Name: experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00
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इस काम को ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एनएचएमआरसी) द्वारा समर्थित किया गया था; कार्यक्रम अनुदान संख्या जीएनटी 1149990, ऑस्ट्रेलियाई सेंटर फॉर एचआईवी एंड हेपेटाइटिस वायरोलॉजी रिसर्च (एसीएच2), साथ ही रेजेन लुईस लैंगलोइस की संपत्ति से एक उपहार। एफ.सी. राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एनएचएमआरसी) के वरिष्ठ प्रधान अनुसंधान फैलोशिप (जीएनटी 1135806) के पुरस्कार को स्वीकार करता है। चित्रा 1 और चित्रा 2 BioRender.com के साथ बनाए गए थे।

1. उपयुक्त स्ट्रीम का चयन करना
<ol><li>उपयोग किए गए प्रयोगात्मक सेटअप के लिए सर्वोत्तम वर्कफ़्लो (स्ट्रीम) (चित्रा 2) निर्धारित करने के लिए चित्रा 1 में उल्लिखित निर्णय वृक्ष का प...

<ol>
	<li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+ORgan+Targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR/Cas+gene+editing.">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+mRNA+vaccines:+A+biotech+and+industrial+perspective.">The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective.</a> npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).</li><li>Press, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo-carrier+interactions+significantly+contribute+to+micellar+conformation+and+biodistribution.">Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution.</a> NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).</li><li>Cevaal, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+T+cell-targeting+nanoparticle+drug+delivery+systems:+Considerations+for+rational+design.">In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design.</a> ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).</li><li>Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. 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Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cell-particle+association+in+vitro:+A+quantitative+method+to+compare+particle+performance.">Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance.</a> Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. 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(169), e62447 (2021).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+particle+imaging+for+quantification+of+nano-+and+microparticles.">Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles.</a> Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+Towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISD3:+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems.">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).</li><li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions.">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).</li><li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density.">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature.">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li></ol>

दवा वाहक और कोशिकाओं के बीच बातचीत को चिह्नित करना नई दवा वितरण प्रणालियों के विकास में तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है। विशेष रूप से, विभिन्न वाहक संरचनाओं के तर्कसंगत मूल्यांकन और तुलना की अनुमति ?...

