Name: experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par l’Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC; Subvention de programme no GNT1149990), l’Australian Centre for HIV and Hepatitis Virology Research (ACH2), ainsi qu’un don de la succession de Réjane Louise Langlois. F.C. reconnaît l’attribution d’une bourse de recherche principale principale du National Health and Medical Research Council (NHMRC) (GNT1135806). Les figures 1 et 2 ont été créées avec BioRender.com.

1. Choisir le flux approprié
<ol><li>Suivez l’arbre de décision décrit à la figure 1 pour déterminer le meilleur flux de travail (flux) (Figure 2) pour la configuration expérimentale utilisée. Reportez-vous à la discussion pour d’autres commentaires sur ce choix de filière.</li>
	<li>Si vous suivez le flux du cytomètre, passez aux étapes 2.1.1-2.2.7. Si vous suivez le flux en bloc, passez aux étapes 3.1.1.1-3.1.5.7.</li>
</ol><...

<ol>
	<li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+ORgan+Targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR/Cas+gene+editing.">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+mRNA+vaccines:+A+biotech+and+industrial+perspective.">The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective.</a> npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).</li><li>Press, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo-carrier+interactions+significantly+contribute+to+micellar+conformation+and+biodistribution.">Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution.</a> NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).</li><li>Cevaal, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+T+cell-targeting+nanoparticle+drug+delivery+systems:+Considerations+for+rational+design.">In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design.</a> ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).</li><li>Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-nano+science:+Better+metrics+would+accelerate+progress.">Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress.</a> Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).</li><li>Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+level+of+nanoparticle+uptake+in+mammalian+cells+using+flow+cytometry.">Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry.</a> Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).</li><li>Lozano-Andr&#233;s, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+MESF-bead+based+assignment+of+absolute+fluorescence+values+to+nanoparticles+and+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Schwartz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalization+of+the+MESF+unit+of+fluorescence+intensity.">Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cell-particle+association+in+vitro:+A+quantitative+method+to+compare+particle+performance.">Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance.</a> Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Comfort, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+tracking+analysis+for+the+quantification+and+size+determination+of+extracellular+vesicles.">Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+particle+imaging+for+quantification+of+nano-+and+microparticles.">Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles.</a> Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+Towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISD3:+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems.">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).</li><li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions.">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).</li><li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density.">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature.">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li></ol>

La caractérisation des interactions entre les transporteurs de médicaments et les cellules devient de plus en plus importante dans le développement de nouveaux systèmes d’administration de médicaments. Plus précisément, pour permettre l’évaluation rationnelle et la comparaison de diverses constructions de porteurs, il est essentiel de quantifier la performance de ce transporteur pour interagir avec les cellules cibles et hors cible. Ce protocole décrit une méthodologie à deux volets qui permet à tout cher...

