Name: use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Bu çalışma NIH hibe 1R01AI33409 ve Iowa Üniversitesi Carver Tıp Fakültesi, Pediatri Bölümü tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Lopes, J. P., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+virulence+of+Candida+albicans.">Pathogenesis and virulence of Candida albicans.</a> Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+control+of+cell+morphology+in+vivo+reveals+distinct+roles+for+yeast+and+filamentous+forms+of+Candida+albicans+during+infection.">Engineered control of cell morphology in vivo reveals distinct roles for yeast and filamentous forms of Candida albicans during infection.</a> Eukaryotic Cell. 2 (5), 1053-1060 (2003).</li><li>Arita, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+associated+proteins+involved+in+filamentation+with+impact+on+the+virulence+of+Candida+albicans.">Cell wall associated proteins involved in filamentation with impact on the virulence of Candida albicans.</a> Microbiological Research. 258, 126996 (2022).</li><li>Rai, L. S., Wijlick, L. V., Bougnoux, M. E., Bachellier-Bassi, S., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+commensal+and+pathogenic+life-styles+of+an+opportunistic+fungus-Candida+albicans.">Regulators of commensal and pathogenic life-styles of an opportunistic fungus-Candida albicans.</a> Yeast. 38 (4), 243-250 (2021).</li><li>Sudbery, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Candida+albicans+hyphae.">Growth of Candida albicans hyphae.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).</li><li>Basso, V., d'Enfert, C., Znaidi, S., Bachellier-Bassi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+genes+to+networks:+The+regulatory+circuitry+controlling+candida+albicans+morphogenesis.">From genes to networks: The regulatory circuitry controlling candida albicans morphogenesis.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 422, 61-99 (2019).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+Candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in Candida species.</a> Elife. 10, 64682 (2021).</li><li>Mitra, S., Dolan, K., Foster, T. H., Wellington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+morphogenesis+of+Candida+albicans+during+infection+in+a+live+animal.">Imaging morphogenesis of Candida albicans during infection in a live animal.</a> Journal of Biomedical Optics. 15 (1), 010504 (2010).</li><li>Wakade, R. S., Huang, M., Mitchell, A. P., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+Candida+albicans+identifies+differential+in+vitro+and+in+vivo+filamentation+phenotypes+for+transcription+factor+deletion+mutants.">Intravital imaging of Candida albicans identifies differential in vitro and in vivo filamentation phenotypes for transcription factor deletion mutants.</a> mSphere. 6 (3), 0043621 (2021).</li><li>Wakade, R. S., Kramara, J., Wellington, M., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+filamentation+does+not+require+the+cAMP-PKA+pathway+in+vivo.">Candida albicans filamentation does not require the cAMP-PKA pathway in vivo.</a> mBio. 13 (3), 0085122 (2022).</li><li>Bergeron, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Pseudomonas+aeruginosa+interact+to+enhance+virulence+of+mucosal+infection+in+transparent+zebrafish.">Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa interact to enhance virulence of mucosal infection in transparent zebrafish.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 00475 (2017).</li><li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+and+filaments+have+specialized,+independent+activities+in+a+zebrafish+model+of+Candida+albicans+infection.">Yeast and filaments have specialized, independent activities in a zebrafish model of Candida albicans infection.</a> Infection and Immunity. 86 (10), 00415-00418 (2018).</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 6th edition Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html">https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html</a> (2020)</li><li>Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phenotypic+profile+of+the+Candida+albicans+regulatory+network.">A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network.</a> Plos Genetics. 5 (12), 1000783 (2009).</li><li>Cullen, P. J., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+filamentous+growth+in+yeast.">The regulation of filamentous growth in yeast.</a> Genetics. 190 (1), 23-49 (2012).</li><li>Herrero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+filament+formation+in+Candida+albicans+by+polyamine+levels.">Control of filament formation in Candida albicans by polyamine levels.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4870-4878 (1999).</li><li>Ahmad Hussin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+auxotrophy+and+biotin+enhanced+germ+tube+formation+in+Candida+albicans.">Biotin auxotrophy and biotin enhanced germ tube formation in Candida albicans.</a> Microorganisms. 4 (3), 37 (2016).</li><li>Nantel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+profiling+of+Candida+albicans+cells+undergoing+the+yeast-to-hyphal+transition.">Transcription profiling of Candida albicans cells undergoing the yeast-to-hyphal transition.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3452-3465 (2002).</li><li>Noble, S. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strains+and+strategies+for+large-scale+gene+deletion+studies+of+the+diploid+human+fungal+pathogen+Candida+albicans.">Strains and strategies for large-scale gene deletion studies of the diploid human fungal pathogen Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 4 (2), 298-309 (2005).</li><li>Glazier, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EFG1,+Everyone's+favorite+gene+in+Candida+albicans:+A+comprehensive+literature+review.">EFG1, Everyone's favorite gene in Candida albicans: A comprehensive literature review.</a> Frontiers in Cellular Infection and Microbiology. 12, 855229 (2022).</li><li>Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+and+diverse+regulation+of+the+Ras/cAMP/protein+kinase+A+pathway+in+Candida+albicans.">Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans.</a> Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).</li><li>Saville, S. P., Lazzell, A. L., Chaturvedi, A. K., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+genetically+engineered+strain+to+evaluate+the+pathogenic+potential+of+yeast+cell+and+filamentous+forms+during+Candida+albicans+systemic+infection+in+immunodeficient+mice.">Use of a genetically engineered strain to evaluate the pathogenic potential of yeast cell and filamentous forms during Candida albicans systemic infection in immunodeficient mice.</a> Infection and Immunity. 76 (1), 97-102 (2008).</li><li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth.">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryotic Cell. 10 (7), 932-944 (2011).</li><li>Brothers, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase-driven+phagocyte+recruitment+controls+Candida+albicans+filamentous+growth+and+prevents+mortality.">NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003634 (2013).</li><li>Holmes, H., Kennedy, J. C., Pottier, R., Rossi, R., Weagle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recipe+for+the+preparation+of+a+rodent+food+that+eliminates+chlorophyll-based+tissue+fluorescence.">A recipe for the preparation of a rodent food that eliminates chlorophyll-based tissue fluorescence.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B: Biology. 29 (2-3), 199 (1995).</li></ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Bu model, bir memeli konağının dokusu içinde büyürken C. albicans organizmalarının görüntülerini elde etmek için konfokal mikroskopi kullanır, böylece aktif enfeksiyon sırasında morfogenez fenotiplerini değerlendirmemize izin verir. Morfogenez süreci C. albicans patogenezinin merkezindedir ve çeşitli in vitro tahliller 2,3,4 kullanılarak yaygın olarak incelenmiştir. Bununla birlikte, hiçbir in vitro test, konağın karmaşık biyokimyasal ve yapısal ortamını tam olarak modelleyemez.
