Name: experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית האוסטרלית לבריאות ומחקר רפואי (NHMRC; מענק תוכנית מס' GNT1149990), המרכז האוסטרלי לחקר וירולוגיה של HIV והפטיטיס (ACH2), כמו גם מתנה מעיזבון רג'אן לואיז לנגלואה. F.C. מכיר בפרס של מלגת מחקר בכירה של המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (NHMRC) (GNT1135806). איור 1 ואיור 2 נוצרו עם BioRender.com.

1. בחירת הזרם המתאים
<ol><li>עקבו אחר עץ ההחלטות המתואר באיור 1 כדי לקבוע את זרימת העבודה (זרם) הטובה ביותר (איור 2) עבור מערך הניסוי שבו נעשה שימוש. עיין בדיון להערות נוספות על בחירה זו של זרם.</li>
	<li>אם בעקבות זרם הציטומטר, המשך בשלבים 2.1.1-2.2.7. אם אתה עוקב א...

<ol>
	<li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+ORgan+Targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR/Cas+gene+editing.">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+mRNA+vaccines:+A+biotech+and+industrial+perspective.">The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective.</a> npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).</li><li>Press, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo-carrier+interactions+significantly+contribute+to+micellar+conformation+and+biodistribution.">Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution.</a> NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).</li><li>Cevaal, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+T+cell-targeting+nanoparticle+drug+delivery+systems:+Considerations+for+rational+design.">In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design.</a> ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).</li><li>Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-nano+science:+Better+metrics+would+accelerate+progress.">Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress.</a> Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).</li><li>Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+level+of+nanoparticle+uptake+in+mammalian+cells+using+flow+cytometry.">Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry.</a> Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).</li><li>Lozano-Andr&#233;s, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+MESF-bead+based+assignment+of+absolute+fluorescence+values+to+nanoparticles+and+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Schwartz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalization+of+the+MESF+unit+of+fluorescence+intensity.">Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cell-particle+association+in+vitro:+A+quantitative+method+to+compare+particle+performance.">Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance.</a> Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Comfort, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+tracking+analysis+for+the+quantification+and+size+determination+of+extracellular+vesicles.">Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+particle+imaging+for+quantification+of+nano-+and+microparticles.">Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles.</a> Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+Towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISD3:+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems.">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).</li><li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions.">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).</li><li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density.">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature.">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li></ol>

אפיון יחסי הגומלין בין מובילי תרופות ותאים הופך לחשוב יותר ויותר בפיתוח מערכות אספקת תרופות חדשניות. באופן ספציפי, כדי לאפשר הערכה רציונלית והשוואה של מבני נשאים שונים, כימות מוחלט של הביצועים של המוביל האמור כדי לקיים אינטראקציה עם תאי מטרה ותאי מטרה הוא קריטי. פרוטוקול זה מתאר מתודולוג?...

