Name: experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

وحظي هذا العمل بدعم المجلس الوطني الأسترالي للبحوث الصحية والطبية (NHMRC; منحة البرنامج رقم GNT1149990) ، المركز الأسترالي لأبحاث فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد (ACH2) ، بالإضافة إلى هدية من تركة ريجان لويز لانجلوا. تقر F.C. بمنح زمالة الأبحاث الرئيسية العليا للمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC) (GNT1135806). تم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 باستخدام BioRender.com.

1. اختيار الدفق المناسب
<ol><li>اتبع شجرة القرار الموضحة في الشكل 1 لتحديد أفضل سير عمل (دفق) (الشكل 2) للإعداد التجريبي المستخدم. ارجع إلى المناقشة للحصول على مزيد من التعليقات حول اختيار البث هذا.</li>
	<li>إذا كنت تتبع دفق مقياس الخلايا، فتابع الخطوات 2.1.1-...

<ol>
	<li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+ORgan+Targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR/Cas+gene+editing.">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+mRNA+vaccines:+A+biotech+and+industrial+perspective.">The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective.</a> npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).</li><li>Press, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo-carrier+interactions+significantly+contribute+to+micellar+conformation+and+biodistribution.">Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution.</a> NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).</li><li>Cevaal, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+T+cell-targeting+nanoparticle+drug+delivery+systems:+Considerations+for+rational+design.">In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design.</a> ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).</li><li>Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-nano+science:+Better+metrics+would+accelerate+progress.">Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress.</a> Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).</li><li>Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+level+of+nanoparticle+uptake+in+mammalian+cells+using+flow+cytometry.">Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry.</a> Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).</li><li>Lozano-Andr&#233;s, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+MESF-bead+based+assignment+of+absolute+fluorescence+values+to+nanoparticles+and+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Schwartz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalization+of+the+MESF+unit+of+fluorescence+intensity.">Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cell-particle+association+in+vitro:+A+quantitative+method+to+compare+particle+performance.">Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance.</a> Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Comfort, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+tracking+analysis+for+the+quantification+and+size+determination+of+extracellular+vesicles.">Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+particle+imaging+for+quantification+of+nano-+and+microparticles.">Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles.</a> Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+Towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISD3:+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems.">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).</li><li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions.">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).</li><li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density.">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature.">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li></ol>

أصبح توصيف التفاعلات بين ناقلات المخدرات والخلايا ذا أهمية متزايدة في تطوير أنظمة جديدة لتوصيل الأدوية. على وجه التحديد ، للسماح بالتقييم والمقارنة العقلانيين لمختلف هياكل الناقل ، فإن القياس الكمي المطلق لأداء الناقل المذكور للتفاعل مع الخلايا المستهدفة وغير المستهدفة أمر بالغ الأهمي...

