Name: use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH-bidrag 1R01AI33409 och Institutionen för pediatrik, Carver College of Medicine, University of Iowa.

<ol>
	<li>Lopes, J. P., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+virulence+of+Candida+albicans.">Pathogenesis and virulence of Candida albicans.</a> Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+control+of+cell+morphology+in+vivo+reveals+distinct+roles+for+yeast+and+filamentous+forms+of+Candida+albicans+during+infection.">Engineered control of cell morphology in vivo reveals distinct roles for yeast and filamentous forms of Candida albicans during infection.</a> Eukaryotic Cell. 2 (5), 1053-1060 (2003).</li><li>Arita, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+associated+proteins+involved+in+filamentation+with+impact+on+the+virulence+of+Candida+albicans.">Cell wall associated proteins involved in filamentation with impact on the virulence of Candida albicans.</a> Microbiological Research. 258, 126996 (2022).</li><li>Rai, L. S., Wijlick, L. V., Bougnoux, M. E., Bachellier-Bassi, S., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+commensal+and+pathogenic+life-styles+of+an+opportunistic+fungus-Candida+albicans.">Regulators of commensal and pathogenic life-styles of an opportunistic fungus-Candida albicans.</a> Yeast. 38 (4), 243-250 (2021).</li><li>Sudbery, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Candida+albicans+hyphae.">Growth of Candida albicans hyphae.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).</li><li>Basso, V., d'Enfert, C., Znaidi, S., Bachellier-Bassi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+genes+to+networks:+The+regulatory+circuitry+controlling+candida+albicans+morphogenesis.">From genes to networks: The regulatory circuitry controlling candida albicans morphogenesis.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 422, 61-99 (2019).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+Candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in Candida species.</a> Elife. 10, 64682 (2021).</li><li>Mitra, S., Dolan, K., Foster, T. H., Wellington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+morphogenesis+of+Candida+albicans+during+infection+in+a+live+animal.">Imaging morphogenesis of Candida albicans during infection in a live animal.</a> Journal of Biomedical Optics. 15 (1), 010504 (2010).</li><li>Wakade, R. S., Huang, M., Mitchell, A. P., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+Candida+albicans+identifies+differential+in+vitro+and+in+vivo+filamentation+phenotypes+for+transcription+factor+deletion+mutants.">Intravital imaging of Candida albicans identifies differential in vitro and in vivo filamentation phenotypes for transcription factor deletion mutants.</a> mSphere. 6 (3), 0043621 (2021).</li><li>Wakade, R. S., Kramara, J., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+filamentation+does+not+require+the+cAMP-PKA+pathway+in+vivo.">Candida albicans filamentation does not require the cAMP-PKA pathway in vivo.</a> mBio. 13 (3), 0085122 (2022).</li><li>Bergeron, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Pseudomonas+aeruginosa+interact+to+enhance+virulence+of+mucosal+infection+in+transparent+zebrafish.">Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa interact to enhance virulence of mucosal infection in transparent zebrafish.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 00475 (2017).</li><li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+and+filaments+have+specialized,+independent+activities+in+a+zebrafish+model+of+Candida+albicans+infection.">Yeast and filaments have specialized, independent activities in a zebrafish model of Candida albicans infection.</a> Infection and Immunity. 86 (10), 00415-00418 (2018).</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 6th edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html">https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html</a> (2020)</li><li>Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotypic+profile+of+the+Candida+albicans+regulatory+network.">A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network.</a> Plos Genetics. 5 (12), 1000783 (2009).</li><li>Cullen, P. J., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+filamentous+growth+in+yeast.">The regulation of filamentous growth in yeast.</a> Genetics. 190 (1), 23-49 (2012).</li><li>Herrero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+filament+formation+in+Candida+albicans+by+polyamine+levels.">Control of filament formation in Candida albicans by polyamine levels.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4870-4878 (1999).</li><li>Ahmad Hussin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+auxotrophy+and+biotin+enhanced+germ+tube+formation+in+Candida+albicans.">Biotin auxotrophy and biotin enhanced germ tube formation in Candida albicans.</a> Microorganisms. 4 (3), 37 (2016).</li><li>Nantel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+profiling+of+Candida+albicans+cells+undergoing+the+yeast-to-hyphal+transition.">Transcription profiling of Candida albicans cells undergoing the yeast-to-hyphal transition.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3452-3465 (2002).