Name: experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC; Program Grant No. GNT1149990), dem Australian Centre for HIV and Hepatitis Virology Research (ACH2), sowie eine Schenkung aus dem Nachlass von Réjane Louise Langlois. F.C. erkennt die Vergabe eines National Health and Medical Research Council (NHMRC) Senior Principal Research Fellowship (GNT1135806) an. Abbildung 1 und Abbildung 2 wurden mit BioRender.com erstellt.

1. Auswahl des passenden Streams
<ol><li>Befolgen Sie die in Abbildung 1 dargestellte Entscheidungsstruktur, um den besten Workflow (Stream) (Abbildung 2) für den verwendeten Versuchsaufbau zu ermitteln. Weitere Kommentare zu dieser Stream-Auswahl finden Sie in der Diskussion.</li>
	<li>Wenn Sie dem Zytometer-Stream folgen, fahren Sie mit den Schritten 2.1.1-2.2.7 fort. Wenn Sie dem Massenstream folgen, fahren Sie mit den Schritten 3.1.1.1-3....

<ol>
	<li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+ORgan+Targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR/Cas+gene+editing.">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Jackson, N. A. C., Kester, K. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+T+cell-targeting+nanoparticle+drug+delivery+systems:+Considerations+for+rational+design.">In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design.</a> ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).</li><li>Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-nano+science:+Better+metrics+would+accelerate+progress.">Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress.</a> Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).</li><li>Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+level+of+nanoparticle+uptake+in+mammalian+cells+using+flow+cytometry.">Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry.</a> Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).</li><li>Lozano-Andr&#233;s, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+MESF-bead+based+assignment+of+absolute+fluorescence+values+to+nanoparticles+and+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Schwartz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalization+of+the+MESF+unit+of+fluorescence+intensity.">Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cell-particle+association+in+vitro:+A+quantitative+method+to+compare+particle+performance.">Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance.</a> Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Comfort, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+tracking+analysis+for+the+quantification+and+size+determination+of+extracellular+vesicles.">Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+particle+imaging+for+quantification+of+nano-+and+microparticles.">Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles.</a> Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+Towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISD3:+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems.">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).</li><li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions.">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).</li><li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density.">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature.">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li></ol>

Die Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffträgern und Zellen gewinnt bei der Entwicklung neuartiger Wirkstoffabgabesysteme zunehmend an Bedeutung. Insbesondere um die rationale Bewertung und den Vergleich verschiedener Trägerkonstrukte zu ermöglichen, ist die absolute Quantifizierung der Leistung des Trägers bei der Interaktion mit Ziel- und Off-Target-Zellen von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll beschreibt eine Zwei-Stream-Methodik, die es jedem Forscher, der mit einem Wirkstoffträger ar...