Burada açıklanan protokol, enfeksiyon sırasında morfogenezde rol oynayan genleri tanımlamak için C. albicans mutantlarının bir serisini / kütüphanesini taramak için bu in vivo görüntüleme sisteminin kullanımına odaklanmıştır. Farklı floresan proteinleri ifade eden C. albicans suşlarının kullanımı, C. albicans mutant suşlarının in vivo morfogenezini referans suşunkine kıyasla ölçmemizi sağlar. Mutanttaki morfogenezi aynı enfeksiyon alanındaki referans suşu ile karşılaştırmak, organizmaların aynı ortamlara maruz kalmasını sağlar. Bu, filamentasyona tabi tutulan hücrelerin yüzdesinin ve filamentasyonun kapsamının nicel olarak ölçülmesini sağlar. Mutant suş(lar)ın ölçümlerinin referans suşunkilerle normalleştirilmesi, bir mutantın performansını diğeriyle daha iyi karşılaştırmamızı sağlar.
Burada sunulan temsili sonuçlar, in vitro ve in vivo fenotipler arasında önemli bir tutarsızlık potansiyelini göstermektedir. C. albicans efg1ΔΔ mutant suşu genellikle morfogenez testleri için negatif bir kontrol olarak kullanılır, çünkü hemen hemen tüm in vitro koşullarda filament yapamaz20. İn vivo sonuçlar in vitro sonuçlara çok benzer olmasına rağmen, bu ciddi şekilde engellenmiş suş bile zaman zaman konakçı doku ortamında filamentler oluşturmuştur (Şekil 3). Bu, morfogenezi tetiklemede konakçı ortamın gücünü vurgular.
Buna karşılık, cyr1ΔΔ mutant suşu, in vitro ve in vivo büyüme arasında önemli bir uyumsuzluk gösterir; mutant hücrelerin hiçbiri in vitro filamentasyona uğramasa da, hücrelerin yaklaşık yarısı in vivo filamentler halinde büyür (Şekil 4)10,21. İlginç bir şekilde, bu filamentler referans suşu tarafından oluşturulanlardan önemli ölçüde daha kısaydı, bu da CYR1'in filament büyüme hızına veya filamentli bir fenotipi sürdürme yeteneğine katkıda bulunduğunu düşündürmektedir. Filament uzunluğunun analizini kolaylaştırmak için, filamentlerin eğri yol uzunluğu, görüntülerin iki boyutlu bir projeksiyonu kullanılarak ölçülmüştür. Üç boyutlu büyüyen filamentlerin iki boyutlu projeksiyonlarında, xy düzlemine paralel olmayan bir eksende büyüyen herhangi bir filament, gerçek uzunluğundan daha kısa olarak yansıtılacaktır. Bu ön kısalma, referans suşu için de meydana geldiğinden, filament uzunluklarının iki boyutlu bir projeksiyondaki dağılımını değerlendirmek, referans ve mutant suşlar arasında nicel bir karşılaştırmaya izin verir. Filament uzunluğunun üç boyut yerine iki boyutta analizi daha az yoğun görüntü analizi gerektirir; Böylece, tipik bir masaüstü bilgisayarda nispeten hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Bu daha basit analizin kullanılması, filament uzunluğu dağılımının bir tarama protokolünün bir parçası olarak dahil edilmesine izin verir ve her mutantın verimde önemli gecikmelere neden olmadan morfogenez geçirme kabiliyetinin daha nüanslı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.
Burada sunulan temsili çalışmalar, kompleman sistemlerinde nötrofillerin C. albicans enfeksiyonu22 bölgesine alınamamasına neden olan bir kusuru olan DBA2 / N fareleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmaların amacı, konakçı doku içinde C. albicans filamentasyonunun regülasyon mekanizmalarını araştırmaktır. Bu nedenle, DBA2 / N fareleri, bireysel bir suşun nötrofillere duyarlılığı veya direnci nedeniyle sonuçların karıştırılmasını önlemek için kullanılmıştır. Nötrofil anti-C. albicans yanıtı filamentasyon23'ü etkileyebildiğinden, enfeksiyon bölgesine nötrofil alımı bir morfogenez testinin sonuçlarını etkileyebilir. Bir suş in vivo filamentleme yeteneğine sahipse, ancak nötrofiller mevcut olduğunda filamentasyondan güçlü bir şekilde inhibe edilirse, DBA2 / N farelerde filamentasyon tespit edilir, ancak bozulmamış nötrofil kemotaksisli fareler kullanılırken görülmesi olası değildir. Bu nedenle, konakçı olarak kullanılan farenin gerginliği, bu protokolü kullanırken önemli bir faktördür.