</li><li>Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strains+and+strategies+for+large-scale+gene+deletion+studies+of+the+diploid+human+fungal+pathogen+Candida+albicans.">Strains and strategies for large-scale gene deletion studies of the diploid human fungal pathogen Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 4 (2), 298-309 (2005).</li><li>Glazier, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EFG1,+Everyone's+favorite+gene+in+Candida+albicans:+A+comprehensive+literature+review.">EFG1, Everyone's favorite gene in Candida albicans: A comprehensive literature review.</a> Frontiers in Cellular Infection and Microbiology. 12, 855229 (2022).</li><li>Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+and+diverse+regulation+of+the+Ras/cAMP/protein+kinase+A+pathway+in+Candida+albicans.">Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Chaturvedi, A. K., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+genetically+engineered+strain+to+evaluate+the+pathogenic+potential+of+yeast+cell+and+filamentous+forms+during+Candida+albicans+systemic+infection+in+immunodeficient+mice.">Use of a genetically engineered strain to evaluate the pathogenic potential of yeast cell and filamentous forms during Candida albicans systemic infection in immunodeficient mice.</a> Infection and Immunity. 76 (1), 97-102 (2008).</li><li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth.">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryotic Cell. 10 (7), 932-944 (2011).</li><li>Brothers, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase-driven+phagocyte+recruitment+controls+Candida+albicans+filamentous+growth+and+prevents+mortality.">NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003634 (2013).</li><li>Holmes, H., Kennedy, J. C., Pottier, R., Rossi, R., Weagle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recipe+for+the+preparation+of+a+rodent+food+that+eliminates+chlorophyll-based+tissue+fluorescence.">A recipe for the preparation of a rodent food that eliminates chlorophyll-based tissue fluorescence.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B: Biology. 29 (2-3), 199 (1995).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Denna modell använder konfokalmikroskopi för att få bilder av C. albicans organismer när de växer i vävnaden hos en däggdjursvärd, vilket gör att vi kan utvärdera morfogenesfenotyper under aktiv infektion. Processen för morfogenes är central för C. albicans patogenes och har studerats i stor utsträckning med hjälp av en mängd olika in vitro-analyser 2,3,4. Ingen in vitro-analys kan dock helt modellera värdens komplexa biokemiska och strukturella miljö.
Protokollet som beskrivs här är inriktat på användningen av detta in vivo-bildsystem för att screena en serie / bibliotek av C. albicans-mutanter för att identifiera generna som är involverade i morfogenes under infektion. Användningen av C. albicans-stammar som uttrycker olika fluorescerande proteiner gör det möjligt för oss att kvantifiera in vivo-morfogenesen av C. albicans mutanta stammar jämfört med en referensstam. Genom att jämföra morfogenesen hos mutanten med referensstammen inom samma infektionsområde säkerställs att organismerna utsätts för identiska miljöer. Detta möjliggör kvantitativ mätning av andelen celler som genomgår filamentation, liksom omfattningen av filamentation. Normalisering av mätningarna av mutantstammarna till referensstammens mätningar gör det möjligt för oss att bättre jämföra prestanda hos en mutant med en annan.
De representativa resultat som presenteras här visar potentialen för en signifikant skillnad mellan in vitro - och in vivo-fenotyper . C. albicans efg1ΔΔ-mutantstam används ofta som en negativ kontroll för morfogenesanalyser eftersom den inte filament under nästan alla in vitro-förhållanden 20. Även om in vivo-resultaten var mycket lika in vitro-resultaten , bildade även denna allvarligt hämmade stam ibland filament i värdvävnadsmiljön (figur 3). Detta betonar värdmiljöns styrka när det gäller att utlösa morfogenes.
Däremot uppvisar cyr1ΔΔ-mutantstammen en betydande diskrepans mellan in vitro- och in vivo-tillväxt; Även om ingen av mutantcellerna genomgår filamentation in vitro, växer ungefär hälften av cellerna som filament in vivo (figur 4)10,21. Intressant nog var dessa filament signifikant kortare än de som bildades av referensstammen, vilket tyder på att CYR1 bidrar till antingen filamenttillväxten eller förmågan att upprätthålla en trådformig fenotyp. För att underlätta analysen av filamentlängden mättes filamentens kurvvägslängd med hjälp av en tvådimensionell projektion av bilderna. I tvådimensionella projektioner av filament som växer i tre dimensioner kommer alla filament som växer på en axel som inte är parallell med xy-planet att projicera som kortare än dess verkliga längd. Eftersom denna förskjutning också sker för referensstammen, möjliggör utvärdering av filamentlängdernas fördelning i en tvådimensionell projektion fortfarande en kvantitativ jämförelse mellan referens- och mutantstammarna. Analys av filamentlängd i två snarare än tre dimensioner kräver mindre intensiv bildanalys; Således kan den utföras relativt snabbt på en typisk stationär dator. Genom att använda denna enklare analys kan filamentlängdsfördelning inkluderas som en del av ett screeningprotokoll, vilket ger en mer nyanserad förståelse av varje mutants förmåga att genomgå morfogenes utan att orsaka betydande förseningar i genomströmningen.
