Name: experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC; Program Grant No. GNT1149990), het Australian Centre for HIV and Hepatitis Virology Research (ACH2), evenals een gift uit de nalatenschap van Réjane Louise Langlois. F.C. erkent de toekenning van een Senior Principal Research Fellowship (GNT1135806) van de National Health and Medical Research Council (NHMRC). Figuur 1 en figuur 2 zijn gemaakt met BioRender.com.

1. De juiste stream kiezen
<ol><li>Volg de beslisboom in figuur 1 om de beste workflow (stream) (figuur 2) te bepalen voor de gebruikte experimentele opstelling. Raadpleeg de discussie voor meer commentaar op deze streamkeuze.</li>
	<li>Als u de cytometerstroom volgt, gaat u verder met stap 2.1.1-2.2.7. Als u de bulkstream volgt, gaat u verder met stappen 3.1.1.1-3.1.5.7.</li>
</ol><p class="jove_content biglegend" fo:keep-together.within-page...

<ol>
	<li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+ORgan+Targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR/Cas+gene+editing.">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+mRNA+vaccines:+A+biotech+and+industrial+perspective.">The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective.</a> npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).</li><li>Press, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo-carrier+interactions+significantly+contribute+to+micellar+conformation+and+biodistribution.">Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution.</a> NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).</li><li>Cevaal, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+T+cell-targeting+nanoparticle+drug+delivery+systems:+Considerations+for+rational+design.">In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design.</a> ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).</li><li>Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-nano+science:+Better+metrics+would+accelerate+progress.">Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress.</a> Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).</li><li>Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+level+of+nanoparticle+uptake+in+mammalian+cells+using+flow+cytometry.">Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry.</a> Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).</li><li>Lozano-Andr&#233;s, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+MESF-bead+based+assignment+of+absolute+fluorescence+values+to+nanoparticles+and+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Schwartz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalization+of+the+MESF+unit+of+fluorescence+intensity.">Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cell-particle+association+in+vitro:+A+quantitative+method+to+compare+particle+performance.">Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance.</a> Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Comfort, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+tracking+analysis+for+the+quantification+and+size+determination+of+extracellular+vesicles.">Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+particle+imaging+for+quantification+of+nano-+and+microparticles.">Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles.</a> Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+Towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISD3:+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems.">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).</li><li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions.">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).</li><li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density.">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature.">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li></ol>

Het karakteriseren van de interacties tussen medicijndragers en cellen wordt steeds belangrijker bij de ontwikkeling van nieuwe medicijnafgiftesystemen. Specifiek, om de rationele evaluatie en vergelijking van verschillende dragerconstructies mogelijk te maken, is absolute kwantificering van de prestaties van die drager om te interageren met doel- en off-target cellen van cruciaal belang. Dit protocol beschrijft een tweestromenmethodologie waarmee elke onderzoeker die met een medicijndrager werkt, relatieve, semikwantifi...