העיצוב של מבנים לאספקת תרופות המציגים התנהגות ספציפית ומתוכננת, בהתאם לסוג התא שבו הם נתקלים, משך עניין מחקרי משמעותי. מבנים או "נשאים" פוטנציאליים של אספקת תרופות כוללים פורמולציות של שומנים, אנאורגניים שגודלו בננו, מכלולים פולימריים, שלפוחיות חוץ-תאיות, תאי חיידקים פונקציונליים או וירוסים שעברו שינוי. כל אלה יכולים להפגין ספציפיות של איברים, רקמות או תאים בשל תכונות פיזיקליות, תכונות פני שטח או פונקציות כימיות מהונדסות כגון חיבור נוגדנים 1,2.
צעד כמעט בכל מקום בהערכת נשאים במבחנה הוא דגירה של תאים עם תרחיף המכיל את המוביל העמוס בתרופות. לאחר הדגירה, ביצועי המוביל נמדדים באמצעות קריאה פונקציונלית של ביצועי מטען התרופה, לדוגמה, יעילות העברה או רעילות. קריאות פונקציונליות הן שימושיות, מכיוון שהן מהוות מדד במורד הזרם ליעילות הספק. עם זאת, עבור מבנים מורכבים יותר של אספקת תרופות, חשוב יותר ויותר להתקדם מעבר לקריאות פונקציונליות ולכמת בנפרד את מידת האינטראקציה של הנשא עם התא המעניין. יש לכך כמה סיבות.
ראשית, יש עניין גובר בגילוי (ובשיפור איטרטיבי) של טכנולוגיות "פלטפורמה", שיכולות לשאת מגוון מטענים. לדוגמה, ננו-חלקיקי ליפידים (LNPs) שנועדו לתמצת רנ"א יכולים להחליף רצף רנ"א אחד באחר עם מעט אזהרות3. לכן, כדי לשפר באופן איטרטיבי את טכנולוגיית המוביל, זה קריטי לכמת את הביצועים שלה ללא תלות בפונקציונליות המטען. שנית, קריאות פונקציונליות עשויות להיות לא פשוטות עבור המטען המעניין, ולפגוע ביכולת לחזור ולהעריך במהירות את ניסוחי המוביל. בעוד שניתן לבצע אופטימיזציה במבחנה באמצעות מטען מודל עם קריאה פונקציונלית פשוטה (למשל, פלואורסצנציה), שינוי המטען יכול לשנות את התגובה הביולוגית למוביל4 ולפיכך לא להניב תוצאות מייצגות. שלישית, נשאים רבים מתוכננים לקיים אינטראקציה עם סוג תא מסוים ולהיקלט על ידו. יכולת מיקוד כזו של מוביל יכולה וצריכה להיות מובחנת מביצועי המטען הטיפולי שלו לאחר המיקוד. כדי להמשיך את הדוגמה של LNP, מטען RNA עשוי להיות חזק ביותר, אך אם ה-LNP אינו מסוגל להיקשר לתא, להיות מופנם ולשחרר את ה-RNA, לא תיראה השפעה תפקודית במורד הזרם. זו יכולה להיות בעיה במיוחד עבור נשאים המיועדים להתמקד בסוגי תאים קשים לשינוי, כגון תאי T5. לעומת זאת, LNP יכול לכוון ביעילות רבה, אך מטען הרנ"א עשוי שלא לתפקד. בדיקה במורד הזרם שמודדת רק את פונקציונליות המטען לא תוכל להבדיל בין שני מצבים אלה, ובכך תסבך את הפיתוח והאופטימיזציה של מערכות אספקת תרופות מובילות.
בעבודה זו, כיצד לכמת לחלוטין את איגוד המוביל נדון. אסוציאציה היא מונח המתייחס למידת האינטראקציה שנמדדה בניסוי בין נשא לתא. אסוציאציה אינה מבדילה בין קשירת ממברנה לבין הפנמה - נשא עשוי להיות קשור משום שהוא קשור לפני השטח של התא או משום שהתא הפנים אותו. אסוציאציה נמדדת בדרך כלל כחלק מניסויי דגירה של נשאים תאיים. מבחינה היסטורית, הקשר דווח ביחידות פלואורסצנטיות שרירותיות (בדרך כלל "עוצמת פלואורסצנציה חציונית" או MFI) או כ"אחוז שיוך", מדדים שמגבלותיהם נדונו בעבר6. בקיצור, מדידות אלה אינן ניתנות להשוואה בין ניסויים, מעבדות ונשאי תרופות בשל הבדלים בפרוטוקולי הניסוי, הגדרות ציטומטר זרימה ועוצמות הסימון של נשאים שונים. נעשו מאמצים להתגבר על הראשון על ידי כיול הציטומטר, ובכך להמיר את המידה היחסית של MFI למדד כמותי לחלוטין של פלואורסצנציה7. עם זאת, שיטה זו אינה מביאה בחשבון את השונות בעוצמת הסימון של נשאים שונים, ולכן אינה מאפשרת השוואה רציונלית של ביצועי נשאים שונים בתא יעד של בחירה8.
