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+Candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in Candida species.</a> Elife. 10, 64682 (2021).</li><li>Mitra, S., Dolan, K., Foster, T. H., Wellington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+morphogenesis+of+Candida+albicans+during+infection+in+a+live+animal.">Imaging morphogenesis of Candida albicans during infection in a live animal.</a> Journal of Biomedical Optics. 15 (1), 010504 (2010).</li><li>Wakade, R. S., Huang, M., Mitchell, A. P., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+Candida+albicans+identifies+differential+in+vitro+and+in+vivo+filamentation+phenotypes+for+transcription+factor+deletion+mutants.">Intravital imaging of Candida albicans identifies differential in vitro and in vivo filamentation phenotypes for transcription factor deletion mutants.</a> mSphere. 6 (3), 0043621 (2021).</li><li>Wakade, R. S., Kramara, J., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+filamentation+does+not+require+the+cAMP-PKA+pathway+in+vivo.">Candida albicans filamentation does not require the cAMP-PKA pathway in vivo.</a> mBio. 13 (3), 0085122 (2022).</li><li>Bergeron, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Pseudomonas+aeruginosa+interact+to+enhance+virulence+of+mucosal+infection+in+transparent+zebrafish.">Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa interact to enhance virulence of mucosal infection in transparent zebrafish.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 00475 (2017).</li><li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+and+filaments+have+specialized,+independent+activities+in+a+zebrafish+model+of+Candida+albicans+infection.">Yeast and filaments have specialized, independent activities in a zebrafish model of Candida albicans infection.</a> Infection and Immunity. 86 (10), 00415-00418 (2018).</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 6th edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html">https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html</a> (2020)</li><li>Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotypic+profile+of+the+Candida+albicans+regulatory+network.">A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network.</a> Plos Genetics. 5 (12), 1000783 (2009).</li><li>Cullen, P. J., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+filamentous+growth+in+yeast.">The regulation of filamentous growth in yeast.</a> Genetics. 190 (1), 23-49 (2012).</li><li>Herrero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+filament+formation+in+Candida+albicans+by+polyamine+levels.">Control of filament formation in Candida albicans by polyamine levels.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4870-4878 (1999).</li><li>Ahmad Hussin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+auxotrophy+and+biotin+enhanced+germ+tube+formation+in+Candida+albicans.">Biotin auxotrophy and biotin enhanced germ tube formation in Candida albicans.</a> Microorganisms. 4 (3), 37 (2016).</li><li>Nantel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+profiling+of+Candida+albicans+cells+undergoing+the+yeast-to-hyphal+transition.">Transcription profiling of Candida albicans cells undergoing the yeast-to-hyphal transition.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3452-3465 (2002).</li><li>Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strains+and+strategies+for+large-scale+gene+deletion+studies+of+the+diploid+human+fungal+pathogen+Candida+albicans.">Strains and strategies for large-scale gene deletion studies of the diploid human fungal pathogen Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 4 (2), 298-309 (2005).</li><li>Glazier, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EFG1,+Everyone's+favorite+gene+in+Candida+albicans:+A+comprehensive+literature+review.">EFG1, Everyone's favorite gene in Candida albicans: A comprehensive literature review.</a> Frontiers in Cellular Infection and Microbiology. 12, 855229 (2022).</li><li>Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+and+diverse+regulation+of+the+Ras/cAMP/protein+kinase+A+pathway+in+Candida+albicans.">Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Chaturvedi, A. K., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+genetically+engineered+strain+to+evaluate+the+pathogenic+potential+of+yeast+cell+and+filamentous+forms+during+Candida+albicans+systemic+infection+in+immunodeficient+mice.">Use of a genetically engineered strain to evaluate the pathogenic potential of yeast cell and filamentous forms during Candida albicans systemic infection in immunodeficient mice.</a> Infection and Immunity. 76 (1), 97-102 (2008).</li><li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth.">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryotic Cell. 10 (7), 932-944 (2011).