दवा वितरण संरचनाओं के डिजाइन जो विशिष्ट, डिज़ाइन किए गए व्यवहार को प्रदर्शित करते हैं, इस बात पर निर्भर करता है कि वे किस सेल प्रकार का सामना करते हैं, ने पर्याप्त शोध रुचि को आकर्षित किया है। संभावित दवा वितरण संरचनाओं या "वाहक" में लिपिड फॉर्मूलेशन, नैनो-विकसित अकार्बनिक, बहुलक असेंबली, बाह्य पुटिका, कार्यात्मक जीवाणु कोशिकाएं या संशोधित वायरस शामिल हैं। ये सभी भौतिक गुणों, सतह गुणों, या इंजीनियर रासायनिक कार्यात्मकता जैसे एंटीबॉडी अटैचमेंट 1,2 के कारण अंग, ऊतक या सेल विशिष्टता प्रदर्शित कर सकते हैं।
इन विट्रो वाहक मूल्यांकन में एक लगभग सर्वव्यापी कदम यह है कि दवा से भरे वाहक वाले निलंबन के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट किया जाए। इनक्यूबेशन के बाद, वाहक प्रदर्शन को दवा कार्गो के प्रदर्शन के कार्यात्मक रीडआउट के माध्यम से मापा जाता है, उदाहरण के लिए, अभिकर्मक दक्षता या विषाक्तता। कार्यात्मक रीडआउट उपयोगी हैं, क्योंकि वे वाहक प्रभावशीलता का एक डाउनस्ट्रीम उपाय हैं। हालांकि, अधिक जटिल दवा वितरण संरचनाओं के लिए, कार्यात्मक रीडआउट से परे जाना और ब्याज के सेल के साथ वाहक बातचीत की डिग्री को अलग से निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। इसके कुछ कारण हैं।
सबसे पहले, "प्लेटफ़ॉर्म" वाहक प्रौद्योगिकियों की खोज (और पुनरावृत्ति में सुधार) में रुचि बढ़ रही है, जो विभिन्न प्रकार के कार्गो ले जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, आरएनए को समाहित करने के लिए डिज़ाइन किए गए लिपिड नैनोकणों (एलएनपी) कुछचेतावनियों के साथ एक आरएनए अनुक्रम को दूसरे के लिए आदान-प्रदान कर सकते हैं। इस प्रकार, वाहक प्रौद्योगिकी में पुनरावर्ती रूप से सुधार करने के लिए, कार्गो कार्यक्षमता से स्वतंत्र इसके प्रदर्शन को निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। दूसरा, कार्यात्मक रीडआउट ब्याज के कार्गो के लिए सरल नहीं हो सकता है, वाहक योगों को तेजी से संशोधित करने और मूल्यांकन करने की क्षमता से समझौता कर सकता है। जबकि कोई एक सरल कार्यात्मक रीडआउट (उदाहरण के लिए, प्रतिदीप्ति) के साथ एक मॉडल कार्गो का उपयोग करके इन विट्रो अनुकूलन कर सकता है, कार्गो को बदलने से वाहक4 के लिए जैविक प्रतिक्रिया बदल सकती है और इस प्रकार, प्रतिनिधि परिणाम नहीं मिल सकते हैं। तीसरा, कई वाहक ों को एक विशिष्ट सेल प्रकार के साथ बातचीत करने और लेने के लिए डिज़ाइन किया गया है। वाहक की ऐसी लक्ष्यीकरण क्षमता को इसके चिकित्सीय कार्गो पोस्ट लक्ष्यीकरण के प्रदर्शन से अलग किया जा सकता है और किया जाना चाहिए। एलएनपी उदाहरण को जारी रखने के लिए, एक आरएनए कार्गो बेहद शक्तिशाली हो सकता है, लेकिन यदि एलएनपी सेल को बांधने, आंतरिक रूप से और आरएनए को छोड़ने में असमर्थ है, तो कोई डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक प्रभाव नहीं देखा जाएगा। यह विशेष रूप से वाहक के लिए एक मुद्दा हो सकता है जिसका उद्देश्य हार्ड-टू-ट्रांसेक्ट सेल प्रकारों को लक्षित करना है, जैसे कि टी सेल5। इसके विपरीत, एक एलएनपी बेहद प्रभावी ढंग से लक्षित कर सकता है, लेकिन आरएनए कार्गो कार्य नहीं कर सकता है। एक डाउनस्ट्रीम परख जो सिर्फ कार्गो कार्यक्षमता को मापता है, इन दो स्थितियों के बीच अंतर करने में असमर्थ होगा, इस प्रकार वाहक दवा वितरण प्रणालियों के विकास और अनुकूलन को जटिल करेगा।