La conception de constructions d’administration de médicaments qui présentent un comportement spécifique et conçu en fonction du type de cellule qu’elles rencontrent a suscité un intérêt considérable de la recherche. Les constructions potentielles d’administration de médicaments ou « porteurs » comprennent les formulations lipidiques, les inorganiques nanocultivés, les assemblages polymères, les vésicules extracellulaires, les cellules bactériennes fonctionnalisées ou les virus modifiés. Tous ces éléments peuvent présenter une spécificité d’organe, de tissu ou de cellule en raison de propriétés physiques, de propriétés de surface ou de fonctionnalisations chimiques modifiées telles que la fixation d’anticorps 1,2.
Une étape presque omniprésente dans l’évaluation in vitro des porteurs consiste à incuber des cellules avec une suspension contenant ledit porteur chargé de médicament. Après l’incubation, la performance du transporteur est mesurée par une lecture fonctionnelle de la performance de la cargaison de drogue, par exemple, l’efficacité de la transfection ou la toxicité. Les lectures fonctionnelles sont utiles, car elles constituent une mesure en aval de l’efficacité des porteurs. Cependant, pour les constructions d’administration de médicaments plus complexes, il est de plus en plus important d’aller au-delà des lectures fonctionnelles et de quantifier séparément le degré d’interaction du porteur avec la cellule d’intérêt. Il y a plusieurs raisons à cela.
Tout d’abord, il y a un intérêt croissant pour la découverte (et l’amélioration itérative) des technologies de porte-avions « plates-formes », qui peuvent transporter une variété de marchandises. Par exemple, les nanoparticules lipidiques (LNP) conçues pour encapsuler l’ARN peuvent échanger une séquence d’ARN contre une autre avec quelques mises en garde3. Ainsi, pour améliorer de manière itérative la technologie du transporteur, il est essentiel de quantifier ses performances indépendamment de la fonctionnalité de fret. Deuxièmement, les lectures fonctionnelles peuvent ne pas être simples pour la cargaison d’intérêt, ce qui compromet la capacité d’itérer et d’évaluer rapidement les formulations des transporteurs. Alors que l’on pourrait effectuer une optimisation in vitro en utilisant un modèle de cargaison avec une lecture fonctionnelle simple (par exemple, la fluorescence), le changement de la cargaison peut modifier la réponse biologique à un transporteur4 et peut donc ne pas donner de résultats représentatifs. Troisièmement, de nombreux porteurs sont conçus pour interagir avec un type de cellule spécifique et être absorbés par celui-ci. Cette capacité de ciblage d’un transporteur peut et doit être différenciée de l’exécution de son ciblage thérapeutique de poste de chargement. Pour continuer l’exemple de la LNP, une cargaison d’ARN peut être extrêmement puissante, mais si la LNP est incapable de se lier à la cellule, d’être internalisée et de libérer l’ARN, aucun effet fonctionnel en aval ne sera observé. Cela peut être un problème en particulier pour les porteurs destinés à cibler les types de cellules difficiles à transfecter, tels que les cellules T5. Inversement, une LNP pourrait cibler extrêmement efficacement, mais la cargaison d’ARN pourrait ne pas fonctionner. Un test en aval qui ne mesure que la fonctionnalité du fret ne sera pas en mesure de différencier ces deux situations, ce qui compliquera le développement et l’optimisation des systèmes d’administration de médicaments des transporteurs.
Dans ce travail, comment quantifier absolument l’association de transporteurs est discuté. L’association est un terme qui fait référence au degré d’interaction mesuré expérimentalement entre un porteur et une cellule. L’association ne fait pas la différence entre la liaison membranaire et l’internalisation - un transporteur peut être associé parce qu’il est lié à la surface de la cellule ou parce que la cellule l’a internalisée. L’association est généralement mesurée dans le cadre d’expériences d’incubation de porteurs cellulaires. Historiquement, l’association a été rapportée soit dans des unités fluorescentes arbitraires (généralement « intensité de fluorescence médiane » ou MFI), soit sous forme de « pourcentage d’association », des mesures dont