</li><li>Brothers, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase-driven+phagocyte+recruitment+controls+Candida+albicans+filamentous+growth+and+prevents+mortality.">NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003634 (2013).</li><li>Holmes, H., Kennedy, J. C., Pottier, R., Rossi, R., Weagle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recipe+for+the+preparation+of+a+rodent+food+that+eliminates+chlorophyll-based+tissue+fluorescence.">A recipe for the preparation of a rodent food that eliminates chlorophyll-based tissue fluorescence.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B: Biology. 29 (2-3), 199 (1995).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Эта модель использует конфокальную микроскопию для получения изображений организмов C. albicans, когда они растут в ткани хозяина млекопитающего, что позволяет нам оценивать фенотипы морфогенеза во время активной инфекции. Процесс морфогенеза занимает центральное место в патогенезе C. albicans и широко изучен с использованием различных анализов in vitro 2,3,4. Однако ни один анализ in vitro не может полностью смоделировать сложную биохимическую и структурную среду хозяина.
Протокол, описанный здесь, ориентирован на использование этой системы визуализации in vivo для скрининга серии / библиотеки мутантов C. albicans для идентификации генов, участвующих в морфогенезе во время инфекции. Использование штаммов C. albicans , экспрессирующих различные флуоресцентные белки, позволяет количественно оценить морфогенез in vivo мутантных штаммов C. albicans по сравнению с морфогенезом эталонного штамма. Сравнение морфогенеза у мутанта с эталонным штаммом в пределах одной и той же области инфекции гарантирует, что организмы подвергаются воздействию идентичных сред. Это позволяет количественно измерить процент клеток, подвергающихся филаментации, а также степень нити. Нормализация измерений мутантного штамма (штаммов) к измерениям эталонного штамма позволяет нам лучше сравнивать производительность одного мутанта с другим.
Репрезентативные результаты, представленные здесь, демонстрируют возможность значительного расхождения между фенотипами in vitro и in vivo . Мутантный штамм C. albicans efg1ΔΔ часто используется в качестве отрицательного контроля для анализов морфогенеза, поскольку он не может нитить почти во всех условиях in vitro 20. Хотя результаты in vivo были очень похожи на результаты in vitro , даже этот сильно затрудненный штамм иногда образовывал нити в среде тканей хозяина (рисунок 3). Это подчеркивает силу среды хозяина в запуске морфогенеза.
Напротив, мутантный штамм cyr1ΔΔ демонстрирует существенное несоответствие между ростом in vitro и in vivo; хотя ни одна из мутантных клеток не подвергается филаментации in vitro, примерно половина клеток растет как нити in vivo (рисунок 4)10,21. Интересно, что эти нити были значительно короче, чем те, которые образовывались эталонным штаммом, предполагая, что CYR1 способствует либо скорости роста нити, либо способности поддерживать фенотип нити. Чтобы облегчить анализ длины нити накала, длину кривого пути нитей измеряли с помощью двумерной проекции изображений. В двумерных проекциях нитей, растущих в трех измерениях, любая нить, растущая на оси, которая не параллельна плоскости xy, будет проецироваться как более короткая, чем ее истинная длина. Поскольку этот ракурс также происходит для эталонного штамма, оценка распределения длин нитей в двумерной проекции по-прежнему позволяет количественно сравнивать эталонные и мутантные штаммы. Анализ длины нити накала в двух, а не трех измерениях требует менее интенсивного анализа изображений; таким образом, он может быть выполнен относительно быстро на типичном настольном компьютере. Использование этого более простого анализа позволяет включить распределение длины нити в протокол скрининга, давая более тонкое понимание способности каждого мутанта подвергаться морфогенезу, не вызывая существенных задержек в пропускной способности.
Представленные здесь репрезентативные исследования проводились с использованием мышей DBA2/N, у которых дефект в системе комплемента, вызывающий неспособность рекрутировать нейтрофилы к месту инфекции C. albicans 22. Целью этих исследований было изучение механизмов регуляции нитей C. albicans в ткани хозяина. Поэтому мышей DBA2/N использовали, чтобы избежать путаницы в результатах из-за восприимчивости или устойчивости отдельного штамма к нейтрофилам. Поскольку реакция нейтрофилов против C. albicans может влиять на филаментацию23, рекрутирование нейтрофилов в место инфекции может повлиять на результаты анализа морфогенеза. Если штамм способен к филаментации in vivo , но сильно ингибируется от филаментации при наличии нейтрофилов, нить будет обнаружена у мышей DBA2 / N, но вряд ли будет замечена при использовании мышей с интактным хемотаксисом нейтрофилов. Таким образом, деформация мыши, используемой в качестве хоста, является важным фактором при использовании этого протокола.
