Name: use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la subvención 1R01AI33409 de los NIH y el Departamento de Pediatría, Carver College of Medicine, Universidad de Iowa.

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+associated+proteins+involved+in+filamentation+with+impact+on+the+virulence+of+Candida+albicans.">Cell wall associated proteins involved in filamentation with impact on the virulence of Candida albicans.</a> Microbiological Research. 258, 126996 (2022).</li><li>Rai, L. S., Wijlick, L. V., Bougnoux, M. E., Bachellier-Bassi, S., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+commensal+and+pathogenic+life-styles+of+an+opportunistic+fungus-Candida+albicans.">Regulators of commensal and pathogenic life-styles of an opportunistic fungus-Candida albicans.</a> Yeast. 38 (4), 243-250 (2021).</li><li>Sudbery, P. 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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Este modelo utiliza microscopía confocal para obtener imágenes de los organismos de C. albicans a medida que crecen dentro del tejido de un huésped mamífero, lo que nos permite evaluar los fenotipos de morfogénesis durante la infección activa. El proceso de morfogénesis es fundamental para la patogénesis de C. albicans y ha sido ampliamente estudiado utilizando una variedad de ensayos in vitro 2,3,4. Sin embargo, ningún ensayo in vitro puede modelar completamente el complejo entorno bioquímico y estructural del huésped.
El protocolo descrito aquí se centra en el uso de este sistema de imágenes in vivo para detectar una serie / biblioteca de mutantes de C. albicans para identificar los genes involucrados en la morfogénesis durante la infección. El uso de cepas de C. albicans que expresan diferentes proteínas fluorescentes nos permite cuantificar in vivo la morfogénesis de las cepas mutantes de C. albicans en comparación con la de una cepa de referencia. La comparación de la morfogénesis en el mutante con la cepa de referencia dentro de la misma área de infección asegura que los organismos estén expuestos a ambientes idénticos. Esto permite la medición cuantitativa del porcentaje de células sometidas a filamentación, así como el grado de filamentación. La normalización de las mediciones de la(s) cepa(s) mutante(s) a las de la cepa de referencia nos permite comparar mejor el rendimiento de un mutante con otro.
Los resultados representativos presentados aquí demuestran el potencial de una discrepancia significativa entre los fenotipos in vitro e in vivo . La cepa mutante C. albicans efg1ΔΔ se utiliza a menudo como control negativo para ensayos de morfogénesis, ya que no logra filamentar en casi todas las condiciones in vitro 20. Aunque los resultados in vivo fueron muy similares a los resultados in vitro , incluso esta cepa gravemente obstaculizada ocasionalmente formó filamentos en el entorno del tejido huésped (Figura 3). Esto enfatiza la fuerza del entorno del huésped para desencadenar la morfogénesis.
Por el contrario, la cepa mutante cyr1ΔΔ demuestra una discordancia sustancial entre el crecimiento in vitro e in vivo; aunque ninguna de las células mutantes sufre filamentación in vitro, aproximadamente la mitad de las células crecen como filamentos in vivo (Figura 4)10,21. Curiosamente, estos filamentos eran significativamente más cortos que los formados por la cepa de referencia, lo que sugiere que CYR1 contribuye a la tasa de crecimiento del filamento o a la capacidad de mantener un fenotipo filamentoso. Para facilitar el análisis de la longitud del filamento, se midió la longitud de la trayectoria