les limites ont été discutéesprécédemment 6. En bref, ces mesures ne sont pas comparables entre les expériences, les laboratoires et les transporteurs de médicaments en raison des différences dans les protocoles expérimentaux, les paramètres du cytomètre en flux et les intensités de marquage des différents supports. Des efforts ont été faits pour surmonter le premier en calibrant le cytomètre, convertissant ainsi la mesure relative de l’IMF en une mesure absolument quantitative de la fluorescence7. Cependant, cette méthode ne tient pas compte de la variabilité de l’intensité de marquage des différents porteurs et, par conséquent, ne permet pas la comparaison rationnelle des performances de divers porteurs dans une cellule cible de choix8.
Ici, la façon de convertir pratiquement des unités fluorescentes relatives et arbitraires à la métrique quantitative absolue du « nombre de porteurs par cellule » est démontrée en effectuant un petit nombre d’expériences de caractérisation supplémentaires. Si une autre mesure de la concentration de la porteuse est souhaitée (p. ex., masse porteuse par pile ou volume porteur par cellule), il est facile de convertir à partir de porteuses par cellule, à condition que la caractérisation de la porteuse ait été effectuée. Par souci de concision et pour éviter le jargon, le mot « porteur » est utilisé dans ce travail pour désigner le vaste assortiment de constructions d’administration de médicaments. Ces techniques de quantification sont également applicables, qu’elles soient appliquées à une particule d’or nano-modifiée ou à une bactérie bio-modifiée.
Quelques faits permettent la conversion d’unités fluorescentes arbitraires en porteurs par cellule. Premièrement, l’intensité de fluorescence mesurée est proportionnelle à la concentration d’un fluorophore9 (ou d’un support marqué par fluorescence), en supposant que la fluorescence est dans les limites de détection de l’instrument et que les réglages de l’instrumentation sont les mêmes. Ainsi, si la fluorescence d’un porteur et la fluorescence d’un échantillon sont connues, on peut déterminer combien de porteurs sont présents dans cet échantillon si toutes les mesures ont été effectuées dans les mêmes paramètres et conditions. Cependant, en particulier pour les petits porteurs, il peut ne pas être possible de mesurer la fluorescence des porteuses, l’autofluorescence cellulaire et la fluorescence des cellules associées aux porteuses sur le même instrument avec les mêmes réglages. Dans ce cas, il existe une deuxième exigence pour permettre la conversion entre la fluorescence mesurée sur un instrument et la fluorescence mesurée sur un autre. Pour ce faire, une courbe standard de concentration en fluorophore peut être établie pour mesurer l’intensité de fluorescence sur les deux instruments, en tirant parti de la norme MESF (Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome)9. Cela permet ensuite de mesurer la fluorescence des porteurs en vrac sur un non-cytomètre, une mesure qui peut être effectuée sur des porteurs de toute taille ou caractéristique. Lorsqu’une telle quantification globale est effectuée sur une suspension de support de concentration connue, le nombre de porteurs par cellule d’un échantillon peut, encore une fois, être calculé.
Bien que ce travail démontre le processus de mesure de l’association des porteurs (telle que déterminée par l’intensité de fluorescence mesurée), un protocole analogue pourrait être effectué pour d’autres mesures de l’interaction cellule-porteur (par exemple, un protocole expérimental qui différencie les porteurs internalisés et liés à la membrane). De plus, ce protocole serait en grande partie le même si l’association était mesurée par un test non fluorescent (par exemple, par cytométrie de masse).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20347</td>
			<td>pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apogee A50 Microflow</td>
			<td>Apogee</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>Tecan Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td>Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum MESF kits Alexa Fluor 647</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>647</td>
			<td>Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation

Un élément majeur de la conception de systèmes d’administration de médicaments concerne la façon d’amplifier ou d’atténuer les interactions avec des types de cellules spécifiques. Par exemple, une chimiothérapie peut être fonctionnalisée avec un anticorps pour améliorer la liaison aux cellules cancéreuses (« ciblage ») ou fonctionnalisée avec du polyéthylèneglycol pour aider à échapper à la reconnaissance des cellules immunitaires (« furtivité »). Même au niveau cellulaire, l’optimisation de la liaison et de l’absorption d’un vecteur de médicament est un problème de conception biologique complexe. Ainsi, il est utile de séparer la force avec laquelle un nouveau transporteur interagit avec une cellule de l’efficacité fonctionnelle de la cargaison d’un transporteur une fois livrée à cette cellule.
Pour poursuivre l’exemple chimiothérapeutique, « comment il se lie à une cellule cancéreuse » est un problème distinct de « dans quelle mesure il tue une cellule cancéreuse ». Les essais quantitatifs in vitro pour ces derniers sont bien établis et reposent généralement sur la mesure de la viabilité. Cependant, la plupart des recherches publiées sur les interactions cellule-transporteur sont qualitatives ou semi-quantitatives. Généralement, ces mesures reposent sur le marquage fluorescent du support et, par conséquent, rapportent des interactions avec les cellules en unités relatives ou arbitraires. Cependant, ce travail peut être standardisé et rendu absolument quantitatif avec un petit nombre d’expériences de caractérisation. Une telle quantification absolue est précieuse, car elle facilite les comparaisons rationnelles, interclasses et intra-classes de divers systèmes d’administration de médicaments - nanoparticules, microparticules, virus, conjugués anticorps-médicament, cellules thérapeutiques modifiées ou vésicules extracellulaires.
De plus, la quantification est une condition préalable aux méta-analyses ultérieures ou aux approches de modélisation in silico . Dans cet article, des guides vidéo, ainsi qu’un arbre de décision sur la façon de réaliser une quantification in vitro pour les systèmes d’administration de médicaments porteurs, sont présentés, qui prennent en compte les différences de taille de support et de modalité d’étiquetage. En outre, d’autres considérations pour l’évaluation quantitative des systèmes avancés d’administration de médicaments sont discutées. Ceci est destiné à servir de ressource précieuse pour améliorer l’évaluation rationnelle et la conception de la prochaine génération de médecine.