Наблюдение о том, что мутантный штамм efg1ΔΔ не имеет нити in vivo, вряд ли связано с реакциями нейтрофилов хозяина, поскольку этот штамм также не может быть нитью in vitro. Филаментация, наблюдаемая in vivo со штаммом cyr1ΔΔ, диссонирует с его неспособностью к филаментации in vitro. Данные модели рыбок данио инфекции C. albicans указывают на то, что ответные нейтрофилы важны для профилактики морфогенеза24. Поэтому использование мышей DBA2/N, у которых отсутствуют нейтрофильные реакции, вряд ли объясняет увеличение филаментации cyr1ΔΔ in vivo по сравнению с in vitro. Тем не менее, среда in vivo явно влияет на морфогенез штамма cyr1ΔΔ; таким образом, дальнейшее исследование этого штамма может дать важную информацию о регуляции морфогенеза C. albicans во время активных инфекций. Протокол, описанный здесь, разработан как скрининговый анализ для идентификации штаммов, таких как штамм cyr1ΔΔ, который будет использоваться в будущих исследованиях.
Использование системы газовой анестезии с низким потоком очень полезно для этого протокола (рисунок 1A, B). Во время первоначальной разработки этого протокола мышей анестезировали с использованием инъекционного анестетик-коктейля кетамина, смешанного с ксилазином. Хотя можно было выполнить ограниченную визуализацию с помощью этого анестезирующего метода, продолжительность анестезии была непредсказуемой, требуя быстрого завершения сеансов визуализации, чтобы избежать восстановления мыши после анестезии во время визуализации. Традиционные ингаляционные анестетики громоздки и требуют высоких скоростей потока анестезирующих газов, часто требуя их использования в вытяжном шкафу. Таким образом, традиционные ингаляционные анестетики было бы очень трудно использовать с ограничениями пространства конфокального микроскопа без непреднамеренного воздействия на исследователей анестезирующих агентов. Использование низкопоточной ингаляционной анестезиологической системы позволяет проводить последовательную анестезию животного при сохранении безопасной среды для исследователя. Низкопоточный носовой конус позволяет легко позиционировать животное как для инокуляции, так и для микроскопии. Малокалиберные, малообъемные загрузочные трубки позволяют использовать относительно длинные трубки, что позволяет размещать анестезиологический аппарат на достаточном расстоянии, чтобы не мешать микроскопии.
Хлорофилл, присутствующий в типичном мышином чау, приводит к значительной аутофлуоресценциитканей 25. Это создает значительный шум на изображениях, что затрудняет получение высококачественных изображений с высоким пространственным разрешением. Когда животных кормили чау-чау без хлорофилла в течение 7 дней до визуализации, фон от аутофлуоресценции был существенно уменьшен в ткани, но хлорофилл, отложенный в волосах, продолжал оставаться проблематичным. Удаление волос на ушных раковинах с помощью безрецептурного химического крема для депиляции эффективно для минимизации автофлуоресценции в волосах (рисунок 1C, D). Таким образом, сочетание чау-чау без хлорофилла и адекватного удаления волос существенно снизило автофлуоресценцию и значительно улучшило качество изображения. Поскольку шерсть удаляется из уха до визуализации, цвет шерсти животного не влияет на эту систему. Этот протокол был успешно использован для изучения инфекций C. albicans у мышей BALB / c (белый), C57BL / 6 (черный) и DBA2 / N (коричневый). Протокол также может быть использован с нокаутирующими мышами C57BL/6, у которых дефицит различных генов-хозяев; это позволит в будущем исследовать, как иммунная система хозяина млекопитающих влияет на нить. Одной из особенностей этой модели, не обсуждаемой в этом протоколе, является то, что, поскольку эта система визуализации является неинвазивной, одно и то же животное может быть изображено многократно в течение нескольких дней, что позволяет следить за прогрессом индивидуальной инфекции с течением времени. Эта особенность, вероятно, будет играть ключевую роль в будущих исследованиях взаимодействия хозяина и патогена.
Таким образом, этот протокол приводит к получению изображений C. albicans с высоким пространственным разрешением, растущих в ткани живого млекопитающего-хозяина, что позволяет точно оценить морфогенез у мутантных штаммов 8,9,10. Результаты, представленные здесь, демонстрируют, как этот протокол может быть использован для проверки библиотеки мутантов C. albicans. Из протестированных на сегодняшний день мутантов C. albicans большая часть мутантов с известными дефектами морфогенеза in vitro легко подвергается филаментации in vivo 9,10. Это подчеркивает важность включения системы in vivo, подобной этой, в эксперименты, предназначенные для выяснения механизмов патогенеза C. albicans.