De representativa studier som presenteras här utfördes med DBA2/N-möss, som har en defekt i sitt komplementsystem som orsakar ett misslyckande med att rekrytera neutrofiler till platsen för C. albicans-infektion 22. Målet med dessa studier var att undersöka mekanismer för reglering av C. albicans filamentation i värdvävnaden. Därför användes DBA2/N-möss för att undvika att förvirra resultaten på grund av en enskild stams mottaglighet eller resistens mot neutrofiler. Eftersom det neutrofila anti-C. albicans-svaret kan påverka filamentation23, kan neutrofilrekrytering till infektionsstället påverka resultaten av en morfogenesanalys. Om en stam kan glödtrådas in vivo men starkt hämmas från filamentation när neutrofiler är närvarande, skulle filamentation detekteras hos DBA2/N-möss men det är osannolikt att den ses vid användning av möss med intakt neutrofil kemotaxi. Således är musens belastning som används som värd en viktig faktor när du använder detta protokoll.
Observationen att efg1ΔΔ-mutantstammen inte filament in vivo är osannolikt att vara relaterad till värdens neutrofila svar, eftersom denna stam inte heller filament in vitro. Den filamentation som observerats in vivo med cyr1ΔΔ-stammen är disharmonisk med dess underlåtenhet att filamentera in vitro. Data från zebrafiskmodellen av C. albicans-infektion indikerar att svarande neutrofiler är viktiga för att förebygga morfogenes24. Därför är det osannolikt att användningen av DBA2/N-möss, som saknar neutrofila svar, kommer att förklara ökningen av filamentationen av cyr1ΔΔ in vivo jämfört med in vitro. Icke desto mindre påverkar in vivo-miljön tydligt morfogenesen hos cyr1ΔΔ-stammen. Således kan ytterligare undersökning av denna stam ge viktig information om regleringen av C. albicans morfogenes under aktiva infektioner. Protokollet som beskrivs här är utformat som en screeninganalys för att identifiera stammar som cyr1ΔΔ-stammen som ska användas i framtida studier.
Användningen av ett gasanestesisystem med lågt flöde är till stor hjälp för detta protokoll (figur 1A, B). Under den första utvecklingen av detta protokoll bedövades möss med hjälp av en injicerbar bedövningscocktail av ketamin blandad med xylazin. Även om det var möjligt att utföra begränsad avbildning med den bedövningsmetoden, var anestesiens varaktighet oförutsägbar, vilket krävde att avbildningssessioner avslutades snabbt för att undvika att musen återhämtade sig från anestesi under avbildning. Traditionella inhalerade anestesisystem är skrymmande och kräver höga flödeshastigheter av anestesigaser, vilket ofta kräver att de används i en dragskåp. Således skulle traditionella inhalerade anestesisystem vara mycket svåra att använda med utrymmesbegränsningarna i ett konfokalmikroskop utan att oavsiktligt utsätta utredarna för bedövningsmedlen. Användningen av ett lågflödesinandat bedövningssystem möjliggör konsekvent anestesi hos djuret samtidigt som en säker miljö för utredaren upprätthålls. Den lågflödesnoskonen möjliggör enkel positionering av djuret för både ympning och mikroskopi. Den lilla kalibern leveransslangen med låg volym möjliggör användning av relativt långa rör, vilket gör att anestesimaskinen kan placeras på tillräckligt avstånd för att inte störa mikroskopi.
Klorofyllet som finns i typisk muschow leder till signifikant vävnadsautofluorescens25. Detta skapar betydande brus i bilderna, vilket gör det svårt att få högkvalitativa, högrumsliga upplösningsbilder. När djur matades klorofyllfri chow i 7 dagar före avbildning minskade bakgrunden från autofluorescens avsevärt i vävnad, men klorofyll avsatt i håret fortsatte att vara problematiskt. Att ta bort håret på pinnae med en receptfri kemisk hårborttagningskräm är effektivt för att minimera autofluorescens i håret (figur 1C,D). Således minskade kombinationen av klorofyllfri chow och adekvat hårborttagning avsevärt autofluorescens och förbättrade bildkvaliteten dramatiskt. Eftersom håret tas bort från örat före avbildning påverkar färgen på djurets hår inte detta system. Detta protokoll har använts framgångsrikt för att studera C. albicans infektioner i BALB/c (vit), C57BL/6 (svart) och DBA2/N (brun) möss. Protokollet kan också användas med C57BL/6 knockoutmöss som har brist på olika värdgener; Detta kommer att möjliggöra framtida undersökningar av hur däggdjursvärdets immunsystem påverkar filamentation. En egenskap hos denna modell som inte diskuteras i detta protokoll är att eftersom detta bildsystem är icke-invasivt kan samma djur avbildas upprepade gånger under flera dagar, vilket gör det möjligt att följa utvecklingen av individuell infektion över tiden. Denna funktion kommer sannolikt att spela en nyckelroll i framtida studier om värd-patogeninteraktionen.