de la curva de los filamentos mediante una proyección bidimensional de las imágenes. En proyecciones bidimensionales de filamentos que crecen en tres dimensiones, cualquier filamento que crezca en un eje que no sea paralelo al plano xy se proyectará como más corto que su longitud real. Como este escorzo también ocurre para la deformación de referencia, la evaluación de la distribución de longitudes de filamento en una proyección bidimensional aún permite una comparación cuantitativa entre las cepas de referencia y mutantes. El análisis de la longitud del filamento en dos dimensiones en lugar de tres requiere un análisis de imagen menos intensivo; Por lo tanto, se puede realizar relativamente rápido en una computadora de escritorio típica. El uso de este análisis más simple permite la inclusión de la distribución de la longitud del filamento como parte de un protocolo de selección, lo que brinda una comprensión más matizada de la capacidad de cada mutante para someterse a la morfogénesis sin causar retrasos sustanciales en el rendimiento.
Los estudios representativos presentados aquí fueron realizados con ratones DBA2/N, que tienen un defecto en su sistema del complemento que causa una falla en el reclutamiento de neutrófilos en el sitio de la infección por C. albicans 22. El objetivo de estos estudios fue investigar los mecanismos de regulación de la filamentación de C. albicans dentro del tejido huésped. Por lo tanto, se utilizaron ratones DBA2 / N para evitar confundir los resultados debido a la susceptibilidad o resistencia de una cepa individual a los neutrófilos. Como la respuesta anti-C. albicans de neutrófilos puede afectar la filamentación23, el reclutamiento de neutrófilos en el sitio de la infección podría afectar los resultados de un ensayo de morfogénesis. Si una cepa es capaz de filamentar in vivo pero está fuertemente inhibida de la filamentación cuando hay neutrófilos presentes, la filamentación se detectaría en ratones DBA2 / N, pero es poco probable que se vea cuando se usan ratones con quimiotaxis de neutrófilos intacta. Por lo tanto, la tensión del ratón utilizado como host es un factor importante cuando se utiliza este protocolo.
La observación de que la cepa mutante efg1ΔΔ no logra filamentar in vivo es poco probable que esté relacionada con las respuestas de los neutrófilos del huésped, porque esta cepa tampoco puede filamentar in vitro. La filamentación observada in vivo con la cepa cyr1ΔΔ es discordante con su fallo de filamentación in vitro. Los datos del modelo de pez cebra de la infección por C. albicans indican que los neutrófilos que responden son importantes en la prevención de la morfogénesis24. Por lo tanto, es poco probable que el uso de ratones DBA2/N, que carecen de respuestas de neutrófilos, explique el aumento de la filamentación del cyr1ΔΔ in vivo en comparación con in vitro. Sin embargo, el ambiente in vivo está afectando claramente la morfogénesis de la cepa cyr1ΔΔ; por lo tanto, la investigación adicional de esta cepa puede proporcionar información importante sobre la regulación de la morfogénesis de C. albicans durante las infecciones activas. El protocolo descrito aquí está diseñado como un ensayo de detección para identificar cepas como la cepa cyr1ΔΔ que se utilizará en estudios futuros.