Het ontwerp van medicijnafgifteconstructies die specifiek, ontworpen gedrag vertonen, afhankelijk van welk celtype ze tegenkomen, heeft aanzienlijke onderzoeksinteresse getrokken. Potentiële medicijnafgifteconstructies of "dragers" omvatten lipideformuleringen, nanogekweekte anorganische, polymere assemblages, extracellulaire blaasjes, gefunctionaliseerde bacteriële cellen of gemodificeerde virussen. Al deze kunnen orgaan-, weefsel- of celspecificiteit vertonen als gevolg van fysische eigenschappen, oppervlakte-eigenschappen of gemanipuleerde chemische functionalisaties zoals antilichaamaanhechting 1,2.
Een bijna alomtegenwoordige stap in in vitro dragerschapsevaluatie is het incuberen van cellen met een suspensie die de met geneesmiddelen geladen drager bevat. Na incubatie worden de prestaties van de drager gemeten via een functionele uitlezing van de prestaties van de medicijnlading, bijvoorbeeld transfectie-efficiëntie of toxiciteit. Functionele uitlezingen zijn nuttig, omdat ze een downstream-maat zijn voor de effectiviteit van de drager. Voor complexere medicijnafgifteconstructies wordt het echter steeds belangrijker om verder te gaan dan functionele uitlezingen en afzonderlijk de mate van dragerinteractie met de cel van belang te kwantificeren. Daar zijn een paar redenen voor.
Ten eerste is er een toenemende interesse in het ontdekken (en iteratief verbeteren) van "platform" carrier-technologieën, die een verscheidenheid aan lading kunnen vervoeren. Lipide nanodeeltjes (LNP's) die zijn ontworpen om RNA in te kapselen, kunnen bijvoorbeeld de ene RNA-sequentie inruilen voor de andere met enkele kanttekeningen3. Om de carriertechnologie iteratief te verbeteren, is het dus van cruciaal belang om de prestaties ervan onafhankelijk van de vrachtfunctionaliteit te kwantificeren. Ten tweede zijn functionele uitlezingen mogelijk niet eenvoudig voor de lading van belang, waardoor het vermogen om vervoerdersformuleringen snel te herhalen en te evalueren in gevaar komt. Hoewel men in vitro optimalisatie zou kunnen uitvoeren met behulp van een modellading met een eenvoudige functionele uitlezing (bijvoorbeeld fluorescentie), kan het veranderen van de lading de biologische reactie op een drager4 veranderen en dus geen representatieve resultaten opleveren. Ten derde zijn veel dragers ontworpen om te interageren met en te worden opgenomen door een specifiek celtype. Een dergelijke targetingcapaciteit van een vervoerder kan en moet worden onderscheiden van de prestaties van zijn therapeutische vrachtposttargeting. Om het LNP-voorbeeld voort te zetten, kan een RNA-lading extreem krachtig zijn, maar als de LNP niet in staat is om aan de cel te binden, geïnternaliseerd te worden en het RNA vrij te geven, zal er geen downstream functioneel effect worden waargenomen. Dit kan met name een probleem zijn voor dragers die bedoeld zijn om zich te richten op moeilijk te transfecteren celtypen, zoals T-cellen5. Omgekeerd kan een LNP extreem effectief targeten, maar de RNA-lading functioneert mogelijk niet. Een downstream-test die alleen de vrachtfunctionaliteit meet, zal geen onderscheid kunnen maken tussen deze twee situaties, waardoor de ontwikkeling en optimalisatie van carrier-medicijnafgiftesystemen wordt bemoeilijkt.
In dit werk wordt besproken hoe de associatie van dragers absoluut kan worden gekwantificeerd. Associatie is een term die verwijst naar de experimenteel gemeten mate van interactie tussen een drager en een cel. Associatie maakt geen onderscheid tussen membraanbinding en internalisatie - een drager kan worden geassocieerd omdat deze gebonden is aan het celoppervlak of omdat de cel het heeft geïnternaliseerd. Associatie wordt vaak gemeten als onderdeel van celdrager-incubatie-experimenten. Historisch gezien is associatie gemeld in willekeurige fluorescerende eenheden (meestal "mediane fluorescentie-intensiteit" of MFI) of als "procentassociatie", statistieken waarvan de beperkingen eerder zijn besproken6. Kortom, deze metingen zijn niet