Sammanfattningsvis resulterar detta protokoll i högupplösta bilder av C. albicans som växer i vävnaden hos en levande däggdjursvärd, vilket möjliggör noggrann utvärdering av morfogenes i mutanta stammar 8,9,10. Resultaten som presenteras här visar hur detta protokoll kan användas för att screena ett bibliotek med C. albicans-mutanter. Av de C. albicans-mutanter som hittills testats genomgår en stor del av mutanterna med kända defekter i morfogenes in vitro lätt filamentation in vivo 9,10. Detta belyser vikten av att inkludera ett in vivo-system som detta i experiment som är utformade för att belysa mekanismerna för C. albicans patogenes.

Candida albicans är en vanlig mänsklig svamppatogen som orsakar mukokutan sjukdom, spridd sjukdom och lokaliserade vävnadsinfektioner1. Ett viktigt inslag i C. albicans fysiologi är dess komplexa polymorfa tillväxt, som är kopplad till dess roll som både en kommensal och en patogen 2,3,4. Under rika näringsförhållanden in vitro vid 30 ° C växer den vanligtvis som en äggformad spirande jäst. En mängd olika miljöutlösare, inklusive näringsbrist, pH-förändringar, tillväxt vid 37 ° C, exponering för serum och tillväxt när de är inbäddade i agar, resulterar i övergången till ett polariserat tillväxtmönster, vilket resulterar i bildandet av sanna hyfer och / eller pseudohyfer5. Initieringen av polariserad tillväxt och den resulterande tillväxten av trådformiga organismer kallas morfogenes.
På grund av betydelsen av morfogenes i organismens virulens har regleringen av hyphalbildning studerats omfattande 6,7. Det finns ett komplext nätverk av signalvägar och transkriptionell reglering som utlöser morfogenes. Trots förhållandet mellan C. albicans morfogenes och patogenes, de flesta studier som undersöker morfogenes har använt in vitro-stimuli för att utlösa hyphalbildning. Det blir allt tydligare att de olika in vitro-modellerna av filamentation inte är identiska när det gäller de individuella regleringsvägar som stimuleras. Dessutom motsvarar inga in vitro-tillväxtförhållanden tätt med värdens komplexa miljö. Med tanke på betydelsen av C. albicans som en mänsklig patogen är målet med detta protokoll att undersöka dess morfogenes under aktiv infektion hos en däggdjursvärd med hjälp av ett system med måttlig genomströmning, vilket gör det möjligt för en utredare att screena C. albicans mutantbibliotek.
För att underlätta dessa undersökningar utvecklades ett in vivo-avbildningssystem som gör det möjligt för oss att få bilder med hög rumslig upplösning av C. albicans-celler under infektion av pinna hos en bedövad mus med hjälp av ett inverterat konfokalmikroskop 8,9,10. Eftersom pinnaens hud är ganska tunn kan dessa bilder erhållas utan behov av vävnadsdissektion. Således kan kvantitativa fenotypdata mätas på platsen för aktiva infektioner i värdvävnaden. Protokollet som beskrivs här innefattar omvandling av en referensstam och en eller flera mutanta stammar med olika fluorescerande proteinuttryckskassetter11,12. De fluorescerande proteinuttryckande stammarna blandas sedan och injiceras intradermalt. Efter att infektionen har etablerats används konfokal avbildning för att kvantifiera både filamentationsfrekvensen och längden på de bildade filamenten. De data som erhålls från mutantstammarna normaliseras till de som erhålls från referensstammen, som finns i samma vävnadsregion, vilket ger en intern kontroll. Detta system har gjort det möjligt för oss att framgångsrikt screena flera serier av C. albicans mutanta stammar, varav många har morfogenesdefekter in vitro 9,10. Många av dessa stammar filament lätt in vivo, vilket belyser vikten av in vivo-modeller för undersökning av morfogenes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 coverslips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>20811</td>
			<td>large enough to cover the universal stage opening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 mL Insulin syringes</td>
			<td>EXELint</td>
			<td>26018</td>
			<td>Can use syringes that are 5/16&#34;&#8211;1/2&#34; long and 29&#8211;32 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.7% formaldehyde in dPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBJ5734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol/30% water</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>A05061001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.albicans reference strain and experimental strains</td>
			<td>SN250</td>
			<td>FGSC Online Catalog</td>
			<td>The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyl free mouse chow</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2920x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7050</td>
			<td>Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicator</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>76200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBA2/N (6-12 week old mice)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.&#160; The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.&#160; This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.&#160; It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.&#160; 
			Examples:&#160; 
			https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-40 
			https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174320&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-26 
			https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Must be sterile; open a new container for every experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze pad</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>P157112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel eye lurbicant</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ or FIJI analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ (FIJI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>J119005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8 (SP8)</td>
			<td>The objective lens&#160; (Leica 11506375) used here&#160; is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. 