כאן, כיצד להמיר למעשה מיחידות פלואורסצנטיות יחסיות ושרירותיות למדד הכמותי המוחלט של "מספר הנשאים לתא" מודגם על ידי ביצוע מספר קטן של ניסויי אפיון נוספים. אם רוצים מדד אחר של ריכוז נשאים (למשל, מסת נשא לתא או נפח נשא לתא), קל להמיר מנשאים לכל תא, בתנאי שנעשה אפיון נשא. למען הקיצור וכדי להימנע מז'רגון, המילה "נשא" משמשת בעבודה זו כדי להתייחס למגוון העצום של מבני אספקת תרופות. טכניקות כימות אלה ישימות באותה מידה, בין אם הן מיושמות על חלקיק זהב מהונדס בננו או על חיידק מהונדס ביולוגית.
כמה עובדות מאפשרות המרה מיחידות פלואורסצנטיות שרירותיות לנשאים לכל תא. ראשית, עוצמת הפלואורסצנציה הנמדדת פרופורציונלית לריכוז של פלואורופור9 (או נשא המסומן באופן פלואורסצנטי), בהנחה שהפלואורסצנציה נמצאת בגבולות הגילוי של המכשיר והגדרות המכשור זהות. לפיכך, אם הפלואורסצנטיות של נשא והפלואורסצנטיות של דגימה ידועות, ניתן לקבוע כמה נשאים נמצאים בדגימה זו אם כל המדידות בוצעו באותן הגדרות ותנאים. עם זאת, במיוחד עבור נשאים קטנים יותר, ייתכן שלא ניתן יהיה למדוד פלואורסצנציה של נשאים, פלואורסצנציה של תאים ופלואורסצנטיות של תאים הקשורים לנשאים באותו מכשיר עם אותן הגדרות. במקרה זה, קיימת דרישה שנייה שתאפשר להמיר בין פלואורסצנציה נמדדת במכשיר אחד לפלואורסצנטיות מדודה במכשיר אחר. לשם כך, ניתן לקבוע עקומה סטנדרטית של ריכוז פלואורופור כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות בשני המכשירים, תוך ניצול המולקולות של פלואורוכרום מסיס שווה ערך (MESF) תקן9. לאחר מכן זה מאפשר מדידה של פלואורסצנציה של המוביל בתפזורת על גבי לא ציטומטר, מדידה שניתן לבצע על נשאים בכל גודל או מאפיין. כאשר כימות בתפזורת כזה נעשה על השעיית נשא של ריכוז ידוע, ניתן לחשב שוב את מספר הנשאים לכל תא של דגימה.
בעוד שעבודה זו מדגימה את התהליך למדידת שיוך נשאים (כפי שנקבע על ידי עוצמת פלואורסצנטיות נמדדת), פרוטוקול אנלוגי יכול להתבצע עבור מדידות אחרות של אינטראקציה בין תא לנשא (למשל, פרוטוקול ניסיוני המבדיל בין נשאים מופנמים לבין נשאים הקשורים לממברנה). בנוסף, פרוטוקול זה יהיה זהה במידה רבה אם הקשר יימדד באמצעות בדיקה שאינה פלואורסצנטית (למשל, באמצעות ציטומטריה של מסה).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20347</td>
			<td>pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apogee A50 Microflow</td>
			<td>Apogee</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>Tecan Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td>Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum MESF kits Alexa Fluor 647</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>647</td>
			<td>Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation

מרכיב מרכזי בתכנון מערכות אספקת תרופות נוגע לאופן שבו ניתן להגביר או להחליש אינטראקציות עם סוגי תאים ספציפיים. לדוגמה, כימותרפיה עשויה לתפקד עם נוגדן כדי לשפר את ההיקשרות לתאים סרטניים ("מיקוד") או לתפקד עם פוליאתילן גליקול כדי לסייע בהתחמקות מזיהוי תאי מערכת החיסון ("התגנבות"). אפילו ברמה התאית, אופטימיזציה של קשירה וספיגה של נשא תרופה היא בעיית תכנון ביולוגית מורכבת. לפיכך, חשוב להפריד בין עוצמת האינטראקציה של מוביל חדש עם תא לבין היעילות התפקודית של מטען המוביל לאחר שנמסר לאותו תא.
כדי להמשיך את הדוגמה הכימותרפית, "עד כמה הוא נקשר לתא סרטני" היא בעיה נפרדת מ"עד כמה הוא הורג תא סרטני". מבחנים כמותיים במבחנה עבור האחרונים מבוססים היטב ובדרך כלל מסתמכים על מדידת כדאיות. עם זאת, רוב המחקרים שפורסמו על אינטראקציות בין תאים לנשאים הם איכותניים או סמי-קוונטיים. בדרך כלל, מדידות אלה מסתמכות על תיוג פלואורסצנטי של הנשא, וכתוצאה מכך מדווחות על אינטראקציות עם תאים ביחידות יחסיות או שרירותיות. עם זאת, עבודה זו יכולה להיות סטנדרטית ולהיות כמותית לחלוטין עם מספר קטן של ניסויי אפיון. כימות מוחלט כזה הוא בעל ערך, שכן הוא מאפשר השוואות רציונליות, בין-מעמדיות ותוך-מעמדיות של מערכות אספקת תרופות שונות - ננו-חלקיקים, מיקרו-חלקיקים, וירוסים, מצומדי נוגדנים-תרופות, תאים טיפוליים מהונדסים או שלפוחיות חוץ-תאיות.
יתר על כן, כימות הוא תנאי מוקדם למטא-אנליזות הבאות או לגישות מידול סיליקו . במאמר זה מוצגים מדריכי וידאו, כמו גם עץ החלטות כיצד להשיג כימות במבחנה עבור מערכות אספקת תרופות מובילות, אשר לוקחים בחשבון הבדלים בגודל המוביל ואת מודל התיוג. בנוסף, נדונים שיקולים נוספים להערכה כמותית של מערכות מתקדמות להובלת תרופות. זה נועד לשמש משאב יקר ערך כדי לשפר את ההערכה הרציונלית ואת העיצוב עבור הדור הבא של הרפואה.

