Name: experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC; Programbevilling nr. GNT1149990), det australske center for hiv- og hepatitisvirologiforskning (ACH2) samt en gave fra boet efter Réjane Louise Langlois. F.C. anerkender tildelingen af et National Health and Medical Research Council (NHMRC) Senior Principal Research Fellowship (GNT1135806). Figur 1 og figur 2 blev oprettet med BioRender.com.

1. Valg af den passende strøm
<ol><li>Følg beslutningstræet, der er beskrevet i figur 1 , for at bestemme den bedste arbejdsgang (strøm) (figur 2) for den anvendte eksperimentelle opsætning. Der henvises til diskussionen for yderligere kommentarer til dette valg af strøm.</li>
	<li>Hvis du følger cytometerstrømmen, skal du fortsætte med trin 2.1.1-2.2.7. Hvis du følger Bulk Stream, skal du fortsætte med trin 3.1.1.1-3.1.5.7.</li>
</...

<ol>
	<li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+ORgan+Targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR/Cas+gene+editing.">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+mRNA+vaccines:+A+biotech+and+industrial+perspective.">The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective.</a> npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).</li><li>Press, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo-carrier+interactions+significantly+contribute+to+micellar+conformation+and+biodistribution.">Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution.</a> NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).</li><li>Cevaal, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+T+cell-targeting+nanoparticle+drug+delivery+systems:+Considerations+for+rational+design.">In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design.</a> ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).</li><li>Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-nano+science:+Better+metrics+would+accelerate+progress.">Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress.</a> Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).</li><li>Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+level+of+nanoparticle+uptake+in+mammalian+cells+using+flow+cytometry.">Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry.</a> Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).</li><li>Lozano-Andr&#233;s, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+MESF-bead+based+assignment+of+absolute+fluorescence+values+to+nanoparticles+and+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Schwartz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalization+of+the+MESF+unit+of+fluorescence+intensity.">Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cell-particle+association+in+vitro:+A+quantitative+method+to+compare+particle+performance.">Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance.</a> Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Comfort, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+tracking+analysis+for+the+quantification+and+size+determination+of+extracellular+vesicles.">Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+particle+imaging+for+quantification+of+nano-+and+microparticles.">Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles.</a> Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+Towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISD3:+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems.">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).</li><li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions.">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).</li><li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density.">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature.">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li></ol>

Karakterisering af interaktionerne mellem lægemiddelbærere og celler bliver stadig vigtigere i udviklingen af nye lægemiddelleveringssystemer. Specifikt for at muliggøre rationel evaluering og sammenligning af forskellige bærerkonstruktioner er absolut kvantificering af bærerens ydeevne til at interagere med mål- og off-target-celler kritisk. Denne protokol beskriver en to-strøms metode, der gør det muligt for enhver forsker, der arbejder med en lægemiddelbærer, at konvertere relative, semikvantitative flowcyt...