			The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free&#160; spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. 
			The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific International</td>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair hair remover lotion</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Over the counter depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AB-101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent protein expression transformation constructs&#160; generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensitive laboratory tape</td>
			<td>Tape &#38; Label Graphic Systems Inc</td>
			<td>1007910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 cell culture medium</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>To safely hold the animals ear during injectinos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host

Candida albicans är en viktig mänsklig patogen. Dess förmåga att växla mellan morfologiska former är central för dess patogenes; Dessa morfologiska förändringar regleras av ett komplext signalnätverk som styrs som svar på miljöstimuli. Dessa regulatoriska komponenter har studerats mycket, men nästan alla studier använder en mängd olika in vitro-stimuli för att utlösa filamentation. För att bestämma hur morfogenesen regleras under patogenesprocessen utvecklade vi ett in vivo-mikroskopisystem för att få bilder med hög rumslig upplösning av organismer som genomgår hyphalbildning inom däggdjursvärden. Protokollet som presenteras här beskriver användningen av detta system för att screena små samlingar av C. albicans mutantstammar, så att vi kan identifiera viktiga regulatorer för morfogenes som det inträffar på infektionsstället. Representativa resultat presenteras, vilket visar att vissa regulatorer för morfogenes, såsom transkriptionsregulatorn Efg1, har konsekventa fenotyper in vitro och in vivo, medan andra regulatorer, såsom adenylcyklas (Cyr1), har signifikant olika fenotyper in vivo jämfört med in vitro.

Resultaten som presenteras här är baserade på tidigare publicerade rapporter 9,10. Målet med denna analys är att kvantitativt utvärdera förmågan hos mutanta C. albicans-stammar att genomgå morfogenes under aktiva infektioner. De typiska parametrarna som skiljer pseudohyfer från hyfer kan vara svåra att utvärdera i organismer som växer i tre dimensioner i en komplex in vivo-miljö. Detta gäller särskilt när man tittar på de tvådimensionella tvärsnitt som skapas av konfokal avbildning. Därför är denna screeninganalys inriktad på att identifiera organismer som växer som trådformiga kontra jäst. För uppföljningsstudier med en mer djupgående analys, inklusive tredimensionella rekonstruktioner, kan denna metod anpassas för att diskriminera jäst, hyfer och pseudohyfer.
Uttrycket av ett fluorescerande protein i en referens- eller mutantstam av C. albicans gör det möjligt att enkelt detektera stammorfologi in vivo (figur 3 och figur 4). I allmänhet utförs kvantitativ ljusmikroskopianalys bäst när få eller inga av pixlarna i bilden är mättade. För detta protokoll förenklar dock en mättnad av bilden ofta analysen. Fluorescerande proteinlokalisering är inte enhetlig i hela cellen och är ofta högre i moderjästen än i filament. Lyckligtvis, för undersökningen av morfogenes, definierar den rumsliga fördelningen av signalen, snarare än dess intensitet, resultatet. Att få bilder där många pixlar är mättade förbättrar därför förmågan att kvantifiera morfogenes i denna analys.
För att illustrera vikten av att utvärdera morfogenes in vivo presenteras representativa resultat för referensstammen (SN250) och två mutanter: den ena saknar transkriptionsfaktorn Efg1 och den andra saknar adenylylcyklas Cyr1. In vitro växer ingen av dessa stammar som filament20,21. När referensstammen odlas in vitro i RPMI-medium kompletterat med 10 % serum bildar den snabbt filament, medan efg1ΔΔ- och cyr1ΔΔ-stammarna inte gör det (figur 3 och figur 4). Under dessa förhållanden uppvisar efg1ΔΔ-mutanten något polariserad tillväxt, med dottercellerna något långsträckta jämfört med modercellerna. Detta betonar vikten av att använda en tydlig definition av filamentation. Varje sådan definition är som standard godtycklig, men det är nödvändigt för konsekvent utvärdering av fenotypen. För dessa studier definieras ett trådformigt tillväxtmönster som en organism med den längsta dimensionen av en dottercell mer än dubbelt så stor som modercellens. Med hjälp av denna definition är de långsträckta efg1ΔΔ-cellerna inte trådformiga.