El uso de un sistema de anestesia de gas de bajo flujo es muy útil para este protocolo (Figura 1A, B). Durante el desarrollo inicial de este protocolo, los ratones fueron anestesiados usando un cóctel anestésico inyectable de ketamina mezclada con xilazina. Si bien fue posible realizar imágenes limitadas con ese método anestésico, la duración de la anestesia fue impredecible, lo que requirió que las sesiones de imágenes terminaran rápidamente para evitar que el ratón se recuperara de la anestesia durante la imagen. Los sistemas anestésicos inhalados tradicionales son voluminosos y requieren altas tasas de flujo de gases anestésicos, lo que a menudo requiere que se utilicen dentro de una campana extractora. Por lo tanto, los sistemas anestésicos inhalados tradicionales serían muy difíciles de usar con las limitaciones de espacio de un microscopio confocal sin exponer inadvertidamente a los investigadores a los agentes anestésicos. El uso de un sistema anestésico inhalado de bajo flujo permite una anestesia constante del animal mientras se mantiene un ambiente seguro para el investigador. La nosecone de bajo flujo permite un fácil posicionamiento del animal tanto para la inoculación como para la microscopía. El tubo de administración de pequeño calibre y bajo volumen permite el uso de tubos relativamente largos, lo que permite que la máquina de anestesia se coloque a una distancia suficiente para no interferir con la microscopía.
La clorofila presente en la comida típica de ratón conduce a una autofluorescencia tisular significativa25. Esto crea un ruido sustancial en las imágenes, lo que dificulta la obtención de imágenes de alta calidad y alta resolución espacial. Cuando los animales fueron alimentados con comida libre de clorofila durante 7 días antes de la obtención de imágenes, el fondo de la autofluorescencia disminuyó sustancialmente en el tejido, pero la clorofila depositada en el cabello continuó siendo problemática. La eliminación del vello en las pinnas con una crema depilatoria química de venta libre es eficaz para minimizar la autofluorescencia en el cabello (Figura 1C, D). Por lo tanto, la combinación de comida libre de clorofila y depilación adecuada disminuyó sustancialmente la autofluorescencia y mejoró drásticamente la calidad de la imagen. Debido a que el pelo se elimina de la oreja antes de la imagen, el color del pelo del animal no afecta este sistema. Este protocolo se ha utilizado con éxito para estudiar las infecciones por C. albicans en ratones BALB/c (blanco), C57BL/6 (negro) y DBA2/N (marrón). El protocolo también se puede utilizar con ratones knockout C57BL/6 que son deficientes en varios genes del huésped; Esto permitirá futuras investigaciones sobre cómo el sistema inmune del huésped mamífero afecta la filamentación. Una característica de este modelo que no se discute en este protocolo es que, debido a que este sistema de imágenes no es invasivo, el mismo animal puede ser fotografiado repetidamente durante varios días, lo que permite seguir el progreso de la infección individual a lo largo del tiempo. Esta característica probablemente jugará un papel clave en futuros estudios sobre la interacción huésped-patógeno.
En resumen, este protocolo da como resultado imágenes de alta resolución espacial de C. albicans creciendo en el tejido de un huésped mamífero vivo, lo que permite una evaluación precisa de la morfogénesis en cepas mutantes 8,9,10. Los resultados presentados aquí demuestran cómo se puede usar este protocolo para detectar una biblioteca de mutantes de C. albicans. De los mutantes de C. albicans probados hasta la fecha, una gran parte de los mutantes con defectos conocidos en la morfogénesis in vitro se someten fácilmente a filamentación in vivo 9,10. Esto resalta la importancia de incluir un sistema in vivo como este en experimentos diseñados para dilucidar los mecanismos de la patogénesis de C. albicans.