Candida albicans является распространенным грибковым патогеном человека, вызывающим заболевания слизистой оболочки, диссеминированное заболевание и локализованные тканевые инфекции1. Ключевой особенностью физиологии C. albicans является ее сложный полиморфный рост, который связан с его ролью как комменсала и патогена 2,3,4. В богатых питательных условиях in vitro при 30 ° C он обычно растет как яйцевидные почковые дрожжи. Различные триггеры окружающей среды, включая лишение питательных веществ, изменения рН, рост при 37 ° C, воздействие сыворотки и рост при внедрении в агар, приводят к переходу к поляризованной картине роста, что приводит к образованию истинных гиф и / или псевдогиф5. Начало поляризованного роста и результирующий рост нитевидных организмов называют морфогенезом.
Из-за важности морфогенеза в вирулентности организма регуляция гифального образования была широко изучена 6,7. Существует сложная сеть сигнальных путей и транскрипционной регуляции, которая вызывает морфогенез. Несмотря на связь морфогенеза C. albicans с патогенезом, большинство исследований, изучающих морфогенез, использовали стимулы in vitro для запуска гифального образования. Становится все более очевидным, что различные модели нити in vitro не идентичны с точки зрения отдельных стимулируемых регуляторных путей. Кроме того, никакие условия роста in vitro не соответствуют сложной среде хозяина. Учитывая важность C. albicans как патогена человека, целью этого протокола является исследование его морфогенеза во время активной инфекции у хозяина млекопитающих с использованием системы с умеренной пропускной способностью, что позволяет исследователю проверять мутантные библиотеки C. albicans.
Для облегчения этих исследований была разработана система визуализации in vivo, позволяющая получать изображения клеток C. albicans с высоким пространственным разрешением при инфицировании ушной раковины анестезированной мыши с помощью перевернутого конфокального микроскопа 8,9,10. Поскольку кожа ушной раковины довольно тонкая, эти изображения можно получить без необходимости рассечения тканей. Таким образом, количественные данные фенотипа могут быть измерены в месте активных инфекций в ткани хозяина. Протокол, описанный здесь, включает трансформацию эталонного штамма и одного или нескольких мутантных штаммов с различными флуоресцентными кассетами экспрессии белка11,12. Флуоресцентные штаммы, экспрессирующие белок, затем смешивают и совместно вводят внутрикожно. После того, как инфекция установлена, конфокальная визуализация используется для количественной оценки как частоты филаментации, так и длины сформированных нитей. Данные, полученные от мутантных штаммов, нормализуются до данных, полученных от эталонного штамма, который присутствует в той же области ткани, обеспечивая тем самым внутренний контроль. Эта система позволила нам успешно отсеять несколько серий мутантных штаммов C. albicans, многие из которых имеют дефекты морфогенеза in vitro 9,10. Многие из этих штаммов легко нити in vivo, подчеркивая важность моделей in vivo для исследования морфогенеза.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 coverslips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>20811</td>
			<td>large enough to cover the universal stage opening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 mL Insulin syringes</td>
			<td>EXELint</td>
			<td>26018</td>
			<td>Can use syringes that are 5/16&#34;&#8211;1/2&#34; long and 29&#8211;32 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.7% formaldehyde in dPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBJ5734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol/30% water</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>A05061001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.albicans reference strain and experimental strains</td>
			<td>SN250</td>
			<td>FGSC Online Catalog</td>
			<td>The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyl free mouse chow</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2920x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7050</td>
			<td>Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicator</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>76200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBA2/N (6-12 week old mice)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.&#160; The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.&#160; This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.&#160; It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.&#160; 
			Examples:&#160; 
			https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-40 
			https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174320&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-26 
			https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Must be sterile; open a new container for every experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze pad</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>P157112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel eye lurbicant</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ or FIJI analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ (FIJI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>J119005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8 (SP8)</td>
			<td>The objective lens&#160; (Leica 11506375) used here&#160; is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. 
			The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free&#160; spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. 
			The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific International</td>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair hair remover lotion</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Over the counter depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AB-101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent protein expression transformation constructs&#160; generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensitive laboratory tape</td>
			<td>Tape &#38; Label Graphic Systems Inc</td>
			<td>1007910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 cell culture medium</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>To safely hold the animals ear during injectinos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host