اجتذب تصميم تركيبات توصيل الأدوية التي تظهر سلوكا محددا ومصمما اعتمادا على نوع الخلية التي تواجهها اهتماما بحثيا كبيرا. تشمل تركيبات توصيل الأدوية المحتملة أو "الناقلات" تركيبات الدهون ، أو المواد غير العضوية المزروعة بالنانو ، أو التجمعات البوليمرية ، أو الحويصلات خارج الخلية ، أو الخلايا البكتيرية الوظيفية ، أو الفيروسات المعدلة. كل هذه يمكن أن تظهر خصوصية العضو أو الأنسجة أو الخلية بسبب الخصائص الفيزيائية أو خصائص السطح أو الوظائف الكيميائية الهندسية مثل ارتباط الجسم المضاد 1,2.
تتمثل الخطوة المنتشرة في كل مكان تقريبا في تقييم الناقل في المختبر في احتضان الخلايا بتعليق يحتوي على الناقل المحمل بالمخدرات المذكور. بعد الحضانة ، يتم قياس أداء الناقل من خلال قراءة وظيفية لأداء شحنة الدواء ، على سبيل المثال ، كفاءة النقل أو السمية. القراءات الوظيفية مفيدة ، لأنها مقياس نهائي لفعالية الناقل. ومع ذلك ، بالنسبة لبنيات توصيل الأدوية الأكثر تعقيدا ، من المهم بشكل متزايد تجاوز القراءات الوظيفية وتحديد درجة تفاعل الناقل مع الخلية محل الاهتمام بشكل منفصل. هناك عدة أسباب لذلك.
أولا، هناك اهتمام متزايد باكتشاف (وتحسينها بشكل متكرر) تكنولوجيات الناقل "المنصات"، التي يمكن أن تحمل مجموعة متنوعة من البضائع. على سبيل المثال ، يمكن للجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) المصممة لتغليف الحمض النووي الريبي تبادل تسلسل RNA بآخر مع بعض المحاذير3. ومن ثم، ومن أجل تحسين تكنولوجيا الناقل بصورة متكررة، من الأهمية بمكان قياس أدائها بشكل مستقل عن وظيفة الشحنة. ثانيا، قد لا تكون القراءات الوظيفية مباشرة بالنسبة للبضاعة محل الاهتمام، مما يقوض القدرة على تكرار تركيبات الناقل وتقييمها بسرعة. في حين يمكن للمرء أن يؤدي في المختبر الأمثل باستخدام شحنة نموذجية مع قراءة وظيفية مباشرة (على سبيل المثال ، مضان) ، فإن تغيير الشحنة يمكن أن يغير الاستجابة البيولوجية للناقل4 وبالتالي قد لا يسفر عن نتائج تمثيلية. ثالثا ، تم تصميم العديد من الناقلات للتفاعل مع نوع معين من الخلايا واستيعابها. ويمكن، بل وينبغي، التمييز بين قدرة الناقل على الاستهداف هذه وأداء شحنته العلاجية بعد الاستهداف. لمواصلة مثال LNP ، قد تكون شحنة الحمض النووي الريبي قوية للغاية ، ولكن إذا كان LNP غير قادر على الارتباط بالخلية ، واستيعابه ، وإطلاق الحمض النووي الريبي ، فلن يلاحظ أي تأثير وظيفي في المصب. يمكن أن يكون هذا مشكلة خاصة بالنسبة للناقلات التي تهدف إلى استهداف أنواع الخلايا التي يصعب نقلها ، مثل الخلايا التائية5. على العكس من ذلك ، يمكن أن يستهدف LNP بشكل فعال للغاية ، لكن شحنة الحمض النووي الريبي قد لا تعمل. لن يتمكن الفحص النهائي الذي يقيس فقط وظائف الشحن من التمييز بين هاتين الحالتين ، مما يعقد تطوير وتحسين أنظمة توصيل الأدوية الناقلة.
في هذا العمل ، تتم مناقشة كيفية تحديد ارتباط الناقل بشكل مطلق. الارتباط هو مصطلح يشير إلى درجة التفاعل المقاسة تجريبيا بين الناقل والخلية. لا يفرق الارتباط بين ربط الغشاء والاستيعاب - قد يرتبط الناقل لأنه مرتبط بسطح الخلية أو لأن الخلية قد استوعبته. يقاس الارتباط عادة كجزء من تجارب حضانة حامل الخلية. تاريخيا ، تم الإبلاغ عن الارتباط إما في وحدات الفلورسنت التعسفية (عادة "متوسط شدة التألق" أو MFI) أو ك "ارتباط النسبة المئوية" ، وهي مقاييس تمت مناقشة حدودها سابقا6. باختصار ، هذه القياسات غير قابلة للمقارنة بين التجارب والمختبرات وناقلات الأدوية بسبب الاختلافات في البروتوكولات التجريبية ، وإعدادات مقياس التدفق الخلوي ، وشدة وضع العلامات على ناقلات مختلفة. وقد بذلت جهود للتغلب على الأول عن طريق معايرة مقياس الخلوي ، وبالتالي تحويل المقياس النسبي ل MFI إلى مقياس كمي تماما للتألق7. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لا تأخذ في الاعتبار التباين في كثافة وضع العلامات لمختلف شركات النقل ، وبالتالي ، لا تسمح بالمقارنة المنطقية لأداء الناقل المختلفة في خلية مستهدفة من الاختيار8.