Efg1ΔΔ mutant suşunun in vivo filamentte başarısız olduğu gözleminin, konakçı nötrofil tepkileriyle ilişkili olması muhtemel değildir, çünkü bu suş da in vitro filamentte başarısız olur. Cyr1ΔΔ suşu ile in vivo olarak gözlenen filamentasyon, in vitro filamentasyona uymaması nedeniyle uyumsuzdur. C. albicans enfeksiyonunun zebra balığı modelinden elde edilen veriler, yanıt veren nötrofillerin morfogenez24'ün önlenmesinde önemli olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, nötrofil yanıtlarından yoksun olan DBA2 / N farelerinin kullanımının, in vitro'ya kıyasla cyr1ΔΔ'nun in vivo filamentasyonundaki artışı hesaba katması muhtemel değildir. Bununla birlikte, in vivo ortam, cyr1ΔΔ suşunun morfogenezini açıkça etkilemektedir; Bu nedenle, bu suşun daha fazla araştırılması, aktif enfeksiyonlar sırasında C. albicans morfogenezinin düzenlenmesi hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Burada açıklanan protokol, gelecekteki çalışmalarda kullanılacak cyr1ΔΔ suşu gibi suşları tanımlamak için bir tarama testi olarak tasarlanmıştır.
Düşük akışlı gaz anestezi sisteminin kullanılması bu protokol için çok yararlıdır (Şekil 1A,B). Bu protokolün ilk gelişimi sırasında, fareler ksilazin ile karıştırılmış enjekte edilebilir bir ketamin anestezik kokteyli kullanılarak anestezi altına alındı. Bu anestezik yöntemle sınırlı görüntüleme yapmak mümkün olsa da, anestezi süresi tahmin edilemezdi, bu da görüntüleme sırasında farenin anesteziden iyileşmesini önlemek için görüntüleme seanslarının hızlı bir şekilde sonlandırılmasını gerektiriyordu. Geleneksel inhale anestezik sistemler hantaldır ve genellikle bir duman davlumbazında kullanılmalarını gerektiren yüksek oranda anestezik gaz akışı gerektirir. Bu nedenle, geleneksel inhale anestezik sistemlerin, araştırmacıları yanlışlıkla anestezik ajanlara maruz bırakmadan konfokal bir mikroskobun alan kısıtlamaları ile kullanılması çok zor olacaktır. Düşük akışlı inhale anestezik sistemin kullanılması, araştırmacı için güvenli bir ortam sağlarken hayvanın tutarlı anestezisine izin verir. Düşük akışlı burun konisi, hayvanın hem aşılama hem de mikroskopi için kolay konumlandırılmasını sağlar. Küçük kalibreli, düşük hacimli dağıtım borusu, anestezi makinesinin mikroskopiye müdahale etmemek için yeterli bir mesafeye yerleştirilmesini sağlayan nispeten uzun tüplerin kullanılmasına izin verir.
Tipik fare chow'unda bulunan klorofil, önemli doku otofloresansına yol açar25. Bu, görüntülerde önemli miktarda parazit oluşturarak yüksek kaliteli, yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntüler elde etmeyi zorlaştırır. Hayvanlara görüntülemeden önceki 7 gün boyunca klorofil içermeyen chow beslendiğinde, otofloresanın arka planı dokuda önemli ölçüde azaldı, ancak saçta biriken klorofil sorunlu olmaya devam etti. Reçetesiz satılan kimyasal tüy dökücü krem kullanılarak pinnadaki saçların çıkarılması, saçtaki otofloresansı en aza indirmede etkilidir (Şekil 1C,D). Böylece, klorofil içermeyen chow ve yeterli epilasyon kombinasyonu, otofloresanı önemli ölçüde azalttı ve görüntü kalitesini önemli ölçüde artırdı. Görüntüleme öncesinde saçlar kulaktan çıkarıldığı için hayvanın saçının rengi bu sistemi etkilemez. Bu protokol, BALB / c (beyaz), C57BL / 6 (siyah) ve DBA2 / N (kahverengi) farelerde C. albicans enfeksiyonlarını incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Protokol, çeşitli konakçı genlerinde eksik olan C57BL / 6 nakavt fareleri ile de kullanılabilir; Bu, memeli konakçı bağışıklık sisteminin filamentasyonu nasıl etkilediğine dair gelecekteki araştırmalara izin verecektir. Bu modelin bu protokolde tartışılmayan bir özelliği, bu görüntüleme sistemi invaziv olmadığı için, aynı hayvanın birkaç gün boyunca tekrar tekrar görüntülenebilmesi ve zaman içinde bireysel enfeksiyonun ilerlemesini takip etmesine izin vermesidir. Bu özellik, konakçı-patojen etkileşimi üzerine gelecekteki çalışmalarda önemli bir rol oynayacaktır.