I överensstämmelse med sin in vitro-fenotyp uppvisar efg1 ΔΔ en signifikant filamentationsdefekt in vivo: cirka 9% av efg1ΔΔ-cellerna växte som filament in vivo (Figur 3). Däremot växte 53 % av cyr1ΔΔ-mutantcellerna som filament in vivo (figur 4). Även om antalet cyr1 ΔΔ-mutanta celler som genomgår filamentation in vivo var signifikant lägre än referensstammen, representerar cyr1ΔΔ-mutantens förmåga att bilda filament in vivo en väsentlig förändring från dess fullständiga brist på morfogenes in vitro. Visuellt verkade filamenten som bildades av cyr1ΔΔ-mutanten vara kortare än referensstammen. För att utvärdera detta kvantitativt mättes kurvvägslängden för de trådformiga cellerna med hjälp av en tvådimensionell projektion av in vivo-bilderna (figur 4E). Medianlängden för cyr1ΔΔ-filamenten var 29 % kortare än filamenten i referensstammen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg"> Figur 1: Anestesi och ympning . (A) Induktion av anestesi med hjälp av en induktionskammare. (B) Anestesi upprätthålls med hjälp av en näskon, så att musen kan flyttas efter behov. (C) Hårborttagningskräm appliceras med en bomullsspetsapplikator. Ögonsmörjgel har applicerats för att skydda ögonen under anestesi. (D) Effektivt hårborttagning av höger öra. Jämför med det obehandlade vänstra örat. (E) Intradermal injektion av C. albicans i musörat. Örat hålls på plats med spetsen på ett koniskt rör lindat med dubbelsidig hudtejp (modeband). (F) Närbild av intradermal injektion. En blek bubbla bildas i huden, vilket är ett tecken på en framgångsrik intradermal placering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg"> Figur 2: Förberedelse för avbildning. (A) Mikroskopsteg förberett för avbildning. Narkosnoskonen är säkrad på plats. En täckglas tejpas fast på scenen som täcker linsöppningen. Ytterligare tejpbitar finns tillgängliga. Det uppvärmda steget förvärms till 37 °C (visas inte). (B) Placering av den bedövade musen i anestesinäskonen. (C) Musen roteras något så att den sida av örat som ympades är vänd mot bottenlocket/objektivlinsen. Örat plattas sedan till mot bottenlocket och säkras på plats genom att placera en andra täckskiva ovanpå örat. (D) Den övre täckskivan tejpas fast på scenen för att säkra örat på plats i förhållande till mikroskopsteget. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg"> Figur 3: In vitro- och in vivo-morfologi för efg1ΔΔ-mutantstammen. (A) Widefield-bild av WT- och efg1ΔΔ-mutantstammar efter in vitro-induktion av filamentation av växande celler i RPMI + 10% serum vid 37 °C i 4 timmar. Skalstänger representerar 10 μm. Bildkontrasten justerades med hjälp av fotoredigeringsprogram för att underlätta visning. B) Procentandel in vitro-filamentation som observerats i muterade WT- och EFG1ΔΔ-stammar. Und = omätbar (inga filament detekterades). Barhöjden representerar medianprocenten av trådformiga celler från tre oberoende experiment där minst 100 celler kvantifierades. Felstaplarna anger standardavvikelse (resultat jämfört med elevens t-test, p < 0,001). C) Konfokalmikroskop av WT (grön) och efg1ΔΔ-mutanten (röd) som växer in vivo 24 timmar efter inokulering. Pilar indikerar exempel på efg1ΔΔ-mutanta celler som uppfyller vår definition av "trådformiga". Skalstrecket representerar 50 μm. (D) Procentandel av glödtråden in vivo observerad i WT- och efg1ΔΔ-mutantstammarna. Barhöjden representerar medianprocenten av trådformiga celler från två oberoende experiment. Felstaplarna anger standardavvikelse (resultat jämfört med elevens t-test, p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg"> Figur 4: In vitro- och in vivo-morfologi för cyr1 ΔΔ-mutantstammen. (A) Widefield-bildav cyr1ΔΔ-mutantstammen efter in vitro-induktion av filamentation av växande celler i RPMI + 10% serum vid 37 °C i 4 timmar. Skalstången representerar 10 μm. Bildkontrasten justerades med hjälp av fotoredigeringsprogram för att underlätta visning. B) Procentandel in vitro-filamentation som observerats i mutantstammarna WT och cyr1ΔΔ. Und = omätbar (inga filament detekterades). Barhöjden representerar medianprocenten av trådformiga celler från tre oberoende experiment där minst 100 celler kvantifierades. Felstaplarna anger standardavvikelse (resultat jämförda med elevens t-test, p < 0,001). C) Konfokalmikroskop av WT (grön) och cyr1ΔΔ-mutanten (röd) som växer in vivo 24 timmar efter inokulering. Skalstrecket representerar 50 μm. D) Procentandel filamentation in vivo som observerats i muterade stammarna