vergelijkbaar tussen experimenten, laboratoria en medicijndragers vanwege verschillen in experimentele protocollen, flowcytometerinstellingen en de etiketteringsintensiteiten van verschillende dragers. Er zijn pogingen gedaan om de eerste te overwinnen door de cytometer te kalibreren, waardoor de relatieve maat van MFI wordt omgezet in een absoluut kwantitatieve maat voor fluorescentie7. Deze methode houdt echter geen rekening met de variabiliteit in de etiketteringsintensiteit van verschillende dragers en maakt dus geen rationele vergelijking van verschillende dragerprestaties in een doelcel van keuzemogelijk 8.
Hier wordt het praktisch converteren van relatieve, willekeurige fluorescerende eenheden naar de absolute kwantitatieve metriek van het "aantal dragers per cel" aangetoond door een klein aantal aanvullende karakteriseringsexperimenten uit te voeren. Als een andere metriek van dragerconcentratie gewenst is (bijvoorbeeld dragermassa per cel of dragervolume per cel), is het eenvoudig om te converteren van dragers per cel, op voorwaarde dat carrierkarakterisering is uitgevoerd. Kortheidshalve en om jargon te vermijden, wordt het woord "drager" in dit werk gebruikt om te verwijzen naar het enorme assortiment van medicijnafgifteconstructies. Deze kwantificeringstechnieken zijn even toepasbaar, of ze nu worden toegepast op een nano-gemanipuleerd gouddeeltje of een bio-engineered bacteriën.
Enkele feiten maken de omzetting van willekeurige fluorescerende eenheden naar dragers per cel mogelijk. Ten eerste is de gemeten fluorescentie-intensiteit evenredig met de concentratie van een fluorofoor9 (of een fluorescerend gelabelde drager), ervan uitgaande dat de fluorescentie binnen de detectiegrenzen van het instrument valt en de instrumentatie-instellingen hetzelfde zijn. Als de fluorescentie van een drager en de fluorescentie van een monster bekend zijn, kan men dus bepalen hoeveel dragers er in dat monster aanwezig zijn als alle metingen onder dezelfde instellingen en omstandigheden zijn uitgevoerd. Vooral voor kleinere dragers is het echter mogelijk niet mogelijk om dragerfluorescentie, celautofluorescentie en cel-geassocieerde fluorescentie te meten op hetzelfde instrument met dezelfde instellingen. In dit geval is er een tweede vereiste om het mogelijk te maken om te converteren tussen gemeten fluorescentie op het ene instrument en gemeten fluorescentie op een ander instrument. Om dit te doen, kan een standaardcurve van fluorofoorconcentratie worden vastgesteld om de fluorescentie-intensiteit op beide instrumenten te meten, gebruikmakend van de moleculen van equivalent oplosbaar fluorochroom (MESF) standaard9. Dit maakt het vervolgens mogelijk om de dragerfluorescentie in bulk te meten op een niet-cytometer, een meting die kan worden uitgevoerd op dragers van elke grootte of eigenschap. Wanneer een dergelijke bulkkwantificering wordt uitgevoerd op een dragersuspensie van bekende concentratie, kan het aantal dragers per cel van een monster opnieuw worden berekend.
Hoewel dit werk het proces demonstreert voor het meten van dragerassociatie (zoals bepaald door gemeten fluorescentie-intensiteit), kan een analoog protocol worden uitgevoerd voor andere metingen van cel-dragerinteractie (bijvoorbeeld een experimenteel protocol dat geïnternaliseerde en membraangebonden dragers differentieert). Bovendien zou dit protocol grotendeels hetzelfde zijn als de associatie werd gemeten door middel van een niet-fluorescerende test (bijvoorbeeld door massacytometrie).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20347</td>
			<td>pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apogee A50 Microflow</td>
			<td>Apogee</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>Tecan Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td>Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum MESF kits Alexa Fluor 647</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>647</td>
			<td>Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation

Een belangrijk onderdeel van het ontwerpen van medicijnafgiftesystemen betreft het versterken of verzwakken van interacties met specifieke celtypen. Een chemotherapeuticum kan bijvoorbeeld worden gefunctionaliseerd met een antilichaam om de binding aan kankercellen te verbeteren ("targeting") of gefunctionaliseerd met polyethyleenglycol om immuuncelherkenning te helpen ontwijken ("stealth"). Zelfs op cellulair niveau is het optimaliseren van de binding en opname van een medicijndrager een complex biologisch ontwerpprobleem. Het is dus waardevol om te scheiden hoe sterk een nieuwe drager interageert met een cel en de functionele effectiviteit van de lading van een vervoerder zodra deze in die cel is afgeleverd.
Om het chemotherapeutische voorbeeld voort te zetten, "hoe goed het bindt aan een kankercel" is een ander probleem dan "hoe goed het een kankercel doodt". Kwantitatieve in vitro assays voor de laatste zijn goed ingeburgerd en zijn meestal afhankelijk van het meten van de levensvatbaarheid. Het meeste gepubliceerde onderzoek naar cel-dragerinteracties is echter kwalitatief of semikwantitatief. Over het algemeen zijn deze metingen afhankelijk van fluorescerende etikettering van de drager en rapporteren bijgevolg interacties met cellen in relatieve of willekeurige eenheden. Dit werk kan echter worden gestandaardiseerd en absoluut kwantitatief worden gemaakt met een klein aantal karakteriseringsexperimenten. Een dergelijke absolute kwantificering is waardevol, omdat het rationele, inter- en intra-class vergelijkingen van verschillende medicijnafgiftesystemen - nanodeeltjes, microdeeltjes, virussen, antilichaam-geneesmiddelconjugaten, gemanipuleerde therapeutische cellen of extracellulaire blaasjes - vergemakkelijkt.
Bovendien is kwantificering een voorwaarde voor latere meta-analyses of in silico-modelleringsbenaderingen. In dit artikel worden videogidsen gepresenteerd, evenals een beslisboom voor het bereiken van in vitro kwantificering voor carrier drug delivery-systemen, die rekening houden met verschillen in dragergrootte en etiketteringsmodaliteit. Daarnaast worden verdere overwegingen voor de kwantitatieve beoordeling van geavanceerde toedieningssystemen voor geneesmiddelen besproken. Dit is bedoeld als een waardevolle bron om rationele evaluatie en ontwerp voor de volgende generatie geneeskunde te verbeteren.