Comme discuté précédemment, différents types de transporteurs de médicaments nécessitent l’utilisation de différentes techniques pour la quantification absolue de l’association cellule-porteur. Par exemple, les particules de noyau stabilisé en poly(acide méthacrylique) (PMASH) stabilisé au disulfure de 633 nm sont suffisamment grandes et denses pour être détectées à l’aide d’un cytomètre en flux sensible. Ainsi, ces particules ont été marquées par fluorescence, puis fermées et compt?...

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Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Un flux de travail est démontré pour la quantification absolue des interactions médicamenteuses-cellules porteuses à l’aide de la cytométrie en flux afin de permettre une meilleure évaluation rationnelle des nouveaux systèmes d’administration de médicaments. Ce flux de travail s’applique aux transporteurs de médicaments de tout type.

Quantification expérimentale des interactions entre les systèmes d’administration de médicaments et les cellules in vitro : Guide d’évaluation préclinique de la nanomédecine

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Ce protocole fournit des données quantitatives sur la façon dont les systèmes porteurs interagissent avec les cellules. Les données quantitatives sont essentielles pour l’ingénierie et l’optimisation. Cela nous permet de passer de questions biologiques oui ou non à combien de questions.Cette technique est utile pour convertir les résultats de la performance préclinique des porteurs de médicaments, qui étaient qualitatifs, en résultats quantitatifs. Et cela fonctionne même lorsque vous caractérisez votre porteur sur un système différent de celui que vous caractérisez vos cellules. Il peut falloir quelques itérations pour trouver la dilution de porteuse optimale qui se situe dans les plages linéaires ou quantitatives du côté nano.Prenez votre temps pour trouver les bonnes conditions. Pour commencer, montez la cellule d’écoulement sur le module laser. Rincez lentement la cellule d’écoulement à raison de 0,1 millilitre par seconde avec un millilitre d’eau distillée.Si des bulles se forment à l’intérieur de la cellule d’écoulement, rétractez partiellement la suspension pour fusionner la bulle avec l’interface air-liquide avant de continuer. Verrouillez ensuite l’ensemble du module laser en place à l’intérieur de l’instrument. Démarrez l’appareil photo à peu près à mi-chemin du rinçage.Assurez-vous de confirmer que les débris du support sont emportés. Sélectionnez capture pour ouvrir l’onglet Paramètres de capture et cliquez sur Démarrer la caméra. Pilotez le système avec un millilitre d’air.Si des supports statiques sont visibles à l’écran, nettoyez la cellule d’écoulement conformément aux instructions du fabricant. Préparez les porteurs à l’analyse de suivi des nanoparticules, en vous assurant que les porteurs sont bien suspendus par sonication ou vortex, selon le système de support impliqué. Diluer les supports dans l’eau pour préparer au moins 0,6 à un millilitre de chaque échantillon avec une concentration de support comprise entre 1x10 au septième et 1x10 au neuvième porteur par millilitre.Retirez le module laser et placez-le à la verticale. Déposez le premier échantillon porteur dans une seringue d’un millilitre et fixez la seringue à l’entrée du tube. Ensuite, chargez soigneusement l’échantillon dans la cellule d’écoulement.Si des bulles se forment à l’intérieur de la cellule d’écoulement, rétractez partiellement la suspension pour fusionner la bulle avec l’interface air-liquide avant de continuer. Assurez-vous que toute la cellule d’écoulement est remplie de liquide, puis interrompez le chargement. Ajustez la mise au point de la caméra si nécessaire pour visualiser les supports individuels.Effectuez des réglages de mise au point grossiers avec le bouton rotatif situé sur le côté droit de l’instrument. Effectuez des ajustements plus fins en sélectionnant l’onglet Matériel. Modifiez la mise au point en ajustant le curseur de mise au point.Pour vous assurer qu’il n’y a pas de sursaturation, sélectionnez le niveau optimal de la caméra en ajustant le curseur dans l’onglet de capture. Si l’instrument est équipé de cet accessoire, chargez la seringue contenant l’échantillon porteur dans la pompe à seringue. Sous l’onglet SOP, sélectionnez la mesure standard pour effectuer cinq captures de 30 secondes chacune.Entrez le nom du fichier de base et, si vous le souhaitez, ajoutez des informations supplémentaires en cliquant sur le bouton avancé qui ouvrira une boîte de dialogue modale avec différents choix. Appuyez sur créer et exécuter le script et attendez qu’une fenêtre contextuelle apparaisse vous demandant de faire avancer l’échantillon. Si vous utilisez la pompe à seringue, sélectionnez l’onglet Matériel, puis l’onglet Pompe à seringue.Régler le débit de perfusion souhaité et appuyer sur infuser. Si vous n’utilisez pas la pompe à seringue, avancez manuellement l’échantillon. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez OK pour lancer la capture.Après chacune des cinq captures, lorsque la fenêtre contextuelle s’il vous plaît échantillon avancé réapparaît, vérifiez que l’échantillon se déplace toujours dans la cellule d’écoulement. Sélectionnez ensuite OK pour procéder à la capture suivante. Dans l’onglet processus, réglez le curseur du seuil de détection entre quatre et huit pour identifier correctement les transporteurs distincts visibles à l’écran.Vous pouvez ajuster le gain de l’écran pour faciliter la visualisation, cela n’affectera pas l’analyse en aval. Dans la fenêtre contextuelle, appuyez sur OK pour lancer l’analyse du suivi. Surveillez la progression de l’analyse en cliquant sur l’analyse dans un seul onglet d’analyse.Une fois l’analyse terminée, recherchez une invite de paramètres d’exportation qui s’affiche. Vérifiez que l’option Inclure PDF et inclure le résumé de l’expérience est sélectionnée. Sélectionnez