Designet af lægemiddelleveringskonstruktioner, der udviser specifik, designet adfærd afhængigt af hvilken celletype de støder på, har tiltrukket betydelig forskningsinteresse. Potentielle lægemiddelleveringskonstruktioner eller "bærere" inkluderer lipidformuleringer, nano-dyrkede uorganiske stoffer, polymere samlinger, ekstracellulære vesikler, funktionaliserede bakterieceller eller modificerede vira. Alle disse kan udvise organ-, vævs- eller cellespecificitet på grund af fysiske egenskaber, overfladeegenskaber eller konstruerede kemiske funktionaliseringer såsom antistoffastgørelse 1,2.
Et næsten allestedsnærværende skridt i in vitro-bærerevaluering er at inkubere celler med en suspension, der indeholder den lægemiddelbelastede bærer. Efter inkubation måles bærerens ydeevne via en funktionel aflæsning af lægemiddellastens ydeevne, for eksempel transfektionseffektivitet eller toksicitet. Funktionelle udlæsninger er nyttige, da de er et downstream-mål for bærereffektivitet. For mere komplekse lægemiddelleveringskonstruktioner er det imidlertid stadig vigtigere at bevæge sig ud over funktionelle udlæsninger og separat kvantificere graden af bærerinteraktion med cellen af interesse. Der er et par grunde til dette.
For det første er der stigende interesse for at opdage (og iterativt forbedre) "platform" -transportteknologier, som kan transportere en række forskellige laster. For eksempel kan lipidnanopartikler (LNP'er) designet til at indkapsle RNA udveksle en RNA-sekvens til en anden med få forbehold3. For iterativt at forbedre bærerteknologien er det således afgørende at kvantificere dens ydeevne uafhængigt af lastfunktionaliteten. For det andet er funktionelle udlæsninger muligvis ikke ligetil for lasten af interesse, hvilket kompromitterer evnen til hurtigt at gentage og evaluere bærerformuleringer. Mens man kunne udføre in vitro-optimering ved hjælp af en modellast med en ligetil funktionel udlæsning (for eksempel fluorescens), kan ændring af lasten ændre det biologiske respons på en bærer4 og kan således ikke give repræsentative resultater. For det tredje er mange bærere designet til at interagere med og blive optaget af en bestemt celletype. En sådan målretningsevne hos et luftfartsselskab kan og bør differentieres fra udførelsen af dets terapeutiske lastpostmålretning. For at fortsætte LNP-eksemplet kan en RNA-last være ekstremt potent, men hvis LNP ikke er i stand til at binde til cellen, internaliseres og frigive RNA'et, vil der ikke blive observeret nogen nedstrøms funktionel effekt. Dette kan være et problem, især for bærere, der er beregnet til at målrette mod svært transficerede celletyper, såsom T-celler5. Omvendt kunne en LNP målrette ekstremt effektivt, men RNA-lasten fungerer muligvis ikke. Et downstream-assay, der kun måler lastfunktionalitet, vil ikke være i stand til at skelne mellem disse to situationer, hvilket komplicerer udviklingen og optimeringen af transportørens lægemiddelleveringssystemer.
I dette arbejde diskuteres det, hvordan man absolut kvantificerer transportørforeningen . Association er et udtryk, der refererer til den eksperimentelt målte grad af interaktion mellem en bærer og en celle. Association skelner ikke mellem membranbinding og internalisering - en bærer kan være forbundet, fordi den er bundet til celleoverfladen, eller fordi cellen har internaliseret den. Association måles almindeligvis som en del af cellebærerinkubationseksperimenter. Historisk set er association blevet rapporteret enten i vilkårlige fluorescerende enheder (typisk "median fluorescensintensitet" eller MFI) eller som "procentforening", målinger, hvis begrænsninger tidligere er blevet diskuteret6. Kort sagt er disse målinger ikke sammenlignelige mellem eksperimenter, laboratorier og lægemiddelbærere på grund af forskelle i eksperimentelle protokoller, flowcytometerindstillinger og mærkningsintensiteter for forskellige bærere. Der er gjort en indsats for at overvinde førstnævnte ved at kalibrere cytometeret og derved omdanne det relative mål for MFI til et absolut kvantitativt mål for fluorescens7. Denne metode tager imidlertid ikke højde for variationen i mærkningsintensiteten for forskellige bærere og tillader således ikke en rationel sammenligning af forskellige bærerpræstationer i en målcelle efter eget valg8.
Her demonstreres det, hvordan man praktisk talt konverterer fra relative, vilkårlige fluorescerende enheder til den absolutte kvantitative metrik for "antallet af bærere pr. Celle" ved at udføre et lille antal yderligere karakteriseringseksperimenter. Hvis der ønskes en anden metrik af bærerkoncentration (f.eks. bærermasse pr. celle eller bærervolumen pr. celle), er det ligetil at konvertere fra bærere pr. celle, forudsat at bærerkarakterisering er udført. For korthed og for at undgå jargon bruges ordet "bærer" inden for dette arbejde til at henvise til det store udvalg af lægemiddelleveringskonstruktioner. Disse kvantificeringsteknikker er lige anvendelige, uanset om de anvendes på en nano-manipuleret guldpartikel eller en bio-manipuleret bakterie.
Nogle få fakta muliggør konvertering fra vilkårlige fluorescerende enheder til bærere pr. Celle. For det første er den målte fluorescensintensitet proportional med koncentrationen af en fluorafore9 (eller en fluorescerende mærket bærer), forudsat at fluorescensen er inden for instrumentets detektionsgrænser, og instrumenteringsindstillingerne er de samme. Hvis fluorescensen af en bærer og fluorescensen af en prøve er kendt, kan man således bestemme, hvor mange bærere der er til stede i den prøve, hvis alle målinger blev udført under de samme indstillinger og betingelser. Men især for mindre bærere er det muligvis ikke muligt at måle bærerfluorescens, celleautofluorescens og celle-associeret-med-bærere fluorescens på det samme instrument med de samme indstillinger. I dette tilfælde er der et andet krav om at gøre det muligt at konvertere mellem målt fluorescens på et instrument og målt fluorescens på et andet. For at gøre dette kan der etableres en standardkurve for fluoroforkoncentration for at måle fluorescensintensiteten på begge instrumenter ved at drage fordel af molekylerne af ækvivalent opløselig fluorkrom (MESF) standard9. Dette tillader derefter måling af bærerfluorescensen i bulk på et ikke-cytometer, en måling, der kan udføres på bærere af enhver størrelse eller egenskab. Når en sådan bulkkvantificering udføres på en bærersuspension af kendt koncentration, kan antallet af bærere pr. celle i en prøve igen beregnes.
Mens dette arbejde demonstrerer processen til måling af bærerforening (som bestemt ved målt fluorescensintensitet), kan en analog protokol udføres for andre målinger af cellebærerinteraktion (f.eks. En eksperimentel protokol, der differentierer internaliserede og membranbundne bærere). Derudover ville denne protokol stort set være den samme, hvis foreningen blev målt gennem et ikke-fluorescerende assay (for eksempel gennem massecytometri).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20347</td>
			<td>pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apogee A50 Microflow</td>
			<td>Apogee</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>Tecan Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td>Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum MESF kits Alexa Fluor 647</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>647</td>
			<td>Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation

En vigtig komponent i design af lægemiddelleveringssystemer vedrører, hvordan man forstærker eller dæmper interaktioner med specifikke celletyper. For eksempel kan en kemoterapeutisk funktionaliseres med et antistof for at forbedre bindingen til kræftceller ("målretning") eller funktionaliseres med polyethylenglycol for at hjælpe med at undgå immuncellegenkendelse ("stealth"). Selv på celleniveau er optimering af bindingen og optagelsen af en lægemiddelbærer et komplekst biologisk designproblem. Det er således værdifuldt at adskille, hvor stærkt en ny transportør interagerer med en celle fra den funktionelle effektivitet af en transportørs last, når den er leveret til den celle.
For at fortsætte det kemoterapeutiske eksempel er "hvor godt det binder til en kræftcelle" et særskilt problem fra "hvor godt det dræber en kræftcelle". Kvantitative in vitro-assays for sidstnævnte er veletablerede og er normalt afhængige af måling af levedygtighed. Imidlertid er de fleste offentliggjorte undersøgelser af cellebærerinteraktioner kvalitative eller semikvantitative. Generelt er disse målinger afhængige af fluorescerende mærkning af bæreren og rapporterer følgelig interaktioner med celler i relative eller vilkårlige enheder. Dette arbejde kan imidlertid standardiseres og gøres absolut kvantitativt med et lille antal karakteriseringseksperimenter. En sådan absolut kvantificering er værdifuld, da den letter rationelle, inter- og intra-klasse sammenligninger af forskellige lægemiddelleveringssystemer-nanopartikler, mikropartikler, vira, antistof-lægemiddelkonjugater, konstruerede terapeutiske celler eller ekstracellulære vesikler.
Desuden er kvantificering en forudsætning for efterfølgende metaanalyser eller in silico-modelleringsmetoder . I denne artikel præsenteres videoguider samt et beslutningstræ for, hvordan man opnår in vitro-kvantificering for transportørlægemiddelleveringssystemer, der tager højde for forskelle i bærerstørrelse og mærkningsmodalitet. Derudover diskuteres yderligere overvejelser om kvantitativ vurdering af avancerede lægemiddelleveringssystemer. Dette er beregnet til at tjene som en værdifuld ressource til forbedring af rationel evaluering og design til den næste generation af medicin.

Som diskuteret tidligere kræver forskellige lægemiddelbærertyper anvendelse af forskellige teknikker til absolut kvantificering af cellebærerforening. For eksempel er 633 nm disulfidstabiliserede poly (methacrylsyre) (PMASH) kerneskalpartikler store og tætte nok til detektion ved hjælp af et følsomt flowcytometer. Som sådan blev disse partikler mærket fluorescerende, derefter gated og talt ved hjælp af sidevinkellysspredning (SALS, analog med SSC) samt den passende fluorescerende kanal (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

En arbejdsgang demonstreres for den absolutte kvantificering af lægemiddelbærer-celleinteraktioner ved hjælp af flowcytometri for at muliggøre bedre rationel evaluering af nye lægemiddelafgivelsessystemer. Denne arbejdsgang gælder for lægemiddelbærere af enhver art.