WT och cyr1ΔΔ. Barhöjden representerar medianprocenten av trådformiga celler från två oberoende experiment. Felstaplarna anger standardavvikelse (resultat jämfört med elevens t-test, p < 0,001). (E) Fördelning av glödtrådens längd in vivo, mätt som kurvbanans längd i en tvådimensionell projektion av z-stacken. Varje punkt representerar längden på en glödtråd. Celler som växer som jäst ingick inte i denna analys. Stapeln anger medianlängden på filamentet. Fördelningen av längder är signifikant annorlunda när den analyseras med hjälp av ett Mann-Whitney U-test (p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Detta manuskript beskriver en metod för screening av måttligt stora Candida albicans mutantbibliotek för morfogenesfenotyper under aktiv infektion hos en däggdjursvärd med hjälp av icke-invasiv konfokalmikroskopi.

Användning av in vivo-avbildning för att screena för morfogenesfenotyper i Candida albicans mutanta stammar under aktiv infektion hos en däggdjursvärd

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

Candida albicans morfogenes utlöses av en myriad av miljösignaler. Genom att studera morfogenes in vivo bestämmer vi hur organismen integreras och svarar på alla dessa miljösignaler. Den största fördelen med denna teknik är att den tillåter oss att studera morfogenes i frånvaro av bias eller artefakter som kan introduceras med hjälp av in vitro-modellsystem.Mycket få människor har erfarenhet av intradermala injektioner. Jag rekommenderar starkt att någon som är ny på denna teknik kontaktar sin djurresursveterinär för att få hjälp med att lära sig den. Demonstrerar proceduren kommer att vara Rohan Wakade, en postdoktor från vår laboratoriegrupp.Börja med att förbereda djuret för ympning genom att mata klorofyllfri chow i minst sju dagar före ympning. En dag före injektion, ta en klick kanada albicans celler från en koloni med hjälp av en tandpetare. Inokulera 25 ml YPD och upprepa denna process flera gånger för att erhålla celler från flera olika kolonier.Inkubera kulturen över natten vid 30 grader Celsius i en orbital shaker-inkubator vid 175 rpm. Centrifugera en milliliter kultur i två minuter vid 500 x g, tvätta sedan jästen tre gånger med en milliliter steril DPBS. Återsuspendera pelleten i en milliliter steril DPBS och späd kulturen vid 1 till 100.Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och justera följaktligen celldensiteten. Skapa sedan inokulatet för injektion genom att blanda lika stora volymer av den refererade och experimentella stammen. Använd en bomullspinne och applicera en receptfri hårborttagningskräm på den inre och yttre ytan av båda öronen på ett bedövat djur.Torka försiktigt örat efter två till tre minuter med en torr gasbindning följt av gasbindor mättade i sterilt vatten för att noggrant avlägsna hårborttagningskrämrester. Efter sterilisering av öronytan med 70% etanol, blanda inokulumbrunnen genom att invertera injektionsflaskan flera gånger eller virvla den. Dra 20 till 30 mikroliter inokulum i en insulinspruta.Håll nålen i upprätt läge och knacka försiktigt på sprutan för att säkerställa att eventuell luft i pipan är överst. Mata försiktigt ut luft och överskott av inokulum tillbaka i inokulumröret eller ett avfallsrör så att kolven är vid 10 mikrolitermärket. Applicera över disk dubbelsidig hudtejp på ett litet koniskt eller rundbottnat plaströr och drapera örat över tejpen, undvik att lossa anestesinäskonen.Håll sprutnålen nästan parallell med huden och undvik stora vener, sätt in nålspetsen i det yttersta lagret av huden tills avfasningen bara är täckt och injicera långsamt inokulumet intradermalt. En bra intradermal injektion kommer att höja en liten bubbla i huden. Håll nålen på plats i 15 till 20 sekunder innan du tar bort den från örat för att minimera läckage.Efter institutionella protokoll, märk buren med biohazard-etiketter som indikerar att djur i buren är infekterade med Candida albicans. Med hjälp av samma tvättade kulturer som användes för att framställa inokulumet skapar du en 1 till 50 utspädning av celler i RPMI 1640, kompletterad med 10% värme och aktiverat fostervin serum och inkuberar vid 37 grader Celsius med tumling i fyra timmar. Undersök provet med ett mikroskop.Räkna minst 100 celler och registrera antalet jäst- och trådformiga celler för varje stam. Vrid målet för långa arbetsavstånd på plats och placera en droppe nedsänkningsvätska på linsen. Sänk linsen för att undvika eventuella skador när du placerar locket.Placera