Das Design von Medikamentenabgabekonstrukten, die je nach Zelltyp ein spezifisches, entworfenes Verhalten aufweisen, hat erhebliches Forschungsinteresse geweckt. Potenzielle Wirkstoffabgabekonstrukte oder "Träger" umfassen Lipidformulierungen, nanogewachsene anorganische Substanzen, polymere Anordnungen, extrazelluläre Vesikel, funktionalisierte Bakterienzellen oder modifizierte Viren. Alle diese können Organ-, Gewebe- oder Zellspezifität aufgrund physikalischer Eigenschaften, Oberflächeneigenschaften oder technischer chemischer Funktionalisierungen wie Antikörperbindung 1,2 aufweisen.
Ein fast allgegenwärtiger Schritt in der In-vitro-Trägerbewertung besteht darin, Zellen mit einer Suspension zu inkubieren, die den medikamentenbeladenen Träger enthält. Nach der Inkubation wird die Trägerleistung über eine funktionale Anzeige der Leistung der Arzneimittelladung gemessen, z. B. Transfektionseffizienz oder Toxizität. Funktionale Anzeigen sind nützlich, da sie ein nachgelagertes Maß für die Wirksamkeit des Trägers sind. Für komplexere Wirkstoffabgabekonstrukte wird es jedoch immer wichtiger, über funktionale Messwerte hinauszugehen und den Grad der Trägerinteraktion mit der interessierenden Zelle separat zu quantifizieren. Dafür gibt es mehrere Gründe.
Erstens besteht ein zunehmendes Interesse an der Entdeckung (und iterativen Verbesserung) von "Plattform"-Trägertechnologien, die eine Vielzahl von Fracht transportieren können. Zum Beispiel können Lipid-Nanopartikel (LNPs), die RNA verkapseln sollen, eine RNA-Sequenz mit wenigen Einschränkungen gegen eine andere austauschen3. Um die Trägertechnologie iterativ zu verbessern, ist es daher wichtig, ihre Leistung unabhängig von der Frachtfunktionalität zu quantifizieren. Zweitens sind funktionale Anzeigen für die Ladung von Interesse möglicherweise nicht einfach und beeinträchtigen die Fähigkeit, Trägerformulierungen schnell zu iterieren und zu bewerten. Während man eine In-vitro-Optimierung mit einer Modellladung mit einer einfachen funktionellen Anzeige (z. B. Fluoreszenz) durchführen könnte, kann das Ändern der Ladung die biologische Reaktion auf einen Träger4 verändern und daher möglicherweise keine repräsentativen Ergebnisse liefern. Drittens sind viele Träger so konzipiert, dass sie mit einem bestimmten Zelltyp interagieren und von ihm aufgenommen werden. Eine solche Zielerfassung eines Trägers kann und sollte von der Leistung seines therapeutischen Frachtpostenziels unterschieden werden. Um das LNP-Beispiel fortzusetzen, könnte eine RNA-Fracht extrem potent sein, aber wenn das LNP nicht in der Lage ist, an die Zelle zu binden, internalisiert zu werden und die RNA freizusetzen, wird kein nachgeschalteter funktioneller Effekt beobachtet. Dies kann insbesondere für Träger, die schwer zu transfizierende Zelltypen wie T-Zellen5 anvisieren sollen, ein Problem darstellen. Umgekehrt könnte ein LNP extrem effektiv angreifen, aber die RNA-Fracht funktioniert möglicherweise nicht. Ein nachgeschalteter Assay, der nur die Frachtfunktionalität misst, wird nicht in der Lage sein, zwischen diesen beiden Situationen zu unterscheiden, was die Entwicklung und Optimierung von Carrier-Drug-Delivery-Systemen erschwert.
In dieser Arbeit wird diskutiert, wie die Trägerassoziation absolut quantifiziert werden kann. Assoziation ist ein Begriff, der sich auf den experimentell gemessenen Grad der Interaktion zwischen einem Träger und einer Zelle bezieht. Die Assoziation unterscheidet nicht zwischen Membranbindung und Internalisierung - ein Träger kann assoziiert sein, weil er an die Zelloberfläche gebunden ist oder weil die Zelle ihn verinnerlicht hat. Die Assoziation wird häufig im Rahmen von Zellträger-Inkubationsexperimenten gemessen. In der Vergangenheit wurde die Assoziation entweder in beliebigen fluoreszierenden Einheiten (typischerweise "mediane Fluoreszenzintensität" oder MFI) oder als "prozentuale Assoziation" berichtet, Metriken, deren Einschränkungen zuvor diskutiert wurden6. Kurz gesagt, diese Messungen sind aufgrund von Unterschieden in den experimentellen Protokollen, Durchflusszytometereinstellungen und den Markierungsintensitäten verschiedener Träger nicht zwischen Experimenten, Laboratorien und Wirkstoffträgern vergleichbar. Ersteres wurde durch Kalibrierung des Zytometers überwunden, wodurch das relative Maß des MFI in ein absolut quantitatives Maß für Fluoreszenz umgewandeltwurde 7. Diese Methode berücksichtigt jedoch nicht die Variabilität in der Markierungsintensität verschiedener Träger und erlaubt daher keinen rationalen Vergleich verschiedener Trägerleistungen in einer Zielzelle der Wahl8.