Candida albicans является важным патогеном человека. Его способность переключаться между морфологическими формами занимает центральное место в его патогенезе; эти морфологические изменения регулируются сложной сигнальной сетью, контролируемой в ответ на раздражители окружающей среды. Эти регуляторные компоненты были хорошо изучены, но почти во всех исследованиях используются различные стимулы in vitro для запуска филаментации. Чтобы определить, как регулируется морфогенез в процессе патогенеза, мы разработали систему микроскопии in vivo для получения изображений с высоким пространственным разрешением организмов, подвергающихся гифальному образованию внутри хозяина млекопитающих. Протокол, представленный здесь, описывает использование этой системы для скрининга небольших коллекций мутантных штаммов C. albicans , что позволяет нам идентифицировать ключевые регуляторы морфогенеза по мере его возникновения в месте инфекции. Представлены репрезентативные результаты, демонстрирующие, что некоторые регуляторы морфогенеза, такие как транскрипционный регулятор Efg1, имеют последовательные фенотипы in vitro и in vivo, тогда как другие регуляторы, такие как аденилциклаза (Cyr1), имеют значительно отличающиеся фенотипы in vivo по сравнению с in vitro.

Представленные здесь результаты основаны на ранее опубликованных отчетах 9,10. Целью данного анализа является количественная оценка способности мутантных штаммов C. albicans подвергаться морфогенезу при активных инфекциях. Типичные параметры, которые отличают псевдогифы от гиф, могут быть трудно оценить у организмов, растущих в трех измерениях в сложной среде in vivo. Это особенно верно при рассмотрении двумерных поперечных сечений, созданных конфокальной визуализацией. Поэтому этот скрининговый анализ сосредоточен на выявлении организмов, растущих как нитевидные по сравнению с дрожжами. Для последующих исследований с использованием более глубокого анализа, включая трехмерные реконструкции, этот метод может быть адаптирован для распознавания дрожжей, гиф и псевдогифов.
Экспрессия флуоресцентного белка в эталонном или мутантном штамме C. albicans позволяет легко обнаружить морфологию штамма in vivo (рисунок 3 и рисунок 4). В целом, количественный анализ световой микроскопии лучше всего выполняется, когда мало или ни один из пикселей на изображении насыщен. Для этого протокола, однако, насыщенность изображения часто упрощает анализ. Флуоресцентная локализация белка не является равномерной по всей клетке и часто выше в материнских дрожжах, чем в нитях. К счастью, для исследования морфогенеза пространственное распределение сигнала, а не его интенсивность, определяет результат. Таким образом, получение изображений, в которых многие пиксели насыщены, улучшает способность количественно оценивать морфогенез в этом анализе.
Чтобы проиллюстрировать важность оценки морфогенеза in vivo, представлены репрезентативные результаты для эталонного штамма (SN250) и двух мутантов: у одного отсутствует транскрипционный фактор Efg1, а у другого отсутствует аденилциклаза Cyr1. In vitro ни один из этих штаммов не растет какнити 20,21. При выращивании in vitro в среде RPMI, дополненной 10% сывороткой, эталонный штамм быстро образует нити, тогда как штаммы efg1ΔΔ и cyr1ΔΔ этого не делают (Фиг.3 и Фиг.4). В этих условиях мутант efg1ΔΔ демонстрирует несколько поляризованный рост, причем дочерние клетки слегка удлинены по сравнению с материнскими клетками. Это подчеркивает важность использования четкого определения нити накала. Любое такое определение по умолчанию произвольно, но оно необходимо для последовательной оценки фенотипа. Для этих исследований нитевидная картина роста определяется как организм с самым длинным размером дочерней клетки, более чем в два раза превышающей размер материнской клетки. Используя это определение, удлиненные ячейки efg1ΔΔ не являются нитевидными.
В соответствии со своим фенотипом in vitro , efg1ΔΔ демонстрирует значительный дефект филаментации in vivo: примерно 9% клеток efg1ΔΔ выросли в виде нитей in vivo (рисунок 3). Напротив, 53% мутантных клеток cyr1ΔΔ росли как нити in vivo (рисунок 4). Хотя число мутантных клеток cyr1ΔΔ, подвергающихся филаментации in vivo , было значительно ниже, чем у эталонного штамма, способность мутанта cyr1ΔΔ образовывать нити in vivo представляет собой существенное изменение по сравнению с полным отсутствием морфогенеза in vitro. Визуально нити, образованные мутантом cyr1ΔΔ, оказались короче эталонного штамма. Чтобы оценить это количественно, длину кривого пути нитевидных ячеек измеряли с использованием двумерной проекции изображений in vivo (рисунок 4E). Средняя длина ниточек cyr1ΔΔ была на 29% короче нитей эталонного штамма.