Özetle, bu protokol, canlı bir memeli konağının dokusunda büyüyen C. albicans'ın yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntüleriyle sonuçlanır ve mutant suşlarda morfogenezin doğru bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır 8,9,10. Burada sunulan sonuçlar, bu protokolün C. albicans mutantlarının bir kütüphanesini taramak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bugüne kadar test edilen C. albicans mutantlarından, in vitro morfogenezde bilinen kusurları olan mutantların büyük bir kısmı kolayca in vivo 9,10 filamentasyona uğrar. Bu, C. albicans patogenezinin mekanizmalarını aydınlatmak için tasarlanmış deneylere bunun gibi bir in vivo sistemin dahil edilmesinin önemini vurgulamaktadır.

Candida albicans, mukokutanöz hastalığa, yayılmış hastalığa ve lokalize doku enfeksiyonlarına neden olan yaygın bir insan mantar patojenidir1. C. albicans fizyolojisinin önemli bir özelliği, hem kommensal hem de patojen 2,3,4 olarak rolüyle bağlantılı olan karmaşık polimorfik büyümesidir. 30 ° C'de in vitro zengin besin koşulları altında, tipik olarak oval tomurcuklanan bir maya olarak büyür. Besin yoksunluğu, pH değişiklikleri, 37 ° C'de büyüme, seruma maruz kalma ve agar'a gömüldüğünde büyüme dahil olmak üzere çeşitli çevresel tetikleyiciler, polarize bir büyüme modeline geçişle sonuçlanır ve gerçek hiflerin ve / veya psödohifaların oluşumuna neden olur5. Polarize büyümenin başlaması ve bunun sonucunda filamentli organizmaların büyümesi morfogenez olarak adlandırılır.
Morfogenezin organizmanın virülansındaki önemi nedeniyle, hifal oluşumunun düzenlenmesi kapsamlı bir şekilde incelenmiştir 6,7. Morfogenezi tetikleyen karmaşık bir sinyal yolları ve transkripsiyonel düzenleme ağı vardır. C. albicans morfogenezinin patogenez ile ilişkisine rağmen, morfogenezi araştıran çoğu çalışmada hifal oluşumunu tetiklemek için in vitro uyaranlar kullanılmıştır. Çeşitli in vitro filamentasyon modellerinin, uyarılan bireysel düzenleyici yollar açısından aynı olmadığı giderek daha açık hale gelmektedir. Ayrıca, in vitro büyüme koşulları, konağın karmaşık ortamına sıkı sıkıya karşılık gelmez. C. albicans'ın bir insan patojeni olarak önemi göz önüne alındığında, bu protokolün amacı, bir memeli konakçısında aktif enfeksiyon sırasında morfogenezini orta derecede verime sahip bir sistem kullanarak araştırmak ve böylece bir araştırmacının C. albicans mutant kütüphanelerini taramasına izin vermektir.
Bu araştırmaları kolaylaştırmak için, ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop 8,9,10 kullanılarak anestezi uygulanmış bir farenin pinnasının enfeksiyonu sırasında C. albicans hücrelerinin yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntülerini elde etmemizi sağlayan bir in vivo görüntüleme sistemi geliştirilmiştir. İğnenin derisi oldukça ince olduğu için doku diseksiyonuna gerek kalmadan bu görüntüler elde edilebilir. Böylece, kantitatif fenotip verileri, konakçı doku içindeki aktif enfeksiyonların bulunduğu yerde ölçülebilir. Burada açıklanan protokol, bir referans suşun ve farklı floresan protein ekspresyon kasetleri11,12 ile bir veya daha fazla mutant suşun dönüşümünü içerir. Floresan protein eksprese eden suşlar daha sonra karıştırılır ve intradermal olarak birlikte enjekte edilir. Enfeksiyon kurulduktan sonra, hem filamentasyon sıklığını hem de oluşan filamentlerin uzunluğunu ölçmek için konfokal görüntüleme kullanılır. Mutant suşlardan elde edilen veriler, aynı doku bölgesinde bulunan referans suştan elde edilene normalleştirilerek iç kontrol sağlanır. Bu sistem, birçoğu in vitro 9,10 morfogenez defektlerine sahip birkaç dizi C. albicans mutant suşunu başarıyla taramamızı sağlamıştır. Bu suşların birçoğu in vivo olarak kolayca filament yaparak, morfogenezin araştırılması için in vivo modellerin önemini vurgulamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 coverslips</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>20811</td>
			<td>large enough to cover the universal stage opening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 mL Insulin syringes</td>
			<td>EXELint</td>
			<td>26018</td>
			<td>Can use syringes that are 5/16&#34;&#8211;1/2&#34; long and 29&#8211;32 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.7% formaldehyde in dPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBJ5734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol/30% water</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>A05061001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.albicans reference strain and experimental strains</td>
			<td>SN250</td>
			<td>FGSC Online Catalog</td>
			<td>The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyl free mouse chow</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2920x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7050</td>
			<td>Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicator</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>76200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBA2/N (6-12 week old mice)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.&#160; The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.&#160; This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.&#160; It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.&#160; 
			Examples:&#160; 
			https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-40 
			https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174320&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-26 
			https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&#38;keywords 
			=fashion+tape&#38;qid=1649174406&#38;sprefix= 
			fashion+tape%2Caps%2C70&#38;sr=8-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Must be sterile; open a new container for every experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze pad</td>
			<td>Pro Advantage</td>
			<td>P157112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel eye lurbicant</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ or FIJI analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ (FIJI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>J119005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8 (SP8)</td>
			<td>The objective lens&#160; (Leica 11506375) used here&#160; is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. 