Hier wird gezeigt, wie man praktisch von relativen, beliebigen fluoreszierenden Einheiten in die absolute quantitative Metrik der "Anzahl der Träger pro Zelle" umrechnen kann, indem eine kleine Anzahl zusätzlicher Charakterisierungsexperimente durchgeführt wird. Wenn eine andere Metrik der Trägerkonzentration gewünscht wird (z. B. Trägermasse pro Zelle oder Trägervolumen pro Zelle), ist es einfach, von Trägern pro Zelle umzurechnen, sofern eine Trägercharakterisierung durchgeführt wurde. Aus Gründen der Kürze und um Jargon zu vermeiden, wird das Wort "Träger" in dieser Arbeit verwendet, um sich auf die große Auswahl an Medikamentenabgabekonstrukten zu beziehen. Diese Quantifizierungstechniken sind gleichermaßen anwendbar, unabhängig davon, ob sie auf ein nanotechnologisch hergestelltes Goldpartikel oder ein biotechnologisch hergestelltes Bakterium angewendet werden.
Einige wenige Fakten ermöglichen die Umwandlung von beliebigen fluoreszierenden Einheiten in Träger pro Zelle. Erstens ist die gemessene Fluoreszenzintensität proportional zur Konzentration eines Fluorophors9 (oder eines fluoreszenzmarkierten Trägers), vorausgesetzt, die Fluoreszenz liegt innerhalb der Nachweisgrenzen des Instruments und die Instrumentierungseinstellungen sind gleich. Wenn also die Fluoreszenz eines Trägers und die Fluoreszenz einer Probe bekannt sind, kann man bestimmen, wie viele Träger in dieser Probe vorhanden sind, wenn alle Messungen unter den gleichen Einstellungen und Bedingungen durchgeführt wurden. Insbesondere bei kleineren Trägern ist es jedoch möglicherweise nicht möglich, Trägerfluoreszenz, Zellautofluoreszenz und zellassoziierte Trägerfluoreszenz auf demselben Instrument mit den gleichen Einstellungen zu messen. In diesem Fall gibt es eine zweite Anforderung, um die Umrechnung zwischen gemessener Fluoreszenz auf einem Instrument und gemessener Fluoreszenz auf einem anderen Instrument zu ermöglichen. Zu diesem Zweck kann eine Standardkurve der Fluorophorkonzentration erstellt werden, um die Fluoreszenzintensität auf beiden Instrumenten zu messen, wobei der MESF-Standard9 (Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome) genutzt wird. Dies ermöglicht dann die Messung der Trägerfluoreszenz in großen Mengen auf einem Nicht-Zytometer, eine Messung, die an Trägern beliebiger Größe oder Eigenschaft durchgeführt werden kann. Wenn eine solche Massenquantifizierung an einer Trägersuspension bekannter Konzentration durchgeführt wird, kann die Anzahl der Träger pro Zelle einer Probe erneut berechnet werden.
Während diese Arbeit den Prozess zur Messung der Trägerassoziation (bestimmt durch die gemessene Fluoreszenzintensität) demonstriert, könnte ein analoges Protokoll für andere Messungen der Zell-Träger-Interaktion durchgeführt werden (z. B. ein experimentelles Protokoll, das internalisierte und membrangebundene Träger unterscheidet). Darüber hinaus wäre dieses Protokoll weitgehend gleich, wenn die Assoziation durch einen nicht-fluoreszierenden Assay (z. B. durch Massenzytometrie) gemessen würde.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20347</td>
			<td>pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apogee A50 Microflow</td>
			<td>Apogee</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>Tecan Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td>Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum MESF kits Alexa Fluor 647</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>647</td>
			<td>Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation

Eine wichtige Komponente bei der Entwicklung von Medikamentenabgabesystemen betrifft die Verstärkung oder Abschwächung von Interaktionen mit bestimmten Zelltypen. Zum Beispiel könnte ein Chemotherapeutikum mit einem Antikörper funktionalisiert werden, um die Bindung an Krebszellen zu verbessern ("Targeting") oder mit Polyethylenglykol funktionalisiert werden, um die Immunzellerkennung zu umgehen ("Stealth"). Selbst auf zellulärer Ebene ist die Optimierung der Bindung und Aufnahme eines Wirkstoffträgers ein komplexes biologisches Designproblem. Daher ist es wertvoll zu trennen, wie stark ein neuer Träger mit einer Zelle interagiert, von der funktionellen Wirksamkeit der Fracht eines Trägers, sobald er an diese Zelle geliefert wurde.
Um das chemotherapeutische Beispiel fortzusetzen, "wie gut es an eine Krebszelle bindet" ist ein separates Problem von "wie gut es eine Krebszelle tötet". Quantitative In-vitro-Assays für letztere sind gut etabliert und beruhen in der Regel auf der Messung der Lebensfähigkeit. Die meisten veröffentlichten Forschungsergebnisse zu Zellträgerinteraktionen sind jedoch qualitativ oder semiquantitativ. Im Allgemeinen beruhen diese Messungen auf fluoreszierender Markierung des Trägers und berichten folglich über Wechselwirkungen mit Zellen in relativen oder beliebigen Einheiten. Diese Arbeit kann jedoch standardisiert und mit einer kleinen Anzahl von Charakterisierungsexperimenten absolut quantitativ gemacht werden. Eine solche absolute Quantifizierung ist wertvoll, da sie rationale, klassen- und klasseninterne Vergleiche verschiedener Wirkstoffabgabesysteme ermöglicht - Nanopartikel, Mikropartikel, Viren, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, technisch hergestellte therapeutische Zellen oder extrazelluläre Vesikel.
Darüber hinaus ist die Quantifizierung Voraussetzung für nachfolgende Metaanalysen oder In-silico-Modellierungsansätze . In diesem Artikel werden Videoanleitungen sowie ein Entscheidungsbaum für das Erreichen einer In-vitro-Quantifizierung für Trägerarzneimittelabgabesysteme vorgestellt, die Unterschiede in der Trägergröße und der Kennzeichnungsmodalität berücksichtigen. Darüber hinaus werden weitere Überlegungen zur quantitativen Bewertung fortgeschrittener Wirkstoffabgabesysteme diskutiert. Dies soll als wertvolle Ressource dienen, um die rationale Bewertung und das Design für die nächste Generation von Medikamenten zu verbessern.