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg"> Рисунок 1: Анестезия и инокуляция. (А) Индукция анестезии с использованием индукционной камеры. (B) Анестезия поддерживается с помощью носового конуса, что позволяет перемещать мышь по мере необходимости. (C) Крем для удаления волос наносится с использованием аппликатора с хлопковым наконечником. Глазной смазывающий гель применяется для защиты глаз во время анестезии. (D) Эффективное удаление волос правого уха. Сравните с необработанным левым ухом. (E) Внутрикожное введение C. albicans в ухо мыши. Ухо удерживается на месте с помощью конической трубки, обернутой двусторонней кожной лентой (модной лентой). (F) Крупный план внутрикожной инъекции. В коже образуется бледный пузырь, что является признаком успешного внутрикожного размещения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg"> Рисунок 2: Подготовка к визуализации. (А) Стадия микроскопа, подготовленная к визуализации. Анестезиологический конус носа закреплен на месте. Крышка приклеивается к сцене, закрывающей отверстие линзы. Доступны дополнительные куски ленты. Нагретую ступень предварительно нагревают до 37 °C (не показано). (B) Помещение анестезированной мыши в анестезирующий носовой конус. (C) Мышь слегка поворачивается так, что сторона уха, которая была привита, обращена к нижнему обтекателю/объективу. Затем ухо сплющивается к нижнему обтекателю и закрепляется на месте, помещая второй закрывающийся лист поверх уха. (D) Верхний чехл прикреплен к сцене, чтобы закрепить ухо на месте относительно ступени микроскопа. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg"> Рисунок 3: Морфология мутантного штамма efg1ΔΔ in vitro и in vivo. (A) Широкоугольное изображение мутантных штаммов WT и efg1ΔΔ после индукции нити in vitro путем выращивания клеток в RPMI + 10% сыворотки при 37 °C в течение 4 ч. Шкала брусков составляет 10 мкм. Контрастность изображения была отрегулирована с помощью программного обеспечения для редактирования фотографий для облегчения просмотра. (B) Процент филаментации in vitro, наблюдаемый в мутантных штаммах WT и efg1ΔΔ. Und = не обнаруживается (нити не обнаружены). Высота стержня представляет собой средний процент нитевидных клеток из трех независимых экспериментов, в которых было количественно определено по меньшей мере 100 клеток. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение (результаты сравниваются t-тестом студента, p < 0,001). (C) Конфокальная микрофотография WT (зеленый) и мутант efg1ΔΔ (красный), растущий in vivo через 24 ч после прививки. Стрелки указывают примеры мутантных клеток efg1ΔΔ, которые соответствуют нашему определению «нитевидных». Шкала представляет собой 50 мкм. (D) Процент филаментации in vivo, наблюдаемый в мутантных штаммах WT и efg1ΔΔ. Высота стержня представляет собой медианный процент нитевидных ячеек из двух независимых экспериментов. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение (результаты сравниваются t-тестом студента, p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg"> Рисунок 4: Морфология мутантного штамма cyr1ΔΔ in vitro и in vivo. (A) Широкоугольное изображение мутантного штамма cyr1ΔΔ после индукции филаментации in vitro путем выращивания клеток в RPMI + 10% сыворотки при 37 °C в течение 4 ч. Шкала представляет собой 10 мкм. Контрастность изображения была отрегулирована с помощью программного обеспечения для редактирования фотографий для облегчения просмотра. (B) Процент филаментации in vitro, наблюдаемый в мутантных штаммах WT и cyr1ΔΔ. Und = не обнаруживается (нити не обнаружены). Высота стержня представляет собой средний процент нитевидных клеток из трех независимых экспериментов, в которых было количественно определено по меньшей мере 100 клеток. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение (результаты сравниваются t-тестом студента, p < 0,001). (C) Конфокальная микрофотография WT (зеленый) и мутанта cyr1ΔΔ (красный), растущего in vivo через 24 ч после посева. Шкала представляет собой 50 мкм. (D) Процент филаментации in vivo, наблюдаемый в мутантных штаммах WT и cyr1ΔΔ. Высота стержня представляет собой медианный процент нитевидных ячеек из двух независимых экспериментов. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение (результаты сравниваются t-тестом студента, p < 0,001). (E) Распределение длины нити накала in vivo, измеренное длиной кривого пути в двумерной проекции z-стека. Каждая точка представляет длину одной нити. Клетки, растущие в виде дрожжей, не были включены в этот анализ. Бар обозначает среднюю длину нити накала. Распределение длин существенно отличается при анализе с использованием теста Манна-Уитни U (p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