Candida albicans es un patógeno fúngico humano común, que causa enfermedad mucocutánea, enfermedad diseminada e infecciones tisulares localizadas1. Una característica clave de la fisiología de C. albicans es su complejo crecimiento polimórfico, que está vinculado a su papel como comensal y patógeno 2,3,4. En condiciones ricas en nutrientes in vitro a 30 °C, típicamente crece como una levadura ovoide en ciernes. Una variedad de desencadenantes ambientales, incluida la privación de nutrientes, los cambios de pH, el crecimiento a 37 ° C, la exposición al suero y el crecimiento cuando se incrusta en el agar, dan como resultado la transición a un patrón de crecimiento polarizado, lo que resulta en la formación de verdaderas hifas y / o pseudohifas5. El inicio del crecimiento polarizado y el crecimiento resultante de organismos filamentosos se conoce como morfogénesis.
Debido a la importancia de la morfogénesis en la virulencia del organismo, la regulación de la formación hifal ha sido ampliamente estudiada 6,7. Existe una compleja red de vías de señalización y regulación transcripcional que desencadena la morfogénesis. A pesar de la relación de la morfogénesis de C. albicans con la patogénesis, la mayoría de los estudios que investigan la morfogénesis han utilizado estímulos in vitro para desencadenar la formación de hifos. Cada vez está más claro que los diversos modelos in vitro de filamentación no son idénticos en términos de las vías reguladoras individuales estimuladas. Además, ninguna condición de crecimiento in vitro se corresponde estrechamente con el complejo entorno del huésped. Dada la importancia de C. albicans como patógeno humano, el objetivo de este protocolo es investigar su morfogénesis durante la infección activa en un huésped mamífero utilizando un sistema con un rendimiento moderado, lo que permite a un investigador examinar las bibliotecas mutantes de C. albicans.
Para facilitar estas investigaciones, se desarrolló un sistema de imagen in vivo que permite obtener imágenes de alta resolución espacial de células de C. albicans durante la infección del pabellón auricular de un ratón anestesiado utilizando un microscopio confocal invertido 8,9,10. Debido a que la piel del pabellón auricular es bastante delgada, estas imágenes se pueden obtener sin la necesidad de disección de tejido. Por lo tanto, los datos cuantitativos del fenotipo se pueden medir en el sitio de las infecciones activas dentro del tejido del huésped. El protocolo descrito aquí implica la transformación de una cepa de referencia y una o más cepas mutantes con diferentes casetes de expresión de proteínas fluorescentes11,12. Las cepas fluorescentes que expresan proteínas se mezclan y se coinyectan por vía intradérmica. Después de que se establece la infección, las imágenes confocales se utilizan para cuantificar tanto la frecuencia de filamentación como la longitud de los filamentos formados. Los datos obtenidos de las cepas mutantes se normalizan a los obtenidos de la cepa de referencia, que está presente en la misma región tisular, proporcionando así un control interno. Este sistema nos ha permitido tamizar con éxito varias series de cepas mutantes de C. albicans, muchas de las cuales presentan defectos de morfogénesis in vitro 9,10. Muchas de estas cepas se filamentan fácilmente in vivo, destacando la importancia de los modelos in vivo para la investigación de la morfogénesis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 coverslips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>20811</td>
			<td>large enough to cover the universal stage opening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 mL Insulin syringes</td>
			<td>EXELint</td>
			<td>26018</td>
			<td>Can use syringes that are 5/16&#34;&#8211;1/2&#34; long and 29&#8211;32 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.7% formaldehyde in dPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBJ5734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol/30% water</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>A05061001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.albicans reference strain and experimental strains</td>
			<td>SN250</td>
			<td>FGSC Online Catalog</td>
			<td>The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyl free mouse chow</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2920x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7050</td>
			<td>Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicator</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>76200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBA2/N (6-12 week old mice)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.&#160; The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.&#160; This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.&#160; It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.&#160; 
			Examples:&#160; 
			https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-40 
			https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174320&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-26 
			https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Must be sterile; open a new container for every experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze pad</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>P157112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel eye lurbicant</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ or FIJI analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ (FIJI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>J119005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8 (SP8)</td>
			<td>The objective lens&#160; (Leica 11506375) used here&#160; is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. 
			The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free&#160; spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. 
			The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific International</td>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair hair remover lotion</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Over the counter depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AB-101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent protein expression transformation constructs&#160; generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensitive laboratory tape</td>
			<td>Tape &#38; Label Graphic Systems Inc</td>
			<td>1007910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 cell culture medium</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>To safely hold the animals ear during injectinos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host