Zoals eerder besproken, vereisen verschillende soorten medicijndragers het gebruik van verschillende technieken voor de absolute kwantificering van celdragerassociatie. Bijvoorbeeld, 633 nm disulfide-gestabiliseerde poly (methacrylzuur) (PMASH) kern-schil deeltjes zijn groot en dicht genoeg voor detectie met behulp van een gevoelige flowcytometer. Als zodanig werden deze deeltjes fluorescerend gelabeld, vervolgens omheind en geteld met behulp van zijhoeklichtverstrooiing (SALS, analoog aan SSC), evenals het ju...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Een workflow wordt gedemonstreerd voor de absolute kwantificering van geneesmiddeldrager-celinteracties met behulp van flowcytometrie om een betere rationele evaluatie van nieuwe medicijnafgiftesystemen mogelijk te maken. Deze workflow is van toepassing op drugsdragers van elk type.

Experimentele kwantificering van interacties tussen medicijnafgiftesystemen en cellen in vitro: een gids voor preklinische nanogeneeskunde-evaluatie

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Dit protocol biedt kwantitatieve gegevens over hoe dragersystemen interageren met cellen. Kwantitatieve gegevens zijn de sleutel tot engineering en optimalisatie. Het stelt ons in staat om van ja of nee biologische vragen, naar hoeveel vragen te gaan.Deze techniek is nuttig om resultaten van preklinische prestaties van geneesmiddelendragers, die kwalitatief waren, om te zetten in kwantitatieve resultaten. En dit werkt zelfs wanneer u uw drager op een ander systeem karakteriseert dan wanneer u uw cellen karakteriseert. Het kan een paar iteraties duren om de optimale dragerverdunning te vinden die binnen het lineaire of kwantitatieve bereik van de nanokant valt.Neem de tijd voor het vinden van de juiste voorwaarden. Om te beginnen monteert u de stroomcel op de lasermodule. Spoel de stroomcel langzaam met een snelheid van 0,1 milliliter per seconde met één milliliter gedestilleerd water.Als zich bellen vormen in de stroomcel, trekt u de suspensie gedeeltelijk in om de bel samen te voegen met de lucht-vloeistofinterface voordat u verder gaat. Vergrendel vervolgens de hele lasermodule op zijn plaats in het instrument. Start de camera ongeveer halverwege het spoelen.Zorg ervoor dat u bevestigt dat het dragerpuin is weggespoeld. Selecteer vastleggen om het tabblad opname-instellingen te openen en klik op Camera starten. Drijf het systeem aan met één milliliter lucht.Als er statische dragers zichtbaar zijn op het scherm, reinigt u de stroomcel volgens de instructies van de fabrikant. Bereid de dragers voor op nanodeeltjestraceringsanalyse door ervoor te zorgen dat de dragers goed zijn gesuspendeerd via ultrasoonapparaat of vortexing, afhankelijk van het betrokken dragersysteem. Verdun de dragers in water om ten minste 0,6 tot één milliliter van elk monster te bereiden met een dragerconcentratie tussen 1x10 tot de zevende en 1x10 tot de negende dragers per milliliter.Haal de lasermodule eruit en plaats deze rechtop. Laat het eerste dragermonster in een spuit van één milliliter vallen en bevestig de spuit aan de buisinlaat. Laad het monster vervolgens voorzichtig in de stroomcel.Als er bellen ontstaan in de stroomcel, trekt u de suspensie gedeeltelijk in om de bel samen te voegen met de lucht-vloeistofinterface voordat u verder gaat. Zorg ervoor dat de hele stroomcel is gevuld met vloeistof en pauzeer vervolgens het laden. Pas indien nodig de camerafocus aan om individuele dragers te visualiseren.Maak grove scherpstellingsaanpassingen met de draaiknop aan de rechterkant van het instrument. Breng fijnere aanpassingen aan door het tabblad Hardware te selecteren. Wijzig de scherpstelling door de focusschuifregelaar aan te passen.Om ervoor te zorgen dat er geen oververzadiging is, selecteert u het optimale cameraniveau door de schuifregelaar op het tabblad Vastleggen aan te passen. Als het instrument met dit accessoire is uitgerust, laadt u de spuit met het dragermonster in de spuitpomp. Selecteer op het tabblad SOP de optie standaardmeting om vijf opnamen van elk 30 seconden te maken.Voer de naam van het basisbestand in en voeg desgewenst aanvullende voorbeeldinformatie toe door op de geavanceerde knop te klikken die een modaal dialoogvenster met verschillende keuzes opent. Druk op script maken en uitvoeren en wacht tot er een pop-up verschijnt waarin wordt gevraagd om een voorbeeld vooraf te nemen. Als u de spuitpomp gebruikt, selecteert u het hardwaretabblad en vervolgens het tabblad spuitpomp.Stel de gewenste infusiesnelheid in en druk op infuse. Als u de spuitpomp niet gebruikt, dient u het monster handmatig te verplaatsen. Selecteer in het pop-upvenster OK om te beginnen met vastleggen.Controleer na elk van de vijf vangsten, wanneer het geavanceerde monster opnieuw verschijnt, of het monster nog steeds door de stroomcel beweegt. Selecteer vervolgens OK om door te gaan met de volgende opname. Stel op het tabblad Proces de schuifregelaar voor detectiedrempels in tussen vier en acht om de verschillende dragers die zichtbaar zijn op het scherm correct te identificeren.U kunt de schermversterking aanpassen om visualisatie te ondersteunen, dit heeft geen invloed op de downstream-analyse. Druk in de pop-up op OK om de trackinganalyse te starten. Volg de voortgang van de analyse door op de analyse in één analysetabblad te klikken.Zodra de analyse is voltooid, zoekt u naar een prompt voor