			The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free&#160; spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. 
			The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific International</td>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair hair remover lotion</td>
			<td>local pharmacy or grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Over the counter depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AB-101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent protein expression transformation constructs&#160; generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensitive laboratory tape</td>
			<td>Tape &#38; Label Graphic Systems Inc</td>
			<td>1007910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 cell culture medium</td>
			<td>Gibco / Thermo-Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>To safely hold the animals ear during injectinos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of in vivo imaging to screen for morphogenesis phenotypes in candida albicans mutant strains during active infection in a mammalian host

Candida albicans önemli bir insan patojenidir. Morfolojik formlar arasında geçiş yapabilme yeteneği, patogenezinin merkezindedir; Bu morfolojik değişiklikler, çevresel uyaranlara yanıt olarak kontrol edilen karmaşık bir sinyal ağı tarafından düzenlenir. Bu düzenleyici bileşenler oldukça çalışılmıştır, ancak hemen hemen tüm çalışmalar filamentasyonu tetiklemek için çeşitli in vitro uyaranlar kullanmaktadır. Patogenez sürecinde morfogenezin nasıl düzenlendiğini belirlemek için, memeli konakçısında hifal oluşumu geçiren organizmaların yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için bir in vivo mikroskopi sistemi geliştirdik. Burada sunulan protokol, bu sistemin C. albicans mutant suşlarının küçük koleksiyonlarını taramak için kullanımını açıklamakta ve enfeksiyon bölgesinde meydana gelen morfogenezin anahtar düzenleyicilerini tanımlamamıza izin vermektedir. Transkripsiyonel regülatör Efg1 gibi bazı morfogenez düzenleyicilerinin in vitro ve in vivo tutarlı fenotiplere sahip olduğunu, oysa adenil siklaz (Cyr1) gibi diğer düzenleyicilerin in vitro'ya kıyasla in vivo olarak anlamlı derecede farklı fenotiplere sahip olduğunu gösteren temsili sonuçlar sunulmuştur.

Burada sunulan sonuçlar daha önce yayınlanmış 9,10 raporlarına dayanmaktadır. Bu analizin amacı, mutant C. albicans suşlarının aktif enfeksiyonlar sırasında morfogeneze maruz kalma yeteneğini nicel olarak değerlendirmektir. Psödohifaları hiflerden ayıran tipik parametrelerin, kompleks bir in vivo ortamda üç boyutlu büyüyen organizmalarda değerlendirilmesi zor olabilir. Bu, özellikle konfokal görüntüleme tarafından oluşturulan iki boyutlu kesitlere bakıldığında geçerlidir. Bu nedenle, bu tarama analizi, mayaya karşı filamentli olarak büyüyen organizmaları tanımlamaya odaklanmıştır. Üç boyutlu rekonstrüksiyonlar da dahil olmak üzere daha derinlemesine bir analiz kullanan takip çalışmaları için, bu yöntem maya, hifaj ve psödohifaları ayırt etmek için uyarlanabilir.
Bir floresan proteinin C. albicans'ın bir referans veya mutant suşunda ekspresyonu, in vivo olarak gerinim morfolojisinin doğrudan tespit edilmesini sağlar (Şekil 3 ve Şekil 4). Genel olarak, nicel ışık mikroskobu analizi, görüntüdeki piksellerin çok azı veya hiçbiri doygun olmadığında en iyi şekilde gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu protokol için, görüntünün doygunluğu genellikle analizi basitleştirir. Floresan protein lokalizasyonu hücre boyunca homojen değildir ve genellikle ana mayada filamentlerden daha yüksektir. Neyse ki, morfogenezin araştırılması için, sinyalin yoğunluğundan ziyade uzamsal dağılımı sonucu tanımlar. Bu nedenle, birçok pikselin doygun olduğu görüntülerin elde edilmesi, bu tahlilde morfogenezi ölçme yeteneğini geliştirir.
Morfogenezin in vivo olarak değerlendirilmesinin önemini göstermek için, referans suşu (SN250) ve iki mutant için temsili sonuçlar sunulmuştur: biri transkripsiyon faktörü Efg1'den yoksun ve diğeri adenilil siklaz Cyr1'den yoksundur. In vitro, bu suşların hiçbiri filamentler20,21 olarak büyümez. % 10 serum ile desteklenmiş RPMI ortamında in vitro olarak yetiştirildiğinde, referans suş hızla filamentler oluştururken, efg1ΔΔ ve cyr1ΔΔ suşları oluşmaz (Şekil 3 ve Şekil 4). Bu koşullar altında, efg1ΔΔ mutantı biraz polarize büyüme gösterir, yavru hücreler ana hücrelere kıyasla hafifçe uzar. Bu, filamentasyonun net bir tanımını kullanmanın önemini vurgulamaktadır. Böyle bir tanım varsayılan olarak keyfidir, ancak fenotipin tutarlı bir şekilde değerlendirilmesi için gereklidir. Bu çalışmalar için, filamentli bir büyüme paterni, bir yavru hücrenin en uzun boyutuna ana hücrenin iki katından daha fazla olan bir organizma olarak tanımlanmaktadır. Bu tanımı kullanarak, uzatılmış efg1ΔΔ hücreleri filamentli değildir.