هنا ، يتم توضيح كيفية التحويل عمليا من وحدات الفلورسنت النسبية التعسفية إلى المقياس الكمي المطلق ل "عدد الناقلات لكل خلية" من خلال إجراء عدد صغير من تجارب التوصيف الإضافية. إذا كان هناك مقياس آخر لتركيز الموجة الحاملة (على سبيل المثال ، كتلة الموجة الحاملة لكل خلية أو حجم الموجة الحاملة لكل خلية) ، فمن السهل التحويل من الناقلات لكل خلية ، بشرط أن يتم توصيف الناقل. للإيجاز وتجنب المصطلحات ، يتم استخدام كلمة "الناقل" في هذا العمل للإشارة إلى مجموعة واسعة من هياكل توصيل الأدوية. تقنيات القياس الكمي هذه قابلة للتطبيق بنفس القدر ، سواء تم تطبيقها على جسيمات الذهب المهندسة بالنانو أو البكتيريا المهندسة بيولوجيا.
بعض الحقائق تمكن من التحويل من وحدات الفلورسنت التعسفية إلى ناقلات لكل خلية. أولا ، تتناسب شدة التألق المقاسة مع تركيز الفلوروفور9 (أو الناقل المسمى بالفلورسنت) ، بافتراض أن التألق يقع ضمن حدود الكشف للأداة وأن إعدادات الأجهزة هي نفسها. وبالتالي ، إذا كان مضان الناقل ومضان العينة معروفين ، فيمكن للمرء تحديد عدد الناقلات الموجودة في تلك العينة إذا تم إجراء جميع القياسات في نفس الإعدادات والظروف. ومع ذلك ، خاصة بالنسبة للناقلات الأصغر ، قد لا يكون من الممكن قياس مضان الناقل ، والتألق الذاتي للخلية ، ومضان الخلية المرتبط بالناقلات على نفس الجهاز بنفس الإعدادات. في هذه الحالة ، هناك مطلب ثان لجعل من الممكن التحويل بين التألق المقاس على أداة واحدة والتألق المقاس على جهاز آخر. للقيام بذلك ، يمكن إنشاء منحنى قياسي لتركيز الفلوروفور لقياس شدة التألق على كلا الجهازين ، مع الاستفادة من جزيئات الفلوروكروم القابل للذوبان المكافئ (MESF) المعيار9. يسمح هذا بعد ذلك بقياس مضان الناقل بكميات كبيرة على مقياس غير خلوي ، وهو قياس يمكن إجراؤه على ناقلات من أي حجم أو خاصية. عندما يتم إجراء هذا التقدير الكمي السائب على تعليق ناقل بتركيز معروف ، يمكن مرة أخرى حساب عدد الناقلات لكل خلية من العينة.
بينما يوضح هذا العمل عملية قياس ارتباط الناقل (على النحو الذي تحدده شدة التألق المقاسة) ، يمكن إجراء بروتوكول مماثل لمقاييس أخرى للتفاعل بين الخلية والناقل (على سبيل المثال ، بروتوكول تجريبي يميز الناقلات الداخلية والحاملة الغشائية). بالإضافة إلى ذلك ، سيكون هذا البروتوكول هو نفسه إلى حد كبير إذا تم قياس الارتباط من خلال مقايسة غير فلورية (على سبيل المثال ، من خلال قياس الكتلة الخلوية).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20347</td>
			<td>pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apogee A50 Microflow</td>
			<td>Apogee</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>Tecan Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td>Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum MESF kits Alexa Fluor 647</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>647</td>
			<td>Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation

يتعلق أحد المكونات الرئيسية لتصميم أنظمة توصيل الأدوية بكيفية تضخيم أو تخفيف التفاعلات مع أنواع معينة من الخلايا. على سبيل المثال ، قد يعمل العلاج الكيميائي بجسم مضاد لتعزيز الارتباط بالخلايا السرطانية ("الاستهداف") أو يعمل باستخدام البولي إيثيلين جلايكول للمساعدة في التهرب من التعرف على الخلايا المناعية ("التخفي"). حتى على المستوى الخلوي ، يعد تحسين ربط وامتصاص حامل الدواء مشكلة تصميم بيولوجية معقدة. ومن ثم، من المفيد فصل مدى قوة تفاعل الناقل الجديد مع الخلية عن الفعالية الوظيفية لبضاعة الناقل بمجرد تسليمها إلى تلك الخلية.
لمواصلة مثال العلاج الكيميائي ، فإن "مدى ارتباطها بخلية سرطانية" هي مشكلة منفصلة عن "مدى نجاحها في قتل خلية سرطانية". المقايسات الكمية في المختبر لهذا الأخير راسخة وعادة ما تعتمد على قياس الجدوى. ومع ذلك ، فإن معظم الأبحاث المنشورة حول تفاعلات الناقل الخلوي هي نوعية أو شبه كمية. بشكل عام ، تعتمد هذه القياسات على وضع العلامات الفلورية للناقل ، وبالتالي الإبلاغ عن التفاعلات مع الخلايا في الوحدات النسبية أو التعسفية. ومع ذلك ، يمكن توحيد هذا العمل وجعله كميا تماما مع عدد صغير من تجارب التوصيف. مثل هذا القياس الكمي المطلق ذو قيمة ، لأنه يسهل المقارنات العقلانية بين الطبقات وداخلها لأنظمة توصيل الأدوية المختلفة - الجسيمات النانوية ، والجسيمات الدقيقة ، والفيروسات ، واتحادات الأجسام المضادة والأدوية ، والخلايا العلاجية المهندسة ، أو الحويصلات خارج الخلية.
علاوة على ذلك ، يعد القياس الكمي شرطا أساسيا للتحليلات التلوية اللاحقة أو في مناهج نمذجة السيليكو . في هذه المقالة ، يتم تقديم أدلة الفيديو ، بالإضافة إلى شجرة قرار حول كيفية تحقيق القياس الكمي في المختبر لأنظمة توصيل الأدوية الحاملة ، والتي تأخذ في الاعتبار الاختلافات في حجم الناقل وطريقة وضع العلامات. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة المزيد من الاعتبارات للتقييم الكمي لأنظمة توصيل الأدوية المتقدمة. يهدف هذا إلى أن يكون بمثابة مورد قيم لتحسين التقييم العقلاني والتصميم للجيل القادم من الطب.