Candida albicans es un patógeno humano importante. Su capacidad para cambiar entre formas morfológicas es fundamental para su patogénesis; Estos cambios morfológicos están regulados por una compleja red de señalización controlada en respuesta a estímulos ambientales. Estos componentes reguladores han sido muy estudiados, pero casi todos los estudios utilizan una variedad de estímulos in vitro para desencadenar la filamentación. Para determinar cómo se regula la morfogénesis durante el proceso de patogénesis, desarrollamos un sistema de microscopía in vivo para obtener imágenes de alta resolución espacial de organismos sometidos a formación hifal dentro del huésped mamífero. El protocolo presentado aquí describe el uso de este sistema para detectar pequeñas colecciones de cepas mutantes de C. albicans, lo que nos permite identificar reguladores clave de la morfogénesis a medida que ocurre en el sitio de la infección. Se presentan resultados representativos, que demuestran que algunos reguladores de la morfogénesis, como el regulador transcripcional Efg1, tienen fenotipos consistentes in vitro e in vivo, mientras que otros reguladores, como la adenilciclasa (Cyr1), tienen fenotipos significativamente diferentes in vivo en comparación con in vitro.

Los resultados presentados aquí se basan en informes publicados anteriormente 9,10. El objetivo de este análisis es evaluar cuantitativamente la capacidad de las cepas mutantes de C. albicans para sufrir morfogénesis durante infecciones activas. Los parámetros típicos que distinguen las pseudohifas de las hifas pueden ser difíciles de evaluar en organismos que crecen en tres dimensiones en un entorno complejo in vivo. Esto es particularmente cierto cuando se observan las secciones transversales bidimensionales creadas por imágenes confocales. Por lo tanto, este análisis de detección se centra en identificar organismos que crecen como filamentosos frente a levaduras. Para los estudios de seguimiento que utilizan un análisis más profundo, incluidas las reconstrucciones tridimensionales, este método podría adaptarse para discriminar levaduras, hifas y pseudohifas.
La expresión de una proteína fluorescente en una cepa de referencia o mutante de C. albicans permite la detección directa de la morfología de la cepa in vivo (Figura 3 y Figura 4). En general, el análisis cuantitativo de microscopía óptica se realiza mejor cuando pocos o ninguno de los píxeles de la imagen están saturados. Para este protocolo, sin embargo, una saturación de la imagen a menudo simplifica el análisis. La localización de proteínas fluorescentes no es uniforme en toda la célula y a menudo es mayor en la levadura madre que en los filamentos. Afortunadamente, para la investigación de la morfogénesis, la distribución espacial de la señal, en lugar de su intensidad, define el resultado. Por lo tanto, la obtención de imágenes en las que se saturan muchos píxeles mejora la capacidad de cuantificar la morfogénesis en este ensayo.
Para ilustrar la importancia de evaluar la morfogénesis in vivo, se presentan resultados representativos para la cepa de referencia (SN250) y dos mutantes: uno que carece del factor de transcripción Efg1 y el otro que carece de adenilil ciclasa Cyr1. In vitro, ninguna de estas cepas crece como filamentos20,21. Cuando se cultiva in vitro en medio RPMI suplementado con suero al 10%, la cepa de referencia forma rápidamente filamentos, mientras que las cepas efg1ΔΔ y cyr1ΔΔ no lo hacen (Figura 3 y Figura 4). En estas condiciones, el mutante efg1ΔΔ exhibe un crecimiento algo polarizado, con las células hijas ligeramente alargadas en comparación con las células madre. Esto enfatiza la importancia de usar una definición clara de filamentación. Cualquier definición de este tipo es arbitraria por defecto, pero es necesaria para una evaluación consistente del fenotipo. Para estos estudios, un patrón filamentoso de crecimiento se define como un organismo con la dimensión más larga de una célula hija más del doble que la de la célula madre. Usando esta definición, las células estigmatizadas efg1ΔΔ no son filamentosas.
De acuerdo con su fenotipo in vitro, el efg1 ΔΔ exhibe un defecto de filamentación significativo in vivo: aproximadamente el 9% de las células efg1ΔΔ crecieron como filamentos in vivo (Figura 3). En contraste, el 53% de las células mutantes cyr1ΔΔ crecieron como filamentos in vivo (Figura 4). Aunque el número de células mutantes cyr1 ΔΔ sometidas a filamentación in vivo fue significativamente menor que la cepa de referencia, la capacidad del mutante cyr1ΔΔ para formar filamentos in vivo representa un cambio sustancial de su completa falta de morfogénesis in vitro. Visualmente, los filamentos formados por el mutante cyr1ΔΔ parecían ser más cortos que la cepa de referencia. Para evaluar esto cuantitativamente, se midió la longitud de la trayectoria de la curva de las células filamentosas utilizando una proyección bidimensional de las imágenes in vivo (Figura 4E). La longitud media de los filamentos cyr1ΔΔ fue un 29% más corta que los filamentos de la cepa de referencia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg"> Figura 1: Anestesia e inoculación . (A) Inducción de la anestesia utilizando una cámara de inducción. (B) La anestesia se mantiene utilizando un cono nasal, lo que permite que el ratón se reposicione según sea necesario. (C) La crema depilatoria se aplica con un aplicador con punta de algodón. Se ha aplicado gel de lubricación ocular para proteger los ojos durante la anestesia. (D) Depilación efectiva de la oreja derecha. Compárese con el oído izquierdo no tratado. (E) Inyección intradérmica de C. albicans en el oído del ratón. La oreja se mantiene en su lugar usando la punta de un tubo cónico envuelto con cinta adhesiva de piel de doble cara (cinta de moda). (F) Primer plano de la inyección intradérmica. Se forma una burbuja pálida en la piel, que es un signo de una colocación intradérmica exitosa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg"> Figura 2: Preparación para la obtención de imágenes. (A) Etapa de microscopio preparada para la obtención de imágenes. El cono nasal de anestesia está asegurado en su lugar. Se pega un cubreobjetos al escenario que cubre la abertura de la lente. Piezas adicionales de cinta están disponibles. La platina calentada se precalienta a 37 °C (no se muestra). (B) Colocación del ratón anestesiado en el cono nasal de anestesia. (C) El ratón se gira ligeramente de modo que el lado de la oreja que fue inoculado esté orientado hacia la cubierta inferior / lente del objetivo. Luego, la oreja se aplana contra el cubreobjetos inferior y se asegura en su lugar colocando un segundo cubreobjetos en la parte superior de la oreja. (D) El cubreobjetos superior se pega con cinta adhesiva a la plataforma para asegurar la oreja en su lugar en relación con la etapa del microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg"> Figura 3: Morfología in vitro e in vivo de la cepa mutante efg1ΔΔ. (A) Imagen de campo amplio de cepas mutantes WT y efg1ΔΔ después de la inducción in vitro de filamentación mediante el cultivo de células en suero RPMI + 10% a 37 °C durante 4 h. Las barras de escala representan 10 μm. El contraste de la imagen se ajustó utilizando un software de edición de fotos para facilitar la visualización. (B) Porcentaje de filamentación in vitro observado en las cepas mutantes WT y efg1ΔΔ. Und = indetectable (no se detectaron filamentos). La altura de la barra representa el porcentaje medio de células filamentosas de tres experimentos independientes en los que se cuantificaron al menos 100 células. Las barras de error indican desviación estándar (resultados comparados por la prueba t de Student, p < 0,001). (C) Micrografía confocal de WT (verde) y el mutante efg1ΔΔ (rojo) creciendo in vivo 24 h después de la inoculación. Las flechas indican ejemplos de células mutantes efg1ΔΔ que cumplen con nuestra definición de "filamentosas". La barra de escala representa 50 μm. (D) Porcentaje de filamentación in vivo observado en las cepas mutantes WT y efg1ΔΔ. La altura de la barra representa el porcentaje medio de células filamentosas de dos experimentos independientes. Las barras de error indican desviación estándar (resultados comparados por la prueba t de Student, p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg"> Figura 4: Morfología in vitro e in vivo de la cepa mutante cyr1 ΔΔ. (A) Imagen de campo amplio de la cepa mutante cyr1ΔΔ después de la inducción in vitro de filamentación mediante el cultivo de células en RPMI + 10% de suero a 37 °C durante 4 h. La barra de escala representa 10 μm. El contraste de la imagen se ajustó utilizando un software de edición de fotos para facilitar la visualización. (B) Porcentaje de filamentación in vitro observado en las cepas mutantes WT y cyr1ΔΔ. Und = indetectable (no se detectaron filamentos). La altura de la barra representa el porcentaje medio de células filamentosas de tres experimentos independientes en los que se cuantificaron al menos 100 células. Las barras de error indican desviación estándar (resultados comparados por la prueba t de Student, p < 0,001). (C) Micrografía confocal de WT (verde) y el mutante cyr1ΔΔ (rojo) creciendo in vivo 24 h después de la inoculación. La barra de escala representa 50 μm. (D) Porcentaje de filamentación in vivo observado en las cepas mutantes WT y cyr1ΔΔ. La altura de la barra representa el porcentaje medio de células filamentosas de dos experimentos independientes. Las barras de error indican desviación estándar (resultados comparados por la prueba t de Student, p < 0,001). (E) Distribución de la longitud del filamento in vivo, medida por la longitud de la trayectoria de la curva en una proyección bidimensional de la pila z. Cada punto representa la longitud de un filamento. Las células que crecen como levadura no se incluyeron en este análisis. La barra indica la longitud mediana del filamento. La distribución de longitudes es significativamente diferente cuando se analiza mediante una prueba U de Mann-Whitney (p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Este manuscrito describe un método para examinar bibliotecas mutantes de Candida albicans de tamaño moderado para fenotipos de morfogénesis durante la infección activa en un huésped mamífero utilizando microscopía confocal no invasiva.