Eksperimentel kvantificering af interaktioner mellem lægemiddelleveringssystemer og celler in vitro: En vejledning til præklinisk nanomedicinsk evaluering

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Denne protokol giver kvantitative data om, hvordan bærersystemer interagerer med celler. Kvantitative data er nøglen til teknik og optimering. Det giver os mulighed for at bevæge os fra ja eller nej biologiske spørgsmål, til hvor mange spørgsmål.Denne teknik er nyttig til at konvertere resultater fra præklinisk lægemiddelbærerpræstation, som var kvalitative, til kvantitative resultater. Og dette virker, selv når du karakteriserer din transportør på et andet system, end du karakteriserer dine celler. Det kan tage et par iterationer at finde den optimale bærerfortynding, der falder inden for nanosidens lineære eller kvantitative intervaller.Tag dig god tid til at finde de rigtige forhold. Til at begynde med skal du montere flowcellen på lasermodulet. Skyl langsomt flowcellen med en hastighed på 0,1 ml pr. sekund med en milliliter destilleret vand.Hvis der dannes bobler i flowcellen, skal du trække suspensionen delvist tilbage for at flette boblen med luft-væske-grænsefladen, før du fortsætter. Lås derefter hele lasermodulet på plads inde i instrumentet. Start kameraet omtrent halvvejs gennem skylning.Sørg for at bekræfte, at bæreraffaldet er vasket ud. Vælg optagelse for at åbne fanen Optagelsesindstillinger, og klik på start kamera. Kør systemet med en milliliter luft.Hvis der er synlige statiske bærere på skærmen, skal flowcellen rengøres i henhold til producentens anvisninger. Forbered transportørerne til nanopartikelsporingsanalyse ved at sikre, at transportørerne er godt suspenderet via sonikering eller hvirvel, afhængigt af det involverede transportsystem. Fortynd bærerne i vand for at forberede mindst 0,6 til en milliliter af hver prøve med en bærerkoncentration mellem 1x10 til den syvende og 1x10 til de niende bærere pr. Milliliter.Tag lasermodulet ud og placer det lodret. Slip den første bærerprøve i en en milliliter sprøjte, og fastgør sprøjten til rørindløbet. Læg derefter prøven forsigtigt i flowcellen.Hvis der dannes bobler i flowcellen, trækkes suspensionen delvist tilbage for at flette boblen med luft-væske-grænsefladen, før du fortsætter. Sørg for, at hele flowcellen er fyldt med væske, og sæt derefter belastningen på pause. Juster kameraets fokus, hvis det er nødvendigt for at visualisere individuelle bærere.Foretag grove fokusjusteringer med den roterende knap på højre side af instrumentet. Foretag finere justeringer ved at vælge fanen Hardware. Skift fokus ved at justere fokusskyderen.For at sikre, at der ikke er nogen overmætning, skal du vælge det optimale kameraniveau ved at justere skyderen inden for optagelsesfanen. Hvis instrumentet er udstyret med dette tilbehør, lægges sprøjten indeholdende bærerprøven i sprøjtepumpen. Under fanen SOP skal du vælge standardmåling for at tage fem optagelser på hver 30 sekunder.Indtast basisfilnavnet, og tilføj om ønsket yderligere eksempeloplysninger ved at klikke på knappen Avanceret, som åbner en modal dialog med forskellige valg. Tryk på opret og kør script og vent på, at en pop-up vises, der beder om at forhåndsprøve. Hvis du bruger sprøjtepumpen, skal du vælge hardwarefanen og derefter sprøjtepumpefanen.Indstil den ønskede infusionshastighed, og tryk på infuse. Hvis du ikke bruger sprøjtepumpen, skal du manuelt fremrykke prøven. I pop op-vinduet skal du vælge OK for at begynde at fange.Efter hver af de fem optagelser, når den avancerede prøve dukker op igen, skal du kontrollere, at prøven stadig bevæger sig gennem flowcellen. Vælg derefter OK for at fortsætte med den næste optagelse. Under fanen proces skal du justere skyderen til detektionstærskel mellem fire og otte for korrekt at identificere forskellige bærere, der er synlige på skærmen.Du kan justere skærmforstærkningen for at hjælpe visualisering, det påvirker ikke downstream-analysen. I pop op-vinduet skal du trykke på okay for at starte sporingsanalyse. Overvåg analysens fremskridt ved at klikke på analysen i fanen enkelt analyse.Når analysen er færdig, skal du kigge efter en anmodning om eksportindstillinger, der vises. Bekræft, at oversigten med medtag PDF- og medtag eksperiment er valgt. Vælg andre eksportformater efter behov.I resultatafsnittet i PDF-dataeksporten skal du for at sikre, at den målte koncentration er pålidelig, kontrollere, at den målte bærerkoncentration er mellem 1x10 til den syvende og 1x10 til de niende bærere pr. milliliter, og kontrollere, om der er fejlmeddelelser eller advarsler under koncentrationsmåleresultatet. Gentag