كما نوقش سابقا ، تتطلب أنواع ناقلات المخدرات المختلفة استخدام تقنيات مختلفة للقياس الكمي المطلق لارتباط حامل الخلية. على سبيل المثال ، 633 نانومتر من جزيئات البولي (حمض الميثاكريليك) (PMASH) ذات القشرة الأساسية كبيرة وكثيفة بما يكفي للكشف باستخدام مقياس التدفق الخلوي الحساس. على هذا الن...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

يتم توضيح سير العمل للقياس الكمي المطلق للتفاعلات بين الخلايا الناقلة للأدوية باستخدام قياس التدفق الخلوي للسماح بتقييم عقلاني أفضل لأنظمة توصيل الأدوية الجديدة. ينطبق سير العمل هذا على ناقلات المخدرات من أي نوع.

القياس الكمي التجريبي للتفاعلات بين أنظمة توصيل الدواء والخلايا في المختبر: دليل لتقييم الطب النانوي قبل السريري

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

يوفر هذا البروتوكول بيانات كمية حول كيفية تفاعل أنظمة الناقل مع الخلايا. البيانات الكمية هي المفتاح للهندسة والتحسين. يسمح لنا بالانتقال من الأسئلة البيولوجية بنعم أو لا ، إلى مقدار الأسئلة.هذه التقنية مفيدة لتحويل النتائج من أداء حامل الدواء قبل السريري ، والتي كانت نوعية ، إلى نتائج كمية. وهذا يعمل حتى عندما تميز الناقل الخاص بك على نظام مختلف عن توصيف خلاياك. قد يستغرق الأمر بعض التكرارات للعثور على التخفيف الأمثل للحامل الذي يقع ضمن النطاقات الخطية أو الكمية لجانب النانو.خذ وقتك لإيجاد الظروف المناسبة. للبدء ، قم بتركيب خلية التدفق على وحدة الليزر. اغسل خلية التدفق ببطء بمعدل 0.1 ملليلتر في الثانية مع ملليلتر واحد من الماء المقطر.إذا تشكلت فقاعات داخل خلية التدفق ، فقم بسحب التعليق جزئيا لدمج الفقاعة مع واجهة الهواء والسائل قبل المتابعة. ثم قم بقفل وحدة الليزر بأكملها في مكانها داخل الجهاز. ابدأ تشغيل الكاميرا في منتصف عملية التنظيف تقريبا.تأكد من التأكد من غسل حطام الناقل. حدد التقاط لفتح علامة تبويب إعدادات الالتقاط وانقر فوق بدء تشغيل الكاميرا. قم بقيادة النظام باستخدام ملليلتر واحد من الهواء.إذا كانت أي ناقلات ثابتة مرئية على الشاشة ، فقم بتنظيف خلية التدفق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإعداد الناقلات لتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، من خلال ضمان تعليق الناقلات جيدا عن طريق الصوتنة أو الدوامة ، اعتمادا على نظام الناقل المعني. قم بتخفيف الناقلات في الماء لتحضير ما لا يقل عن 0.6 إلى ملليلتر واحد من كل عينة بتركيز ناقل يتراوح بين 1x10 إلى السابع و 1x10 إلى الناقلات التاسعة لكل ملليلتر.أخرج وحدة الليزر وضعها في وضع مستقيم. قم بإسقاط العينة الحاملة الأولى في حقنة ملليلتر واحد وأرفق المحقنة بمدخل الأنبوب. ثم قم بتحميل العينة بعناية في خلية التدفق.إذا تشكلت فقاعات داخل خلية التدفق ، فقم بسحب التعليق جزئيا لدمج الفقاعة مع واجهة الهواء والسائل قبل المتابعة. تأكد من ملء خلية التدفق بأكملها بالسائل ، ثم أوقف التحميل مؤقتا. اضبط تركيز الكاميرا إذا لزم الأمر لتصور شركات النقل الفردية.قم بإجراء تعديلات التركيز الخشن باستخدام المقبض الدوار على الجانب الأيمن من الجهاز. قم بإجراء تعديلات أدق عن طريق تحديد علامة تبويب الأجهزة. قم بتغيير التركيز عن طريق ضبط شريط تمرير التركيز.لضمان عدم وجود تشبع زائد ، حدد مستوى الكاميرا الأمثل عن طريق ضبط شريط التمرير داخل علامة تبويب الالتقاط. إذا كانت الأداة مزودة بهذا الملحق ، فقم بتحميل المحقنة التي تحتوي على عينة الناقل في مضخة المحقنة. ضمن علامة التبويب SOP ، حدد القياس القياسي لالتقاط خمس لقطات مدة كل منها 30 ثانية.أدخل اسم الملف الأساسي ، وإذا رغبت في ذلك ، أضف معلومات عينة إضافية بالنقر فوق الزر "خيارات متقدمة" الذي سيفتح حوارا مشروطا بخيارات مختلفة. اضغط على إنشاء البرنامج النصي وتشغيله وانتظر ظهور نافذة منبثقة تطلب منك تقديم عينة متقدمة. إذا كنت تستخدم مضخة المحقنة ، فحدد علامة تبويب الأجهزة ثم علامة تبويب مضخة المحقنة.اضبط معدل التسريب المطلوب واضغط على لبث. إذا لم تستخدم مضخة المحقنة ، فقم بتقدم العينة يدويا. في النافذة المنبثقة، حدد موافق لبدء الالتقاط.بعد كل من اللقطات الخمس ، عندما تظهر العينة المنبثقة من فضلك المتقدمة ، تحقق من أن العينة لا تزال تتحرك عبر خلية التدفق. ثم حدد موافق لمتابعة الالتقاط التالي. في علامة تبويب العملية، اضبط شريط تمرير عتبة الكشف بين أربعة وثمانية لتحديد شركات النقل المميزة المرئية على الشاشة بشكل صحيح.يمكنك ضبط كسب الشاشة للمساعدة في التصور ، ولن يؤثر ذلك على تحليل المصب. في النافذة المنبثقة، اضغط على موافق لبدء تحليل التتبع. راقب تقدم التحليل بالنقر فوق التحليل في علامة تبويب تحليل واحدة.بمجرد الانتهاء من التحليل ، ابحث عن مطالبة إعدادات التصدير بالظهور. تأكد من تحديد تضمين PDF وتضمين ملخص التجربة. حدد أي تنسيقات تصدير أخرى حسب الرغبة.