Uso de imágenes in vivo para detectar fenotipos de morfogénesis en cepas mutantes de Candida albicans durante la infección activa en un huésped mamífero

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

La morfogénesis de Candida albicans se desencadena por una miríada de señales ambientales. Al estudiar la morfogénesis in vivo, estamos determinando cómo el organismo se integra y responde a todas estas señales ambientales. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite estudiar la morfogénesis en ausencia de sesgos o artefactos que puedan introducirse utilizando sistemas de modelos in vitro.Muy pocas personas tienen experiencia con inyecciones intradérmicas. Recomiendo encarecidamente que alguien nuevo en esta técnica se ponga en contacto con su veterinario de recursos animales para obtener ayuda para aprenderla. Demostrando el procedimiento estará Rohan Wakade, becario postdoctoral de nuestro grupo de laboratorio.Comience preparando al animal para la inoculación alimentando a la comida sin clorofila durante al menos siete días antes de la inoculación. Un día antes de la inyección, tome un poco de células albicans de Canadá de una colonia con un palillo de dientes. Inocular 25 mililitros de YPD y repetir este proceso varias veces para obtener células de varias colonias diferentes.Incubar el cultivo durante la noche a 30 grados centígrados en una incubadora de agitador orbital a 175 RPM. Centrifugar un mililitro de cultivo durante dos minutos a 500 x g, luego lavar la levadura tres veces con un mililitro de DPBS estéril. Resuspender el pellet en un mililitro de DPBS estéril y diluir el cultivo de 1 a 100.Cuente las células con un hemocitómetro y, en consecuencia, ajuste la densidad celular. A continuación, cree el inóculo para inyección mezclando volúmenes iguales de la cepa referenciada y experimental. Usando un hisopo con punta de algodón, aplique una crema depilatoria de venta libre generosamente en la superficie interna y externa de ambas orejas de un animal anestesiado.Después de dos o tres minutos, limpie suavemente la oreja con una gasa seca seguida de gasas saturadas en agua estéril para eliminar completamente los residuos de crema depilatoria. Después de esterilizar la superficie de las orejas con etanol al 70%, mezcle bien el inóculo invirtiendo el vial varias veces o vórticelo. Extraiga de 20 a 30 microlitros de inóculo en una jeringa de insulina.Sostenga la aguja en posición vertical y golpee suavemente la jeringa para asegurarse de que el aire en el barril esté en la parte superior. Expulse cuidadosamente el aire y el exceso de inóculo de nuevo en el tubo de inóculo o en un tubo de residuos para que el émbolo esté en la marca de 10 microlitros. Aplique sobre el mostrador cinta adhesiva de doble cara a un pequeño tubo de plástico cónico o de fondo redondo y coloque la oreja a través de la cinta, evitando desalojar el cono nasal de anestesia.Manteniendo la aguja de la jeringa casi paralela a la piel y evitando las venas grandes, inserte la punta de la aguja en la capa más externa de la piel hasta que el bisel esté cubierto e inyecte lentamente el inóculo por vía intradérmica. Una buena inyección intradérmica levantará una pequeña burbuja en la piel. Mantenga la aguja en su lugar durante 15 a 20 segundos antes de retirarla del oído para minimizar las fugas.Siguiendo los protocolos institucionales, marque la jaula con etiquetas de riesgo biológico que indiquen que los animales en la jaula están infectados con Candida albicans. Usando los mismos cultivos lavados que se usaron para preparar el inóculo, cree una dilución de 1 a 50 de células en RPMI 1640, complementada con 10% de calor y suero bovino fetal activado e incube a 37 grados centígrados con volteo durante cuatro horas. Examine la muestra con un microscopio.Contar al menos 100 células, registrando el número de levaduras y células filamentosas para cada cepa. Gire el objetivo de larga distancia de trabajo en su lugar y coloque una gota de líquido de inmersión en la lente. Baje la lente para evitar posibles daños al colocar el cubreobjetos.Coloque el deslizamiento de la cubierta número 1.5 sobre la abertura del escenario y péguelo en su lugar. Levante el objetivo para que el fluido de inmersión esté en contacto tanto con la lente del objetivo como con el cubreobjetos. Asegure un cono nasal de anestesia en la etapa del microscopio de tal manera que cubra completamente la nariz del animal cuando esté en posición para la obtención de imágenes.Coloque la nariz de un ratón anestesiado en el cono de la nariz. Coloque una gota de agua estéril en el cubreobjetos sobre la lente del objetivo. Ajuste el cono de la nariz de anestesia y coloque el ratón de tal manera que la oreja del ratón esté por encima de la gota de agua.Tome otro