כפי שנדון קודם לכן, סוגים שונים של מובילי תרופות דורשים שימוש בטכניקות שונות לכימות מוחלט של שיוך נשא תא. לדוגמה, חלקיקי מעטפת הליבה של חומצה מתקרילית (חומצה מתקרילית) (PMA SH) מיוצבים על ידי דיסולפיד של 633 ננומטר הם גדולים וצפופים מספיק לזיהוי באמצעות ציטומטר זרימה רגיש. ככאלה, החלקיקים ...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

תהליך עבודה מודגם לכימות מוחלט של אינטראקציות בין נשא תרופה לתאים באמצעות ציטומטריה של זרימה כדי לאפשר הערכה רציונלית טובה יותר של מערכות אספקת תרופות חדשות. זרימת עבודה זו חלה על ספקי סמים מכל סוג שהוא.

כימות ניסיוני של אינטראקציות בין מערכות העברת תרופות ותאים במבחנה: מדריך להערכת ננו-רפואה פרה-קלינית

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

פרוטוקול זה מספק נתונים כמותיים על האופן שבו מערכות נשאים מתקשרות עם תאים. נתונים כמותיים הם המפתח להנדסה ואופטימיזציה. זה מאפשר לנו לעבור משאלות ביולוגיות של כן או לא, לכמה שאלות.טכניקה זו שימושית להמרת תוצאות מביצועי נשא תרופה פרה-קליניים, שהיו איכותיים, לתוצאות כמותיות. וזה עובד גם כשאתה מאפיין את הנשא שלך במערכת שונה ממה שאתה מאפיין את התאים שלך. זה יכול לקחת כמה איטרציות כדי למצוא את דילול הנשא האופטימלי שנמצא בטווח הליניארי או הכמותי של הצד הננו.קח את הזמן שלך למציאת התנאים הנכונים. כדי להתחיל, הרכב את תא הזרימה על מודול הלייזר. לאט לאט לשטוף את תא הזרימה בקצב של 0.1 מיליליטר לשנייה עם מיליליטר אחד של מים מזוקקים.אם נוצרות בועות בתוך תא הזרימה, יש לסגת חלקית מההשעיה כדי למזג את הבועה עם ממשק האוויר-נוזל לפני שתמשיך. לאחר מכן נעל את כל מודול הלייזר במקומו בתוך המכשיר. הפעל את המצלמה בערך באמצע ההדחה.הקפד לאשר כי פסולת המוביל נשטף החוצה. בחר לכידה כדי לפתוח את לשונית הגדרות הלכידה ולחץ על התחל מצלמה. כונן את המערכת עם מיליליטר אחד של אוויר.אם נשאים סטטיים כלשהם נראים על המסך, נקה את תא הזרימה בהתאם להוראות היצרן. הכן את הנשאים לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, על ידי וידוא שהנשאים תלויים היטב באמצעות סוניקציה או מערבולת, בהתאם למערכת הנשאים המעורבת. לדלל את הנשאים במים כדי להכין לפחות 0.6 עד מיליליטר אחד של כל דגימה עם ריכוז המוביל בין 1x10 לשביעי ו 1x10 עד התשיעי נשאים למיליליטר.הוציאו את מודול הלייזר והניחו אותו זקוף. שחרר את דגימת המוביל הראשונה לתוך מזרק מיליליטר אחד וחבר את המזרק לכניסת הצינור. לאחר מכן טען בזהירות את הדגימה לתא הזרימה.אם נוצרות בועות בתוך תא הזרימה, חזור על המתלה באופן חלקי כדי למזג את הבועה עם ממשק האוויר-נוזל לפני שתמשיך. ודא שתא הזרימה כולו מלא בנוזל, ולאחר מכן השהה את הטעינה. כוונן את מיקוד המצלמה במידת הצורך כדי לדמיין ספקים בודדים.בצע כוונוני מיקוד גסים באמצעות הידית המסתובבת בצד ימין של המכשיר. בצע התאמות עדינות יותר על-ידי בחירה בכרטיסיה 'חומרה'. שנה את המיקוד על-ידי התאמת מחוון המיקוד.כדי להבטיח שאין עודף משקל, בחר את רמת המצלמה האופטימלית על-ידי התאמת המחוון בתוך לשונית הצילום. אם המכשיר מצויד באביזר זה, טען את המזרק המכיל את דגימת המוביל לתוך משאבת המזרק. תחת הכרטיסייה SOP, בחר מדידה רגילה כדי לבצע חמש לכידות של 30 שניות כל אחת.הזן את שם קובץ הבסיס, ואם תרצה, הוסף מידע נוסף לדוגמה על ידי לחיצה על הלחצן המתקדם שיפתח דיאלוג מודאלי עם אפשרויות שונות. לחץ על צור והפעל סקריפט והמתן עד שיופיע חלון קופץ המבקש בבקשה דוגמה מוקדמת. אם אתה משתמש במשאבת המזרק, בחר את הכרטיסייה חומרה ולאחר מכן את הכרטיסייה משאבת מזרק.קבעו את קצב העירוי הרצוי ולחצו על infuse. אם אינך משתמש במשאבת המזרק, קדם את הדגימה באופן ידני. בחלון הקופץ, בחר אישור כדי להתחיל ללכוד.לאחר כל אחת מחמש הלכידות, כאשר הדגימה המתקדמת מופיעה שוב, בדוק שהדגימה עדיין נעה בתא הזרימה. לאחר מכן בחר אישור כדי להמשיך עם הלכידה הבאה. בכרטיסיה תהליך, התאם את מחוון סף הזיהוי בין ארבע לשמונה כדי לזהות נכונה ספקים נפרדים הנראים על המסך.אתה יכול להתאים את רווח המסך כדי לסייע בהדמיה, זה לא ישפיע על הניתוח במורד הזרם. בחלון המוקפץ, לחץ על אישור כדי ליזום ניתוח מעקב. עקוב אחר התקדמות הניתוח על ידי לחיצה על הניתוח בכרטיסיית ניתוח אחת.לאחר סיום הניתוח, חפש בקשה להגדרות ייצוא שתופיע. ודא שהאפשרות 'כלול מסמך PDF וכלול סיכום ניסוי' נבחרה. בחר תבניות ייצוא אחרות כרצונך.