İn vitro fenotipiyle tutarlı olarak, efg1 ΔΔ in vivo olarak önemli bir filamentasyon defekti sergiler: efg1ΔΔ hücrelerinin yaklaşık% 9'u in vivo filamentler olarak büyüdü (Şekil 3). Buna karşılık, cyr1ΔΔ mutant hücrelerinin% 53'ü in vivo filamentler olarak büyüdü (Şekil 4). İn vivo filamentasyona uğrayan cyr1 ΔΔ mutant hücrelerinin sayısı referans suşundan önemli ölçüde daha düşük olmasına rağmen, cyr1ΔΔ mutantının in vivo filamentler oluşturma yeteneği, in vitro morfogenezin tamamen eksikliğinden önemli bir değişikliği temsil eder. Görsel olarak, cyr1ΔΔ mutantı tarafından oluşturulan filamentlerin referans suşundan daha kısa olduğu ortaya çıktı. Bunu nicel olarak değerlendirmek için, filamentli hücrelerin eğri yol uzunluğu, in vivo görüntülerin iki boyutlu bir projeksiyonu kullanılarak ölçülmüştür (Şekil 4E). Kir1 ΔΔ filamentlerinin medyan uzunluğu, referans suşun filamentlerinden% 29 daha kısaydı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg"> Şekil 1: Anestezi ve aşılama . (A) Bir indüksiyon odası kullanılarak anestezi indüksiyonu. (B) Anestezi, farenin gerektiği gibi yeniden konumlandırılmasına izin veren bir burun konisi kullanılarak sürdürülür. (C) Epilasyon kremi pamuk uçlu aplikatör kullanılarak uygulanır. Göz yağlama jeli, anestezi sırasında gözleri korumak için uygulanmıştır. (D) Sağ kulağın etkili epilasyonu. Tedavi edilmeyen sol kulakla karşılaştırın. (E) C. albicans'ın fare kulağına intradermal enjeksiyonu. Kulak, çift taraflı cilt bandı (moda bandı) ile sarılmış konik bir tüpün ucu kullanılarak yerinde tutulur. (F) İntradermal enjeksiyonun yakın çekimi. Deride soluk bir kabarcık oluşur, bu da başarılı bir intradermal yerleşimin bir işaretidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg"> Şekil 2: Görüntüleme için hazırlık . (A) Görüntüleme için hazırlanan mikroskop aşaması. Anestezi burun konisi yerine sabitlenir. Lens açıklığını kaplayan sahne alanına bir kapak kayması bantlanır. Ek bant parçaları mevcuttur. Isıtılmış aşama 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılır (gösterilmemiştir). (B) Anestezi uygulanan farenin anestezi burun konisine yerleştirilmesi. (C) Fare, aşılanan kulağın yan tarafı alt kapak kaymasına/objektif lense bakacak şekilde hafifçe döndürülür. Kulak daha sonra alt kapak kaymasına karşı düzleştirilir ve kulağın üstüne ikinci bir kapak kayması yerleştirilerek yerine sabitlenir. (D) Üst kapak kayması, kulağı mikroskop aşamasına göre yerine sabitlemek için sahneye bantlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg"> Resim 3: Efg1ΔΔ mutant suşunun in vitro ve in vivo morfolojisi. (A) 4 saat boyunca 37 °C'de RPMI + %10 serumda büyüyen hücreler tarafından filamentasyonun in vitro indüksiyonundan sonra WT ve efg1ΔΔ mutant suşlarının geniş alan görüntüsü. Ölçek çubukları 10 μm'yi temsil eder. Görüntü kontrastı, görüntülemeyi kolaylaştırmak için fotoğraf düzenleme yazılımı kullanılarak ayarlandı. (B) WT ve efg1ΔΔ mutant suşlarında gözlenen in vitro filamentasyon yüzdesi. Und = tespit edilemez (hiçbir filament tespit edilmedi). Çubuk yüksekliği, en az 100 hücrenin ölçüldüğü üç bağımsız deneyden filamentli hücrelerin medyan yüzdesini temsil eder. Hata çubukları standart sapmayı gösterir (sonuçlar öğrencinin t-testi ile karşılaştırıldığında, p < 0.001). (C) WT (yeşil) ve efg1ΔΔ mutantının (kırmızı) konfokal mikrografisi, aşılama sonrası in vivo 24 saat büyür. Oklar, "filamentli" tanımımızı karşılayan efg1ΔΔ mutant hücrelerinin örneklerini gösterir. Ölçek çubuğu 50 μm. (D) WT ve efg1ΔΔ mutant suşlarında gözlenen in vivo filamentasyon yüzdesini temsil eder. Çubuk yüksekliği, iki bağımsız deneyden elde edilen filamentli hücrelerin medyan yüzdesini temsil eder. Hata çubukları standart sapmayı gösterir (sonuçlar öğrencinin t-testi ile karşılaştırıldığında, p < 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg"> Şekil 4: Cyr1 ΔΔ mutant suşunun in vitro ve in vivo morfolojisi. (A) RPMI'da büyüyen hücreler tarafından filamentasyonun in vitro indüksiyonundan sonra cyr1ΔΔ mutant suşunun geniş alan görüntüsü + 4 saat boyunca 37 °C'de% 10 serum. Ölçek çubuğu 10 μm'yi temsil eder. Görüntü kontrastı, görüntülemeyi kolaylaştırmak için fotoğraf düzenleme yazılımı kullanılarak ayarlandı. (B) WT ve cyr1ΔΔ mutant suşlarında gözlenen in vitro filamentasyon yüzdesi. Und = tespit edilemez (hiçbir filament tespit edilmedi). Çubuk yüksekliği, en az 100 hücrenin ölçüldüğü üç bağımsız deneyden filamentli hücrelerin medyan yüzdesini temsil eder. Hata çubukları standart sapmayı gösterir (sonuçlar öğrencinin t-testi ile karşılaştırıldığında, p < 0.001). (C) WT (yeşil) ve cyr1ΔΔ mutantının (kırmızı) konfokal mikrografisi, aşılama sonrası in vivo 24 saat büyür. Ölçek çubuğu 50 μm'yi temsil eder. (D) WT ve cyr1ΔΔ mutant suşlarında gözlenen in vivo filamentasyon yüzdesi. Çubuk yüksekliği, iki bağımsız deneyden elde edilen filamentli hücrelerin medyan yüzdesini temsil eder. Hata çubukları standart sapmayı gösterir (sonuçlar öğrencinin t-testi ile karşılaştırıldığında, p < 0.001). (E) Z-yığınının iki boyutlu bir projeksiyonunda eğri yolu uzunluğu ile ölçülen filament uzunluğunun in vivo dağılımı. Her nokta bir filamentin uzunluğunu temsil eder. Maya olarak büyüyen hücreler bu analize dahil edilmedi. Çubuk medyan filament uzunluğunu gösterir. Uzunlukların dağılımı, bir Mann-Whitney U testi kullanılarak analiz edildiğinde anlamlı derecede farklıdır (p < 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host at JoVE.com

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Bu makalede, non-invaziv konfokal mikroskopi kullanılarak bir memeli konakçısında aktif enfeksiyon sırasında morfogenez fenotipleri için orta büyüklükte Candida albicans mutant kütüphanelerinin taranması için bir yöntem anlatılmaktadır.

Bir Memeli Konağında Aktif Enfeksiyon Sırasında Candida albicans Mutant Suşlarında Morfogenez Fenotiplerini Taramak için In Vivo Görüntülemenin Kullanımı

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

Candida albicans morfogenezi, sayısız çevresel sinyal tarafından tetiklenir. Morfogenezi in vivo olarak inceleyerek, organizmanın tüm bu çevresel sinyallere nasıl entegre olduğunu ve tepki verdiğini belirliyoruz. Bu tekniğin temel avantajı, in vitro model sistemleri kullanılarak tanıtılabilecek önyargı veya eserlerin yokluğunda morfogenezi incelememize izin vermesidir.Çok az insan intradermal enjeksiyonlarla ilgili deneyime sahiptir. Bu teknikte yeni olan birinin, öğrenmesi için hayvan kaynakları veterinerine başvurmasını şiddetle tavsiye ederim. Prosedürü gösteren, laboratuvar grubumuzdan doktora sonrası bir araştırmacı olan Rohan Wakade olacaktır.Aşılamadan en az yedi gün önce klorofil içermeyen chow besleyerek hayvanı aşılamaya hazırlayarak başlayın. Enjeksiyondan bir gün önce, kürdan kullanarak bir koloniden Kanada albicans hücrelerinin bir kısmını alın. 25 mililitre YYPD aşılayın ve birkaç farklı koloniden hücre elde etmek için bu işlemi birkaç kez tekrarlayın.Kültürü, 175 RPM'de bir yörüngesel çalkalayıcı inkübatöründe gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. 500 x g'da iki dakika boyunca bir mililitre kültürü santrifüj edin, ardından mayayı bir mililitre steril DPBS ile üç kez yıkayın. Peleti bir mililitre steril DPBS'de yeniden askıya alın ve kültürü 1 ila 100'de seyreltin.Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve buna göre hücre yoğunluğunu ayarlayın. Daha sonra, referans verilen ve deneysel suşun eşit hacimlerini karıştırarak enjeksiyon için inokulumu oluşturun. Pamuklu uçlu bir çubuk kullanarak, anestezi uygulanmış bir hayvanın her iki kulağının iç ve dış yüzeyine serbestçe reçetesiz satılan bir tüy dökücü krem uygulayın.İki ila üç dakika sonra, tüy dökücü krem kalıntılarını iyice gidermek için kulağı kuru bir gazlı bezle ve ardından steril suya doyurulmuş gazlı bezlerle nazikçe silin. Kulakların yüzeyini% 70 etanol ile sterilize ettikten sonra, şişeyi birkaç kez ters çevirerek veya vorteksleyerek inokulumu iyice karıştırın. Bir insülin şırıngasına 20 ila 30 mikrolitre inokülum çekin.İğneyi dik konumda tutun ve namludaki herhangi bir havanın üstte olduğundan emin olmak için şırıngaya hafifçe dokunun. Havayı ve fazla inokulumu, inokulum tüpüne veya bir atık tüpüne dikkatlice geri atın, böylece piston 10 mikrolitre işaretinde olur. Tezgahın üzerine çift taraflı cilt bandını küçük bir konik veya yuvarlak tabanlı plastik tüpe uygulayın ve anestezi burun konisinin yerinden çıkmasını önleyerek kulağı bant boyunca örtün.