exportinstellingen die wordt weergegeven. Controleer of de samenvatting van de pdf opnemen en het experiment opnemen is geselecteerd. Selecteer naar wens andere exportindelingen.Controleer in het gedeelte resultaten van de PDF-gegevensexport of de gemeten concentratie betrouwbaar is en controleer of de gemeten dragerconcentratie tussen 1x10 en de zevende en 1x10 tot de negende dragers per milliliter ligt en controleer op foutmeldingen of waarschuwingsberichten onder het concentratiemeetresultaat. Herhaal de procedure twee of meer keer met verschillende verdunningen uit de voorraad en zorg ervoor dat de concentratie van elk monster binnen het lineaire bereik van het instrument valt. Bereken de voorraaddragerconcentratie zoals beschreven in het tekstmanuscript.Bereid de vrije of antilichaam geconjugeerde fluorochroomoplossing zoals beschreven in het tekstmanuscript. Bereken de concentratie van de stamoplossing op basis van de concentratie, het molecuulgewicht en het getal van Avogadro zoals weergegeven in de vergelijking. Voer vervolgens een seriële verdunning van de kleurstof in het dragerverdunningsmiddel uit om standaardcurvemonsters te genereren.Voeg vervolgens het dragermonster toe aan de meetplaat en meet fluorescentie met behulp van een microplaatlezer. Genereer de standaardcurve zoals beschreven in het tekstmanuscript. Bereken de absolute fluorescentie-intensiteit per drager door de bulkfluorescentie te delen door de dragerconcentratie.Stel de flowcytometer in voor het uiteindelijke dragercelexperiment door optimale PMT-spanningsinstellingen in de relevante kanalen te bepalen. Voer een negatief controlemonster uit waarbij de cellen niet zijn geïncubeerd met dragers om de achtergrondfluorescentie te bepalen. Bereid de flowcytometriekwantificeringsparels voor en suspensie opnieuw.Gebruik dezelfde buffer als voor de celmonsters. Als de kralenpopulaties afzonderlijk worden verstrekt, trek ze dan samen. Voer de flowcytometriekwantificeringskraal en de dragercelmonsters uit om de fluorescentie-intensiteit per cel te bepalen.Voer de quantitatiekralen van de flowcytometer uit om een standaardcurve te genereren, waarbij de absolute fluorescerende intensiteit wordt omgezet in MFI. Gebruik dit om de theoretische MFI van de dragers te berekenen zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voer de celdragermonsters uit om de fluorescerende intensiteit per cel van elk monster te bepalen.Bereken ten slotte het aantal dragers per cel voor elk monster door de achtergrondfluorescentie af te trekken van de gemeten fluorescentie van het monster en vervolgens te delen door de fluorescentie per deeltje. Voor 633 nanometer Polymethacrylzuur kernschildeeltjes waren de concentratie en fluorescerende intensiteit per drager direct kwantificeerbaar met behulp van de cytometerstroom. Daarentegen waren 100 nanometer super paramagnetische ijzeroxide nanodeeltjes te klein om individueel te detecteren en werden geanalyseerd met behulp van de bulkstroom.Gelabelde quantitatiekorrels werden op meerdere dagen gebruikt om standaardcurven op een flowcytometer te genereren. De correlatie tussen de gemeten MFI en de MESF-waarde van de quantitatiekorrels was lineair en in grote lijnen vergelijkbaar tussen de gemeten data. Tijdsverloopexperimenten met fluorescerende gelabelde HeLa-cellen met 235 nanometer polymethacrylzuurcapsules van nul tot 24 uur toonden een toename van de MFI in de loop van de tijd, wat aangeeft dat de capsules geassocieerd waren met HeLa-cellen.Het verschil in de schijnbare cellulaire respons op dragers was groot, afhankelijk van relatieve of absolute kwantificering. De absolute kwantificering was onafhankelijk van de labelintensiteit en dus meer vergelijkbaar. Deze technieken vormen de basis voor een diepere analyse en vergelijking van deeltjesprestaties.We zijn enthousiast over het gebruik van deze technieken om wiskundige modellen te parametriseren waarmee we deeltjesprestaties onafhankelijk van een bepaald experiment kunnen karakteriseren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modellen en methoden om vervoer van Drug Delivery Systems Across Cellular Barrières Evalueer

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Aanpassing van de elektrospinproces te bieden drie unieke omgevingen voor een Tri-layered<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de Airway Muur

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Sandwich-achtige microenvironments Harness Cell / Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Synthese van matiemaatschappij 10-nm polymeer beklede gouddeeltjes voor endotheel Targeting en Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Uitgebreide evaluatie van de effectiviteit en veiligheid van Placenta-gerichte Drug Delivery met behulp van drie aanvullende methoden

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Gebruik van High-Throughput geautomatiseerd Microbioreactor-systeem voor de productie van Model IgG1 in CHO cellen

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Een kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebaseerde enkelvoudige liposoom test voor het opsporen van de compositorische Inhomogeniteit tussen individuele liposomen

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primaire verduidelijking van CHO-geoogste celkweekvloeistof met behulp van een akoestische separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...