В этой рукописи описан метод скрининга мутантных библиотек Candida albicans умеренного размера на фенотипы морфогенеза во время активной инфекции у хозяина млекопитающих с использованием неинвазивной конфокальной микроскопии.

Использование визуализации In Vivo для скрининга фенотипов морфогенеза у мутантных штаммов Candida albicans во время активной инфекции у хозяина млекопитающих

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

Морфогенез Candida albicans запускается множеством сигналов окружающей среды. Изучая морфогенез in vivo, мы определяем, как организм интегрируется и реагирует на все эти сигналы окружающей среды. Основным преимуществом данного метода является то, что он позволяет изучать морфогенез при отсутствии смещений или артефактов, которые могут быть введены с использованием модельных систем in vitro.Очень немногие люди имеют опыт внутрикожных инъекций. Я настоятельно рекомендую кому-то, кто новичок в этой технике, связаться с ветеринаром по ресурсам животных для получения помощи в ее изучении. Продемонстрировать процедуру будет Рохан Вакаде, постдокторант из нашей лабораторной группы.Начните с подготовки животного к прививке, кормя чау без хлорофилла в течение не менее семи дней до прививки. За день до инъекции возьмите кусочек канадских альбиканов из одной колонии с помощью зубочистки. Инокулируют 25 миллилитров YPD и повторяют этот процесс несколько раз, чтобы получить клетки из нескольких разных колоний.Инкубируйте культуру в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия в орбитальном шейкерном инкубаторе при 175 оборотах в минуту. Центрифугировать один миллилитр культуры в течение двух минут при 500 х г, затем трижды промыть дрожжи одним миллилитром стерильного DPBS. Повторно суспендировать гранулу в одном миллилитре стерильного DPBS и разбавить культуру на 1-100.Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и соответственно отрегулируйте плотность клеток. Далее создают инокулятив для инъекций, смешивая равные объемы указанного и экспериментального штамма. Используя тампон с ватным наконечником, нанесите безрецептурный крем для депиляции на внутреннюю и внешнюю поверхность обоих ушей обезболенного животного.Через две-три минуты аккуратно протрите ухо сухой марлей, а затем марлевыми подушечками, насыщенными стерильной водой, чтобы тщательно удалить остатки крема для депиляции. После стерилизации поверхности ушей 70% этанолом хорошо перемешайте инокулятив, перевернув флакон несколько раз или вихря его. Втяните от 20 до 30 микролитров инокулята в инсулиновый шприц.Держите иглу в вертикальном положении и осторожно постукивайте по шприцу, чтобы убедиться, что любой воздух в стволе находится наверху. Осторожно выбрасывайте воздух и избыток инокулята обратно в инокулятивную трубку или отработанную трубку, чтобы плунжер находился на отметке 10 микролитров. Нанесите безрецептурную двухстороннюю кожную ленту на небольшую коническую пластиковую трубку с круглым дном и задрапируйте ухо поперек ленты, избегая смещения конуса анестезии носа.Держа шприцевую иглу почти параллельно коже и избегая каких-либо крупных вен, вставьте кончик иглы в самый внешний слой кожи до тех пор, пока скос не будет просто покрыт, и медленно вводите инокулят внутрикожно. Хорошая внутрикожная инъекция поднимет небольшой пузырь в коже. Держите иглу на месте в течение 15-20 секунд, прежде чем вынуть ее из уха, чтобы свести к минимуму утечку.Следуя институциональным протоколам, пометьте клетку метками биологической опасности, указывающими, что животные в клетке заражены Candida albicans. Используя те же промытые культуры, которые использовались для приготовления инокулята, создают от 1 до 50 разведений клеток в RPMI 1640, дополняют 10% теплом и активируют фетальной бычьей сывороткой и инкубируют при 37 градусах Цельсия с кувырканием в течение четырех часов. Изучите образец с помощью микроскопа.Подсчитайте не менее 100 клеток, регистрируя количество дрожжевых и нитевидных клеток для каждого штамма. Поверните объектив на большом рабочем расстоянии на место и поместите каплю погружной жидкости на объектив. Опустите объектив, чтобы избежать возможных повреждений при размещении крышки.Крышка места No 1.5 скользит по отверстию сцены и заклеивает ее на место. Поднимите объектив так, чтобы погружная жидкость контактировала как с объективом, так и с проскальзыванием крышки. Закрепите анестезирующий носовой конус на стадии микроскопа таким образом, чтобы он полностью закрывал нос животного, когда он находится в положении для визуализации.