Wie bereits erwähnt, erfordern verschiedene Wirkstoffträgertypen die Verwendung unterschiedlicher Techniken zur absoluten Quantifizierung der Zellträgerassoziation. Zum Beispiel sind 633 nm disulfidstabilisierte Poly(methacrylsäure) (PMA SH) Kernschalenpartikel groß und dicht genug für die Detektion mit einem empfindlichen Durchflusszytometer. Als solche wurden diese Partikel fluoreszierend markiert, dann mit Seitenwinkellichtstreuung (SALS, analog zu SSC) sowie dem entsprechenden Fluoreszenzkanal angegu...

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Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Es wird ein Workflow für die absolute Quantifizierung von Wirkstoffträger-Zell-Interaktionen mittels Durchflusszytometrie demonstriert, um eine bessere rationale Bewertung neuartiger Wirkstoffabgabesysteme zu ermöglichen. Dieser Workflow gilt für Arzneimittelträger aller Art.

Experimentelle Quantifizierung von Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffabgabesystemen und Zellen in vitro: Ein Leitfaden für die präklinische Bewertung der Nanomedizin

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Dieses Protokoll liefert quantitative Daten darüber, wie Trägersysteme mit Zellen interagieren. Quantitative Daten sind der Schlüssel für Engineering und Optimierung. Es erlaubt uns, von Ja- oder Nein-biologischen Fragen zu wie vielen Fragen überzugehen.Diese Technik ist nützlich, um Ergebnisse aus der präklinischen Arzneimittelträgerleistung, die qualitativ waren, in quantitative Ergebnisse umzuwandeln. Und das funktioniert auch, wenn Sie Ihren Träger auf einem anderen System charakterisieren als Ihre Zellen. Es kann einige Iterationen dauern, um die optimale Trägerverdünnung zu finden, die in die linearen oder quantitativen Bereiche der Nanoseite fällt.Nehmen Sie sich Zeit, um die richtigen Bedingungen zu finden. Montieren Sie zunächst die Durchflusszelle auf dem Lasermodul. Spülen Sie die Durchflusszelle langsam mit einer Rate von 0,1 Milliliter pro Sekunde mit einem Milliliter destilliertem Wasser.Wenn sich Blasen in der Durchflusszelle bilden, ziehen Sie die Suspension teilweise zurück, um die Blase mit der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu verschmelzen, bevor Sie fortfahren. Verriegeln Sie dann das gesamte Lasermodul im Instrument. Starten Sie die Kamera ungefähr auf halbem Weg durch die Spülung.Stellen Sie sicher, dass die Trägerablagerungen ausgewaschen sind. Wählen Sie Aufnahme, um die Registerkarte Aufnahmeeinstellungen zu öffnen, und klicken Sie auf Kamera starten. Treiben Sie das System mit einem Milliliter Luft an.Wenn statische Träger auf dem Bildschirm sichtbar sind, reinigen Sie die Durchflusszelle gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bereiten Sie die Träger für die Nanopartikel-Tracking-Analyse vor, indem Sie sicherstellen, dass die Träger je nach Trägersystem durch Ultraschall oder Wirbeln gut aufgehängt sind. Die Träger werden in Wasser verdünnt, um mindestens 0,6 bis einen Milliliter jeder Probe mit einer Trägerkonzentration zwischen 1x10 bis zum siebten und 1x10 bis zum neunten Träger pro Milliliter vorzubereiten.Nehmen Sie das Lasermodul heraus und stellen Sie es aufrecht. Geben Sie die erste Trägerprobe in eine Ein-Milliliter-Spritze und befestigen Sie die Spritze am Schlaucheinlass. Laden Sie dann die Probe vorsichtig in die Durchflusszelle.Wenn sich Blasen in der Durchflusszelle bilden, ziehen Sie die Suspension teilweise zurück, um die Blase mit der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu verschmelzen, bevor Sie fortfahren. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Durchflusszelle mit Flüssigkeit gefüllt ist, und halten Sie dann die Beladung an. Passen Sie den Kamerafokus bei Bedarf an, um einzelne Träger zu visualisieren.Nehmen Sie grobe Fokuseinstellungen mit dem Drehknopf auf der rechten Seite des Instruments vor. Nehmen Sie feinere Einstellungen vor, indem Sie die Registerkarte Hardware auswählen. Ändern Sie den Fokus, indem Sie den Fokusschieberegler anpassen.Um sicherzustellen, dass es keine Übersättigung gibt, wählen Sie die optimale Kamerastufe aus, indem Sie den Schieberegler auf der Aufnahmeregisterkarte anpassen. Wenn das Gerät mit diesem Zubehör ausgestattet ist, legen Sie die Spritze mit der Trägerprobe in die Spritzenpumpe. Wählen Sie auf der Registerkarte SOP die Standardmessung aus, um fünf Aufnahmen von jeweils 30 Sekunden zu machen.Geben Sie den Namen der Basisdatei ein und fügen Sie bei Bedarf zusätzliche Beispielinformationen hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche "Erweitert" klicken, wodurch ein modaler Dialog mit verschiedenen Auswahlmöglichkeiten geöffnet wird. Klicken Sie auf Erstellen und Skript ausführen und warten Sie, bis ein Popup-Fenster angezeigt wird, in dem Sie aufgefordert werden, das Beispiel zu erweitern. Wenn Sie die Spritzenpumpe verwenden, wählen Sie die Registerkarte Hardware und dann die Registerkarte Spritzenpumpe.Stellen Sie die gewünschte Infusionsrate ein und drücken Sie infuse. Wenn Sie die Spritzenpumpe nicht verwenden, schieben Sie die Probe manuell vor. Wählen Sie im Popup-Fenster OK, um mit der Aufnahme zu beginnen.Überprüfen Sie nach jeder der fünf Aufnahmen, ob sich die Probe noch durch die Durchflusszelle bewegt, wenn das Popup-Fenster "Bitte erweiterte Proben" erneut angezeigt wird. Wählen Sie dann OK, um mit der nächsten Aufnahme fortzufahren. Stellen Sie auf der Registerkarte Prozess den Schieberegler für die Erkennungsschwelle zwischen vier und acht ein, um verschiedene auf dem Bildschirm sichtbare Träger korrekt zu identifizieren.Sie können die Bildschirmverstärkung anpassen, um die Visualisierung zu unterstützen, dies hat keinen Einfluss auf die nachgelagerte Analyse. Drücken Sie im Popup-Fenster OK, um die Tracking-Analyse zu starten. Überwachen Sie den Analysefortschritt, indem Sie auf die Registerkarte Analyse in einer einzelnen Analyse klicken.Sobald die Analyse abgeschlossen ist, suchen Sie nach einer Eingabeaufforderung für Exporteinstellungen. Vergewissern Sie sich, dass PDF einschließen und Experimentzusammenfassung einschließen ausgewählt ist. Wählen Sie beliebige andere Exportformate aus.