במקטע התוצאות של ייצוא נתוני PDF, כדי להבטיח שהריכוז שנמדד אמין, ודא שריכוז המוביל הנמדד הוא בין 1x10 לשביעי ובין 1x10 לתשיעי למיליליטר ובדוק אם יש הודעות שגיאה או הודעות אזהרה מתחת לתוצאת מדידת הריכוז. חזור על ההליך פעמיים או יותר עם דילולים שונים מהמלאי, וודא שהריכוז של כל דגימה נמצא בטווח הליניארי של המכשיר. חשב את ריכוז נושאת המניות כמתואר בכתב היד של הטקסט.הכן את תמיסת הפלואורוכרום המצומדת החופשית או נוגדנים כמתואר בכתב היד של הטקסט. חשב את ריכוז תמיסת המניות מהריכוז, המשקל המולקולרי ומספר אבוגדרו כפי שמוצג במשוואה. לאחר מכן בצע דילול סדרתי של הצבע במדלל המוביל כדי ליצור דגימות עקומה סטנדרטיות.לאחר מכן הוסף את דגימת המוביל ללוח המדידה ומדוד פלואורסצנטיות באמצעות קורא microplate. צור את העקומה הסטנדרטית כמתואר בכתב היד של הטקסט. חשב את עוצמת הפלואורסצנציה המוחלטת לכל נשא על ידי חלוקת הפלואורסצנציה בתפזורת בריכוז הנשא.הגדר את ציטומטר הזרימה לניסוי הסופי בתא המוביל על ידי קביעת הגדרות מתח PMT אופטימליות בערוצים הרלוונטיים. הפעל דגימת בקרה שלילית שבה התאים אינם מודגרים עם נשאים כדי לקבוע את פלואורסצנציה ברקע. הכן והשהה מחדש את חרוזי כמות הציטומטריה של הזרימה.השתמש באותו מאגר המשמש לדגימות התאים. אם אוכלוסיות החרוזים מסופקות בנפרד, משכו אותן יחד. הפעל את חרוז הכמות של ציטומטריה של זרימה ואת דגימות התאים הנשאים כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות לכל תא.הפעל את חרוזי הכמות של ציטומטר הזרימה כדי ליצור עקומה סטנדרטית, תוך המרת עוצמת הפלואורסצנט המוחלטת ל- MFI. השתמש באפשרות זו כדי לחשב את ה- MFI התיאורטי של הספקים כמתואר בכתב היד של הטקסט. הפעל את דגימות נשא התא כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנט לכל תא של כל דגימה.לבסוף, חשב את מספר הנשאים לתא עבור כל דגימה על ידי הפחתת פלואורסצנטיות הרקע מהפלואורסצנציה הנמדדת של הדגימה, ולאחר מכן חלוקה בפלואורסצנציה לכל חלקיק. עבור חלקיקי קליפת חומצה פולימתקרילית בגודל 633 ננומטר, הריכוז והעוצמה הפלואורסצנטית לכל נשא היו ניתנים לכימות ישיר באמצעות זרם הציטומטר. לעומת זאת, ננו-חלקיקים של תחמוצת ברזל סופר-פאראמגנטית של 100 ננומטר היו קטנים מכדי לזהותם בנפרד ונותחו באמצעות זרם התפזורת.חרוזי כמות מסומנים שימשו במשך מספר ימים ליצירת עקומות סטנדרטיות על ציטומטר זרימה. המתאם בין ה-MFI שנמדד לבין ערך ה-MESF של חרוזי הכמות היה ליניארי ודומה באופן נרחב בין התאריכים שנמדדו. ניסויים במסלול הזמן באמצעות תאי HeLa המסומנים בפלואורסצנט עם כמוסות חומצה פולימתקרילית של 235 ננומטר מאפס עד 24 שעות הראו עלייה ב- MFI לאורך זמן, מה שמצביע על כך שהכמוסות היו קשורות לתאי HeLa.ההבדל בתגובה התאית לכאורה לנשאים היה בולט, תלוי בכימות יחסי או מוחלט. הכימות המוחלט היה בלתי תלוי בעוצמת התיוג ולכן דומה יותר. טכניקות אלה הן הבסיס לניתוח מעמיק יותר ולהשוואה של ביצועי החלקיקים.אנו נרגשים מהשימוש בטכניקות אלה כדי ליצור פרמטרים של מודלים מתמטיים שיאפשרו לנו לאפיין את ביצועי החלקיקים ללא תלות בניסוי מסוים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

התאמת תהליך Electrospinning לספק שלוש סביבות ייחודיות לTri-שכבתי<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של חומת Airway

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

כמו כריך microenvironments לרתום ניידים / חומרי אינטראקציות

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

סינתזה של Functionalized 10-nm פולימר מצופה זהב חלקיקים אנדותל הכוונת משלוח סמים

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

הערכה מקיפה של היעילות והבטיחות של משלוח סמים, ממוקדות השליה באמצעות שלוש שיטות משלימות

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

השימוש תפוקה גבוהה אוטומטית Microbioreactor מערכת לייצור של מודל IgG1 בתאים צ'ו

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

טיהור וניתוח של נוגדן חד שבטיים מן הסינית שחלות אוגר תאים באמצעות מערכת Microbioreactor חקן אוטומטי

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

הבהרה ראשונית של נוזל תרבית תאים שנקטפו על ידי CHO באמצעות מפריד אקוסטי

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...