Поместите нос анестезированной мыши в носовой конус. Поместите каплю стерильной воды на крышку над объективом. Отрегулируйте конус анестезии носа и расположите мышь так, чтобы ухо мыши находилось над каплей воды.Возьмите еще один скольжение крышки и поместите край крышки параллельно телу мыши, причем край касается мыши там, где ухо встречается с головой. Используя шарнирное движение, опустите свободный край крышки на ступень микроскопа. Когда крышка скользит по ступени микроскопа, она сплющивает ухо.Лента верхней крышки надежно скользит, чтобы удерживать достаточное давление, чтобы держать ухо плоским и не зацепить волосы мыши или усы в ленте. Если не используется микроскоп с камерой окружающей среды, свободно накройте тело мыши стерильной драпировкой для поддержания нормальной термической среды. Используя белый свет, широкоугольную визуализацию, отрегулируйте плоскость фокусировки в ушной ткани и сосредоточьтесь на красных кровяных клетках, движущихся в кровеносных сосудах.Чтобы получить достаточно сильное отношение сигнал/шум, чтобы морфологию можно было определить для всех клеток в поле зрения, отрегулируйте мощность лазера или скорость изображения. Чтобы избежать повреждения тканей, используйте минимально возможную мощность лазера. Выберите поле зрения с четким образованием нитей в указанном штамме и где большинство организмов распределены настолько, чтобы можно было определить их морфологию.Установите верхнюю и нижнюю плоскости фокусировки для Z-стека. Покрытие всей глубины зараженной области не является необходимым, но имейте в виду, что организмы в верхней или нижней части изображенного объема обычно исключаются из анализа. Получайте изображения Z-стека, псевдоцветите каждый канал, чтобы различать каждое напряжение и накладывать каналы.Сохраните изображения. Используйте программное обеспечение для обработки изображений для выполнения максимальной проекции Z-стека в двумерное изображение. Подсчитайте каждый организм, видимый на максимальных проекционных изображениях, по типу штамма и морфологии.Указанный штамм быстро образует нити in vitro. В то время как значение EFG1 Null не смогло сформировать нити. EFG1 Null также демонстрирует значительный дефект филаментации in vivo.Приблизительно 9% нулевых клеток EFG1 росли в виде нитей in vivo. Аналогичным образом, мутантный штамм CYR1 Null показал дефект филаментации in vitro по сравнению с упомянутым штаммом. Напротив, 53% мутантных клеток CYR1 Null росли как нити in vivo.Нити, образованные мутантом CYR1 Null, были короче, чем упомянутый штамм. Очень важно держать иглу параллельно коже во время прививки. Цель состоит в том, чтобы поместить инокуляту непосредственно под внешний слой кожи.Этот метод также может быть использован со штаммами мышей, которые экспрессируют флуоресцентный белок в клетках-хозяевах, представляющих интерес, что позволяет нам изучать взаимодействия патогенов хозяина in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

В естественных изображений трансгенных Паразиты Leishmania в реальный хост

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Неинвазивная Визуализация лейкоцитов самонаведения и миграции В естественных условиях</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Использование искусственного среднего мокроты для тестирования антибиотиков эффективность против<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; В условиях более актуальными для кистозного фиброза легких

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Изучение микробных сообществ<em&gt; В Vivo</em&gt;: Модель узла опосредованного взаимодействия между<em&gt; Candida Albicans</em&gt; И<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; В Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Простой и эффективный подход к Construct Mutant осповакцины вирусного вектора

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Исследование хост фенотипы в<em&gt; Gambusia аШшз</em&gt; После Лечение антибиотиками

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Изображений взаимодействия клеток в слизистой оболочки трахеи во время инфекции вируса гриппа с помощью двух Фотон прижизненной микроскопии

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Уточнение и изображение Candida Альбиканс Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Ex vivo Assay для изучения Candida Albicans Hyphal Morphogenesis в желудочно-кишечном тракте

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Рецидивирующая инфекция мочевыводящих путей Escherichia coli , вызванная воздействием Gardnerella vaginalis на мочевой пузырь у мышей

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...