Şırınga iğnesini cilde neredeyse paralel tutarak ve büyük damarlardan kaçınarak, iğnenin ucunu eğim sadece kaplanana kadar cildin en dış tabakasına yerleştirin ve inanguma yavaşça enjekte edin. İyi bir intradermal enjeksiyon ciltte küçük bir kabarcık oluşturacaktır. Sızıntıyı en aza indirmek için iğneyi kulaktan çıkarmadan önce 15 ila 20 saniye yerinde tutun.Kurumsal protokolleri takiben, kafesteki hayvanlara Candida albicans bulaştığını gösteren biyolojik tehlike etiketleriyle kafesi işaretleyin. İnokulumu hazırlamak için kullanılan aynı yıkanmış kültürleri kullanarak, RPMI 1640'ta hücrelerin 1 ila 50 seyreltilmesini sağlayın,% 10 ısı ile desteklenir ve fetal sığır serumunu aktive eder ve dört saat boyunca yuvarlanma ile 37 santigrat derecede inkübe eder. Örneği mikroskop kullanarak inceleyin.Her suş için maya ve filamentli hücrelerin sayısını kaydederek en az 100 hücre sayın. Uzun çalışma mesafesi hedefini yerine döndürün ve lensin üzerine bir damla daldırma sıvısı yerleştirin. Kapak kaymasını yerleştirirken olası hasarları önlemek için lensi indirin.1,5 numaralı kapak kaymasını sahne açıklığının üzerine yerleştirin ve yerine bantlayın. Daldırma sıvısının hem objektif lens hem de kapak kayması ile temas halinde olması için hedefi yükseltin. Mikroskop aşamasında bir anestezi burun konisi, görüntüleme için pozisyondayken hayvanın burnunu tamamen kaplayacak şekilde sabitleyin.Anestezi uygulanan bir farenin burnunu burun konisine yerleştirin. Objektif lensin üzerindeki kapak kaymasına bir damla steril su yerleştirin. Anestezi burun konisini ayarlayın ve fareyi, farenin kulağı su damlacığının üzerinde olacak şekilde konumlandırın.Başka bir kapak kayması alın ve kapak kaymasının kenarını farenin gövdesine paralel olarak yerleştirin, kenar kulağın kafayla buluştuğu yere fareye dokunur. Bir menteşe hareketi kullanarak, kapak kaymasının serbest kenarını mikroskop aşamasına indirin. Kapak kayması mikroskop aşamasına karşı geldiğinden, kulağı düzleştirecektir.Kulağı düz tutmak ve farenin saçını veya bıyıklarını bantta yakalamaktan kaçınmak için üst kapak kaymasını güvenli bir şekilde bantlayın. Çevre odasına sahip bir mikroskop kullanılmadığı sürece, normal bir termik ortamı korumak için farenin vücudunu steril bir örtü ile gevşek bir şekilde örtün. Beyaz ışık, geniş alan görüntüleme kullanarak, odak düzlemini kulak dokusuna ayarlayın ve kan damarlarında hareket eden kırmızı kan hücrelerine odaklanın.Görüş alanındaki tüm hücreler için morfolojinin belirlenebilmesi için yeterince güçlü bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için, lazer gücünü veya görüntüleme hızını ayarlayın. Doku hasarını önlemek için, mümkün olan en düşük lazer gücünü kullanın. Referans alınan suşta net filament oluşumuna sahip ve çoğu organizmanın morfolojilerinin belirlenebileceği kadar yayıldığı bir görüş alanı seçin.Bir Z-yığını için üst ve alt odak düzlemlerini ayarlayın. Enfekte alanın tüm derinliğini kaplamak gerekli değildir, ancak görüntülenen hacmin üstündeki veya altındaki organizmaların tipik olarak analizin dışında tutulduğunu unutmayın. Z-yığını görüntüleri alın, her bir suşu ayırt etmek ve kanalları kaplamak için her kanalı sahte renklendirin.Görüntüleri kaydedin. Z-yığınının iki boyutlu bir görüntüye maksimum projeksiyonunu gerçekleştirmek için görüntüleme yazılımı kullanın. Maksimum projeksiyon görüntülerinde görülen her organizmayı gerinim tipine ve morfolojiye göre sayın.Referans alınan suş hızla in vitro filamentler oluşturur. EFG1 Null ise filamentleri oluşturamadı. EFG1 Null, in vivo olarak da önemli bir filamentasyon kusuru sergiler.EFG1 Null hücrelerinin yaklaşık% 9'u in vivo filamentler olarak büyüdü. Benzer şekilde, CYR1 Null mutant suşu, referans verilen suşa kıyasla in vitro bir filamentasyon defekti gösterdi. Buna karşılık, CYR1 Null mutant hücrelerinin% 53'ü in vivo filamentler olarak büyüdü.CYR1 Null mutantı tarafından oluşturulan filamentler, referans alınan suştan daha kısaydı. Aşılama sırasında iğneyi cilde paralel tutmak çok önemlidir. Amaç, inokulumu cildin dış tabakasının hemen altına yerleştirmektir.Bu teknik, ilgilenilen konakçı hücrelerde bir floresan proteini eksprese eden fare suşları ile de kullanılabilir, bu da konakçı patojen etkileşimlerini in vivo olarak incelememize izin verir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Canlı bir Host Transgenik Leishmania Parazitlerinin in vivo Imaging

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt;: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli<em&gt; Candida albicans</em&gt; Ve<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Ana fenotipleri incelenmesi halinde<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Takiben Antibiyotik Tedavisi

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Aydınlatma ve Görüntüleme Candida albicans Biyofilmler

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Bir Ex vivo Assay Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Hyphal Morphogenesis Çalışma

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Farelerde Gardnerella vaginalis Mesane Maruziyeti Tarafından Tetiklenen Tekrarlayan Escherichia coli İdrar Yolu Enfeksiyonu

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...