cubreobjetos y coloque el borde del cubrebocado paralelo al cuerpo del ratón con el borde tocando el ratón donde la oreja se encuentra con la cabeza. Con un movimiento de bisagra, baje el borde libre del deslizamiento de la cubierta hasta la etapa del microscopio. A medida que el deslizamiento de la cubierta viene contra la etapa del microscopio, aplanará la oreja.Pegue con cinta adhesiva el deslizamiento de la cubierta superior de forma segura para mantener la presión suficiente para mantener la oreja plana y evitar atrapar el pelo o los bigotes del ratón en la cinta. A menos que se use un microscopio con una cámara ambiental, cubra holgadamente el cuerpo del ratón con una cortina estéril para mantener un ambiente térmico normal. Usando luz blanca, imágenes de campo amplio, ajuste el plano de enfoque en el tejido del oído y concéntrese en los glóbulos rojos que se mueven en los vasos sanguíneos.Para obtener una relación señal/ruido lo suficientemente fuerte como para que se pueda determinar la morfología de todas las células en el campo de visión, ajuste la potencia del láser o la velocidad de imagen. Para evitar daños en los tejidos, utilice la menor potencia láser posible. Elija un campo de visión con una formación clara de filamentos en la cepa referenciada y donde la mayoría de los organismos estén lo suficientemente dispersos como para que se pueda determinar su morfología.Establezca los planos superior e inferior de enfoque para una pila Z. No es necesario cubrir toda la profundidad del área infectada, pero tenga en cuenta que los organismos en la parte superior o inferior del volumen de la imagen generalmente se excluyen del análisis. Adquiera imágenes Z-stack, pseudo coloree cada canal para distinguir cada cepa y superponga los canales.Guarde las imágenes. Utilice software de imágenes para realizar una proyección máxima de la pila Z en una imagen bidimensional. Contar cada organismo visto en las imágenes de proyección máxima por tipo de cepa y morfología.La cepa referenciada forma rápidamente filamentos in vitro. Mientras que el EFG1 Null no pudo formar los filamentos. El EFG1 Null también exhibe un defecto de filamentación significativo in vivo.Aproximadamente el 9% de las células nulas EFG1 crecieron como filamentos in vivo. Del mismo modo, la cepa mutante CYR1 Null mostró un defecto de filamentación in vitro en comparación con la cepa referenciada. En contraste, el 53% de las células mutantes nulas CYR1 crecieron como filamentos in vivo.Los filamentos formados por el mutante CYR1 Null eran más cortos que la cepa referenciada. Es fundamental mantener la aguja paralela a la piel durante la inoculación. El objetivo es colocar el inóculo justo debajo de la capa externa de la piel.Esta técnica también se puede utilizar con cepas de ratón que expresan una proteína fluorescente en células huésped de interés, lo que nos permite estudiar las interacciones del patógeno del huésped in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

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Imágenes in vivo de los cultivos transgénicos parásitos Leishmania en un host en vivo

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Investigación

Inmunología e Infección

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

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De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

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Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

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El estudio de las comunidades microbianas<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; Y<em&gt; Pseudomonas Aeruginosa</em&gt; En las vías respiratorias

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Un enfoque simple y eficiente de construcción de mutantes de virus vaccinia Vectores

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Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

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El examen de los fenotipos de acogida en<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Tratamiento antibiótico Siguiendo

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

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Aclaración e imagen de Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

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Un ensayo ex vivo para estudiar Candida albicans Morphogenesis hifal en el tracto gastrointestinal

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

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Infección recurrente del tracto urinario por Escherichia coli desencadenada por la exposición de la vejiga de Gardnerella vaginalis en ratones

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...