proceduren to eller flere gange med forskellige fortyndinger fra bestanden, og sørg for, at hver prøves koncentration falder inden for instrumentets lineære område. Beregn lagerbærerkoncentrationen som beskrevet i tekstmanuskriptet.Forbered den frie eller antistofkonjugerede fluorokromopløsning som beskrevet i tekstmanuskriptet. Beregn koncentrationen af stamopløsningen ud fra koncentrationen, molekylvægten og Avogadros tal som vist i ligningen. Udfør derefter en seriel fortynding af farvestoffet i bærerfortyndingsmidlet for at generere standardkurveprøver.Derefter tilsættes bærerprøven til målepladen, og fluorescensen måles ved hjælp af en mikropladelæser. Generer standardkurven som beskrevet i tekstmanuskriptet. Den absolutte fluorescensintensitet pr. bærestof beregnes ved at dividere bulkfluorescensen med bærerkoncentrationen.Opsæt flowcytometeret for det endelige bærercelleeksperiment ved at bestemme optimale PMT-spændingsindstillinger i de relevante kanaler. Kør en negativ kontrolprøve, hvor cellerne ikke inkuberes med bærere for at bestemme baggrundsfluorescensen. Forbered og genophæng flowcytometrikvantitetsperlerne.Brug den samme buffer som bruges til celleprøverne. Hvis perlepopulationerne leveres separat, skal du trække dem sammen. Kør flowcytometrikvantitetsperlen og bærercelleprøverne for at bestemme fluorescensintensiteten pr. Celle.Kør flowcytometerkvantitetsperlerne for at generere en standardkurve, der konverterer den absolutte fluorescerende intensitet til MFI. Brug dette til at beregne transportørernes teoretiske MFI som beskrevet i tekstmanuskriptet. Kør cellebærerprøverne for at bestemme fluorescerende intensitet pr. celle i hver prøve.Endelig beregnes antallet af bærere pr. celle for hver prøve ved at trække baggrundsfluorescensen fra prøvens målte fluorescens og derefter dividere med fluorescensen pr. Partikel. For 633 nanometer polymethacrylsyrekernepartikler var koncentrationen og fluorescerende intensitet pr. bærer direkte kvantificerbar ved hjælp af cytometerstrømmen. I modsætning hertil var 100 nanometer superparamagnetiske jernoxidnanopartikler for små til at detektere individuelt og blev analyseret ved hjælp af bulkstrømmen.Mærkede kvantitetsperler blev brugt på flere dage til at generere standardkurver på et flowcytometer. Korrelationen mellem den målte MFI og MESF-værdien af kvantitetsperlerne var lineær og stort set ens mellem de målte datoer. Tidsforløbseksperimenter ved hjælp af fluorescerende mærkede HeLa-celler med 235 nanometer polymethacrylsyrekapsler fra nul til 24 timer viste en stigning i MFI over tid, hvilket indikerer, at kapslerne var forbundet med HeLa-celler.Forskellen i det tilsyneladende cellulære respons på bærere var skarp, afhængigt af relativ eller absolut kvantificering. Den absolutte kvantificering var uafhængig af mærkningsintensitet og dermed mere sammenlignelig. Disse teknikker er grundlaget for dybere analyse og sammenligning af partikelydelse.Vi er begejstrede for at bruge disse teknikker til at parameterisere matematiske modeller, som giver os mulighed for at karakterisere partikelydelse uafhængigt af et bestemt eksperiment.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modeller og metoder til evaluering Transport af Drug Delivery Systems over cellulære Barrierer

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Tilpasning af Electrospinning proces med at give tre unikke miljøer for en Tri-lags<em&gt; In vitro</em&gt; Model af Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Sandwich-lignende mikromiljøer at udnytte Cell / Materiale Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Syntese af Functionalized 10-nm Polymer-belagt guld partikler til endotelet målretning og Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Omfattende evaluering af effektiviteten og sikkerheden af moderkagen-målrettet medicinafgivelse ved hjælp af tre komplementære metoder

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Brug af høj overførselshastighed automatiseret Microbioreactor System for produktion af Model IgG1 i CHO celler

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Rensning og analyse af et monoklonalt antistof fra ovarieceller fra kinesiske hamster ved hjælp af et automatiseret Mikrobioreaktor system

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

En kvantitativ Fluorescens mikroskopi-baseret enkelt Liposome-analyse til påvisning af den kompositoriske Inhomogenitet mellem individuelle Liposomer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primær afklaring af CHO Harvested Cell Culture Fluid ved hjælp af en akustisk separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...