في قسم النتائج في تصدير بيانات PDF ، للتأكد من أن التركيز المقاس موثوق به ، تحقق من أن تركيز الموجة الحاملة المقاس يتراوح بين 1x10 إلى السابع و 1x10 إلى الناقلات التاسعة لكل ملليلتر وتحقق من وجود أي رسائل خطأ أو رسائل تحذير أسفل نتيجة قياس التركيز. كرر الإجراء مرتين أو أكثر مع تخفيفات مختلفة من المخزون ، وتأكد من أن تركيز كل عينة يقع ضمن النطاق الخطي للأداة. احسب تركيز ناقل المخزون كما هو موضح في مخطوطة النص.قم بإعداد محلول الفلوروكروم المترافق الحر أو الجسم المضاد كما هو موضح في مخطوطة النص. احسب تركيز محلول المخزون من التركيز، والوزن الجزيئي، ورقم أفوجادرو كما هو موضح في المعادلة. ثم قم بإجراء تخفيف تسلسلي للصبغة في مخفف الناقل لتوليد عينات منحنى قياسية.ثم أضف عينة الناقل إلى لوحة القياس وقم بقياس التألق باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة. قم بإنشاء المنحنى القياسي كما هو موضح في مخطوطة النص. احسب شدة التألق المطلقة لكل ناقل بقسمة التألق السائب على تركيز الناقل.قم بإعداد مقياس التدفق الخلوي لتجربة الخلية الحاملة النهائية من خلال تحديد إعدادات الجهد الأمثل PMT في القنوات ذات الصلة. قم بتشغيل عينة تحكم سلبية حيث لا يتم تحضين الخلايا بناقلات لتحديد مضان الخلفية. إعداد وإعادة تعليق حبات قياس التدفق الخلوي.استخدم نفس المخزن المؤقت المستخدم لعينات الخلايا. إذا تم توفير مجموعات الخرزة بشكل منفصل ، فقم بسحبها معا. قم بتشغيل حبة قياس التدفق الخلوي وعينات الخلية الحاملة لتحديد شدة التألق لكل خلية.قم بتشغيل حبات مقياس التدفق الخلوي لتوليد منحنى قياسي ، وتحويل كثافة الفلورسنت المطلقة إلى MFI. استخدم هذا لحساب MFI النظري للناقلات كما هو موضح في مخطوطة النص. قم بتشغيل عينات حامل الخلية لتحديد كثافة الفلورسنت لكل خلية من كل عينة.أخيرا ، احسب عدد الناقلات لكل خلية لكل عينة عن طريق طرح مضان الخلفية من التألق المقاس للعينة ، ثم القسمة على التألق لكل جسيم. بالنسبة لجزيئات الغلاف الأساسية لحمض البولي ميثاكريليك 633 نانومتر ، كان التركيز وكثافة الفلورسنت لكل حامل قابلين للقياس الكمي مباشرة باستخدام تيار مقياس الخلايا. في المقابل ، كانت جسيمات أكسيد الحديد النانوية المغناطيسية الفائقة 100 نانومتر صغيرة جدا بحيث لا يمكن اكتشافها بشكل فردي وتم تحليلها باستخدام التيار السائب.تم استخدام حبات القياس الكمي الموسومة في عدة أيام لتوليد منحنيات قياسية على مقياس التدفق الخلوي. كان الارتباط بين MFI المقاس وقيمة MESF لخرزات القياس الكمي خطيا ومتشابها إلى حد كبير بين التواريخ المقاسة. أظهرت تجارب الدورة الزمنية باستخدام خلايا HeLa الفلورية التي تحتوي على كبسولات حمض بولي ميثاكريليك 235 نانومتر من صفر إلى 24 ساعة زيادة في MFI بمرور الوقت ، مما يشير إلى ارتباط الكبسولات بخلايا HeLa.كان الاختلاف في الاستجابة الخلوية الظاهرة للناقلات صارخا ، اعتمادا على القياس الكمي النسبي أو المطلق. كان القياس الكمي المطلق مستقلا عن كثافة وضع العلامات وبالتالي أكثر قابلية للمقارنة. هذه التقنيات هي الأساس لتحليل ومقارنة أعمق لأداء الجسيمات.نحن متحمسون لاستخدام هذه التقنيات لتحديد معلمات النماذج الرياضية التي ستسمح لنا بتوصيف أداء الجسيمات بشكل مستقل عن أي تجربة معينة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

نماذج وأساليب لتقييم نقل المخدرات نظم التسليم عبر الحواجز الخلوية

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

تكييف عملية Electrospinning لتوفير ثلاث بيئات فريدة من نوعها لثلاثي الطبقات<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج جدار مجرى الهواء

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Microenvironments-شطيرة مثل لتسخير خلية / المواد التفاعلات

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

تركيب 10 نانومتر فونكتيوناليزيد المغلفة البوليمر جزيئات الذهب لاستهداف البطانة وإيصال الأدوية

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

تقييم شامل لفعالية وسلامة إيصال الأدوية المستهدفة للمشيمة باستخدام ثلاثة أساليب تكميلية

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

نظام ميكروبيوريكتور لإنتاج IgG1 النموذجي في الخلايا شو الآلي استخدام الفائق

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

تنقية وتحليل الأجسام المضادة أحادية النسيلة من خلايا المبيض الهامستر الصينية باستخدام نظام مفاعل ميكروبيوم الآلي

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

A الكمي الفلورية المجهري القائم علي فحص ليبوسوم واحد للكشف عن التجانس التركيبي بين الجسيمات الشحمية الفردية

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

التوضيح الأولي لسائل زراعة الخلايا المقطوعة CHO باستخدام فاصل صوتي

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...