les autres formats d’exportation souhaités.Dans la section des résultats de l’exportation de données PDF, pour vous assurer que la concentration mesurée est fiable, vérifiez que la concentration de support mesurée est comprise entre 1x10 au septième et 1x10 à la neuvième porteuse par millilitre et vérifiez s’il y a des messages d’erreur ou des messages de prudence sous le résultat de la mesure de la concentration. Répétez la procédure deux fois ou plus avec des dilutions différentes du stock et assurez-vous que la concentration de chaque échantillon se situe dans la plage linéaire de l’instrument. Calculez la concentration du porteur de stock comme décrit dans le manuscrit du texte.Préparer la solution de fluorochrome libre ou conjuguée aux anticorps comme décrit dans le manuscrit. Calculez la concentration de la solution mère à partir de la concentration, du poids moléculaire et du nombre d’Avogadro comme indiqué dans l’équation. Effectuez ensuite une dilution en série du colorant dans le diluant porteur pour générer des échantillons de courbe standard.Ajoutez ensuite l’échantillon porteur à la plaque de mesure et mesurez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques. Générez la courbe standard telle que décrite dans le manuscrit textuel. Calculer l’intensité absolue de fluorescence par porteur en divisant la fluorescence apparente par la concentration du porteur.Configurez le cytomètre en flux pour l’expérience finale de cellule porteuse en déterminant les réglages optimaux de tension PMT dans les canaux appropriés. Exécuter un échantillon témoin négatif où les cellules ne sont pas incubées avec des porteurs pour déterminer la fluorescence de fond. Préparer et remettre en suspension les billes de quantification de cytométrie en flux.Utilisez le même tampon que celui utilisé pour les échantillons de cellules. Si les populations de billes sont fournies séparément, rassemblez-les. Exécutez le cordon de quantification de cytométrie en flux et les échantillons de cellules porteuses pour déterminer l’intensité de fluorescence par cellule.Exécutez les billes de quantification du cytomètre en flux pour générer une courbe standard, convertissant l’intensité fluorescente absolue en MFI. Utilisez-le pour calculer l’IMF théorique des transporteurs tel que décrit dans le manuscrit du texte. Exécutez les échantillons de vecteurs de cellules pour déterminer l’intensité fluorescente par cellule de chaque échantillon.Enfin, calculez le nombre de porteurs par cellule pour chaque échantillon en soustrayant la fluorescence de fond de la fluorescence mesurée de l’échantillon, puis en divisant par la fluorescence par particule. Pour 633 nanomètres de particules de noyau d’acide polyméthacrylique, la concentration et l’intensité fluorescente par porteur étaient directement quantifiables à l’aide du flux du cytomètre. En revanche, les nanoparticules d’oxyde de fer super paramagnétique de 100 nanomètres étaient trop petites pour être détectées individuellement et ont été analysées à l’aide du flux en vrac.Des billes de quantification marquées ont été utilisées pendant plusieurs jours pour générer des courbes standard sur un cytomètre en flux. La corrélation entre l’IMF mesurée et la valeur MESF des billes de quantification était linéaire et globalement similaire entre les dates mesurées. Des expériences de cours temporels utilisant des cellules HeLa marquées par fluorescence avec des capsules d’acide polyméthacrylique de 235 nanomètres de zéro à 24 heures ont montré une augmentation de l’IMF au fil du temps, indiquant que les capsules s’associaient aux cellules HeLa.La différence dans la réponse cellulaire apparente aux porteurs était frappante, selon la quantification relative ou absolue. La quantification absolue était indépendante de l’intensité de l’étiquetage et donc plus comparable. Ces techniques sont à la base d’une analyse et d’une comparaison plus approfondies des performances des particules.Nous sommes enthousiastes à l’idée d’utiliser ces techniques pour paramétrer des modèles mathématiques qui nous permettront de caractériser les performances des particules indépendamment de toute expérience particulière.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modèles et méthodes pour évaluer le transport des Drug Delivery Systems à travers les barrières cellulaires

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Recherche

Bio-ingénierie

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Irritation des yeux Test (IET) pour l&#39;identification des dangers des produits chimiques irritants oculaires utilisant épithélial (RHCE) Tissue modèle reconstruit humain Cornea-like

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapter le processus Électrofilage de fournir trois environnements uniques pour un Tri-couches<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle du mur Airway

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Microenvironnements sandwich à exploiter cellulaires / Interactions matérielles

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Synthèse des fonctionnalisées 10 nm revêtement polymère des particules d’or pour le ciblage de l’endothélium et MEDICAMENTS

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Évaluation globale de l’efficacité et l’innocuité de la délivrance de médicaments ciblés Placenta en utilisant trois méthodes complémentaires

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Utilisation du haut débit MICROBIOREACTEUR système automatisé pour la Production d’IgG1 de modèle dans les cellules CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Purification et analyse d'un anticorps monoclonal à partir de cellules ovaires de hamster chinois à l'aide d'un système automatisé de microbioréacteur

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Clarification primaire du fluide de culture cellulaire récolté par CHO à l’aide d’un séparateur acoustique

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...