nummer 1,5 lock glida över scenöppningen och tejpa fast den på plats. Höj målet så att nedsänkningsvätskan är i kontakt med både objektivlinsen och lockets glidning. Säkra en anestesinoskon på mikroskopstadiet på ett sådant sätt att den täcker djurets näsa helt när den är på plats för avbildning.Placera näsan på en bedövad mus i näskonen. Placera en droppe sterilt vatten på lockets glid ovanför objektivlinsen. Justera anestesin näskon och placera musen så att musens öra ligger ovanför vattendroppen.Ta en annan täckglidning och placera täckslipens kant parallellt med musens kropp med kanten som rör vid musen där örat möter huvudet. Använd en gångjärnsrörelse och sänk den fria kanten på locket till mikroskopsteget. När locket glider mot mikroskopsteget kommer det att platta ut örat.Tejpa fast topplocket ordentligt för att hålla precis tillräckligt med tryck för att hålla örat plant och undvika att fånga musens hår eller morrhår i tejpen. Om inte ett mikroskop med en miljökammare används, täck löst musens kropp med ett sterilt draperi för att upprätthålla en normal termisk miljö. Med hjälp av vitt ljus, widefield imaging, justera fokusplanet i öronvävnaden och fokusera på de röda blodkropparna som rör sig i blodkärlen.För att få ett tillräckligt starkt signal-brusförhållande så att morfologin kan bestämmas för alla celler i synfältet, justera lasereffekten eller bildhastigheten. För att undvika vävnadsskador, använd lägsta möjliga lasereffekt. Välj ett synfält med tydlig glödtrådsbildning i den refererade stammen och där de flesta organismer är tillräckligt utspridda för att deras morfologi ska kunna bestämmas.Ställ in de övre och nedre planen med fokus för en Z-stack. Det är inte nödvändigt att täcka hela djupet av det infekterade området, men kom ihåg att organismer längst upp eller längst ner på den avbildade volymen vanligtvis utesluts från analysen. Skaffa Z-stackbilder, pseudofärg varje kanal för att skilja varje stam och överlagra kanalerna.Spara bilderna. Använd bildprogramvara för att utföra en maximal projektion av Z-stacken till en tvådimensionell bild. Räkna varje organism som ses i de maximala projektionsbilderna efter stamtyp och morfologi.Den refererade stammen bildar snabbt filament in vitro. Medan EFG1 Null misslyckades med att bilda filamenten. EFG1 Null uppvisar också en betydande filamentationsdefekt in vivo.Cirka 9% av EFG1 Null-cellerna växte som filament in vivo. På samma sätt visade CYR1 Null-mutantstammen en filamentationsdefekt in vitro jämfört med den refererade stammen. Däremot växte 53% av CYR1 Null-mutantcellerna som filament in vivo.Filamenten som bildades av CYR1 Null-mutanten var kortare än den refererade stammen. Det är viktigt att hålla nålen parallell med huden under ympningen. Målet är att placera inokulumet strax under det yttre lagret av huden.Denna teknik kan också användas med musstammar som uttrycker ett fluorescerande protein i värdceller av intresse så att vi kan studera värdpatogeninteraktioner in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo avbildning av Transgena Leishmania parasiter i ett Live-värd

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Icke-invasiv avbildning av Leukocyt Homing och migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Användning av artificiell Sputum Medium för att testa antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I villkor som är mer relevanta för cystisk fibros Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studera Microbial gemenskaperna<em&gt; In Vivo</em&gt;: En modell av Host-medierad interaktion mellan<em&gt; Candida albicans</em&gt; Och<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel och effektiv strategi för att konstruera Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Undersökning av värd Fenotyper i<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Efter antibiotikabehandling

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Imaging Cell interaktion i luftrör slemhinna under influensa virusinfektion med två-photon Intravital mikroskopi

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Förtydligande och Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

En Ex vivo-analys att studera Candida albicans Hyphal Morphogenesis i mag-tarmkanalen

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Återkommande Escherichia coli urinvägsinfektion utlöst av Gardnerella vaginalis urinblåsans exponering hos möss

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...