Überprüfen Sie im Ergebnisbereich des PDF-Datenexports, ob die gemessene Trägerkonzentration zwischen 1x10 bis zum siebten und 1x10 bis zum neunten Träger pro Milliliter liegt, um sicherzustellen, dass die gemessene Konzentration zuverlässig ist, und überprüfen Sie, ob unter dem Konzentrationsmessergebnis Fehlermeldungen oder Warnmeldungen angezeigt werden. Wiederholen Sie den Vorgang zwei oder mehr Male mit unterschiedlichen Verdünnungen aus dem Bestand und stellen Sie sicher, dass die Konzentration jeder Probe innerhalb des linearen Bereichs des Geräts liegt. Berechnen Sie die Trägerkonzentration wie im Textmanuskript beschrieben.Bereiten Sie die freie oder Antikörper-konjugierte Fluorochromlösung wie im Textmanuskript beschrieben her. Berechnen Sie die Konzentration der Stammlösung aus der Konzentration, dem Molekulargewicht und der Avogadro-Zahl, wie in der Gleichung gezeigt. Führen Sie dann eine serielle Verdünnung des Farbstoffs im Trägerverdünnungsmittel durch, um Standardkurvenproben zu erzeugen.Anschließend wird die Trägerprobe in die Messplatte gegeben und die Fluoreszenz mit einem Mikrotiterplattenleser gemessen. Generieren Sie die Standardkurve wie im Textmanuskript beschrieben. Berechnen Sie die absolute Fluoreszenzintensität pro Träger, indem Sie die Massenfluoreszenz durch die Trägerkonzentration dividieren.Richten Sie das Durchflusszytometer für das abschließende Trägerzellenexperiment ein, indem Sie die optimalen PMT-Spannungseinstellungen in den relevanten Kanälen bestimmen. Führen Sie eine Negativkontrollprobe durch, bei der die Zellen nicht mit Trägern inkubiert werden, um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen. Bereiten Sie die Durchflusszytometrie-Quantifizierungsperlen vor und setzen Sie sie erneut aus.Verwenden Sie denselben Puffer wie für die Zellproben. Wenn die Perlenpopulationen separat bereitgestellt werden, ziehen Sie sie zusammen. Führen Sie die Durchflusszytometrie-Quantifizierungsperle und die Trägerzellproben durch, um die Fluoreszenzintensität pro Zelle zu bestimmen.Führen Sie die Durchflusszytometer-Quantifizierungsperlen aus, um eine Standardkurve zu erzeugen und die absolute Fluoreszenzintensität in MFI umzuwandeln. Verwenden Sie dies, um den theoretischen MFI der Träger wie im Textmanuskript beschrieben zu berechnen. Führen Sie die Zellträgerproben durch, um die Fluoreszenzintensität pro Zelle jeder Probe zu bestimmen.Berechnen Sie schließlich die Anzahl der Träger pro Zelle für jede Probe, indem Sie die Hintergrundfluoreszenz von der gemessenen Fluoreszenz der Probe subtrahieren und dann durch die Fluoreszenz pro Partikel dividieren. Für 633 Nanometer Polymethacrylsäure-Kernschalenpartikel waren die Konzentration und Fluoreszenzintensität pro Träger direkt mit dem Zytometerstrom quantifizierbar. Im Gegensatz dazu waren 100 Nanometer superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel zu klein, um sie einzeln zu detektieren und wurden mit dem Massenstrom analysiert.Markierte Quantifizierungsperlen wurden an mehreren Tagen verwendet, um Standardkurven auf einem Durchflusszytometer zu erzeugen. Die Korrelation zwischen dem gemessenen MFI und dem MESF-Wert der Quantifizierungsperlen war linear und zwischen den gemessenen Daten weitgehend ähnlich. Zeitverlaufsexperimente mit fluoreszierend markierten HeLa-Zellen mit 235-Nanometer-Polymethacrylsäure-Kapseln von null bis 24 Stunden zeigten einen Anstieg des MFI im Laufe der Zeit, was darauf hindeutet, dass die Kapseln mit HeLa-Zellen assoziiert waren.Der Unterschied in der scheinbaren zellulären Reaktion auf Träger war stark, abhängig von der relativen oder absoluten Quantifizierung. Die absolute Quantifizierung war unabhängig von der Kennzeichnungsintensität und damit vergleichbarer. Diese Techniken sind die Grundlage für eine tiefere Analyse und einen Vergleich der Partikelleistung.Wir freuen uns, diese Techniken zur Parametrisierung mathematischer Modelle zu verwenden, die es uns ermöglichen, die Teilchenleistung unabhängig von einem bestimmten Experiment zu charakterisieren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modelle und Methoden zum Transport von Drug Delivery Systems über zelluläre Barrieren Bewerten

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Forschung

Biotechnik

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Anpassung der Elektrospinnverfahren für einen Dreischicht stellen drei einzigartige Umgebungen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Atemwegswand

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Sandwichartigen Mikroumgebungen zu nutzen Handy / Material-Interaktionen

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Synthese von funktionalisierten 10 nm Polymer beschichteten Goldpartikeln für Targeting Endothel und Drug-Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Umfassende Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit von Plazenta-gezielte Medikamentenverabreichung mit drei komplementäre Methoden

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Reinigung und Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus chinesischen Hamster-Ovarialzellen mit einem automatisierten Mikrobioreaktorsystem

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Ein quantitativer Fluoreszenzmikroskopie-basierter Single Liposome-Assay zum Nachweis der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primärklärung der CHO geernteten Zellkulturflüssigkeit mittels eines akustischen Separators

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...