इस काम में, वाहक संघ को पूरी तरह से कैसे निर्धारित किया जाए, इस पर चर्चा की जाती है। एसोसिएशन एक शब्द है जो एक वाहक और एक सेल के बीच बातचीत की प्रयोगात्मक रूप से मापी गई डिग्री को संदर्भित करता है। एसोसिएशन झिल्ली बंधन और आंतरिककरण के बीच अंतर नहीं करता है- एक वाहक जुड़ा हो सकता है क्योंकि यह कोशिका की सतह से बंधा होता है या क्योंकि कोशिका ने इसे आंतरिक रूप दिया है। एसोसिएशन को आमतौर पर सेल-वाहक इनक्यूबेशन प्रयोगों के हिस्से के रूप में मापा जाता है। ऐतिहासिक रूप से, एसोसिएशन को या तो मनमानी फ्लोरोसेंट इकाइयों (आमतौर पर "औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता" या एमएफआई) या "प्रतिशत एसोसिएशन" के रूप में रिपोर्टकिया गया है, मैट्रिक्स जिनकी सीमाओं पर पहले चर्चा की गई है। संक्षेप में, प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल, प्रवाह साइटोमीटर सेटिंग्स और विभिन्न वाहकों की लेबलिंग तीव्रता में अंतर के कारण ये माप प्रयोगों, प्रयोगशालाओं और दवा वाहकों के बीच तुलनीय नहीं हैं। साइटोमीटर को कैलिब्रेट करके पूर्व को दूर करने के प्रयास किए गए हैं, जिससे एमएफआई के सापेक्ष माप को प्रतिदीप्ति 7 के बिल्कुल मात्रात्मक माप में परिवर्तित कियाजा सके। हालांकि, यह विधि विभिन्न वाहकों की लेबलिंग तीव्रता में परिवर्तनशीलता के लिए जिम्मेदार नहीं है और इस प्रकार, विकल्प8 के लक्ष्य सेल में विभिन्न वाहक प्रदर्शनों की तर्कसंगत तुलना की अनुमति नहीं देती है।
यहां, सापेक्ष, मनमाने फ्लोरोसेंट इकाइयों से "प्रति सेल वाहक की संख्या" के पूर्ण मात्रात्मक मीट्रिक में व्यावहारिक रूप से कैसे परिवर्तित किया जाए, अतिरिक्त लक्षण वर्णन प्रयोगों की एक छोटी संख्या का प्रदर्शन करके प्रदर्शित किया जाता है। यदि वाहक एकाग्रता का एक और मीट्रिक वांछित है (उदाहरण के लिए, प्रति सेल वाहक द्रव्यमान या प्रति सेल वाहक मात्रा), तो वाहक प्रति सेल वाहक से परिवर्तित करना सरल है, बशर्ते वाहक लक्षण वर्णन किया गया हो। संक्षिप्तता के लिए और शब्दजाल से बचने के लिए, "वाहक" शब्द का उपयोग इस काम के भीतर दवा वितरण संरचनाओं के विशाल वर्गीकरण को संदर्भित करने के लिए किया जाता है। ये परिमाणीकरण तकनीक समान रूप से लागू होती हैं, चाहे नैनो-इंजीनियर सोने के कण या जैव-इंजीनियर बैक्टीरिया पर लागू हो।
कुछ तथ्य मनमाने फ्लोरोसेंट इकाइयों से प्रति सेल वाहक में रूपांतरण को सक्षम करते हैं। सबसे पहले, मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता एकफ्लोरोफोरे 9 (या फ्लोरोसेंटली लेबल वाहक) की एकाग्रता के समानुपाती है, यह मानते हुए कि प्रतिदीप्ति उपकरण की पहचान सीमा के भीतर है और इंस्ट्रूमेंटेशन सेटिंग्स समान हैं। इस प्रकार, यदि एक वाहक की प्रतिदीप्ति और एक नमूने की प्रतिदीप्ति ज्ञात है, तो कोई यह निर्धारित कर सकता है कि उस नमूने में कितने वाहक मौजूद हैं यदि सभी माप समान सेटिंग्स और शर्तों के तहत किए गए थे। हालांकि, विशेष रूप से छोटे वाहकों के लिए, वाहक प्रतिदीप्ति, सेल ऑटोफ्लोरेसेंस, और सेल-संबद्ध-वाहक प्रतिदीप्ति को एक ही उपकरण पर समान सेटिंग्स के साथ मापना संभव नहीं हो सकता है। इस मामले में, एक उपकरण पर मापा प्रतिदीप्ति और दूसरे पर मापा प्रतिदीप्ति के बीच परिवर्तित करना संभव बनाने के लिए एक दूसरी आवश्यकता है। ऐसा करने के लिए, समतुल्य घुलनशील फ्लोरोक्रोम (एमईएसएफ) मानक 9 के अणुओं का लाभ उठाते हुए, दोनों उपकरणों पर प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए फ्लोरोफोर एकाग्रता का एक मानक वक्र स्थापितकिया जा सकता है। यह तब एक गैर-साइटोमीटर पर थोक में वाहक प्रतिदीप्ति के माप की अनुमति देता है, एक माप जो किसी भी आकार या विशेषता के वाहक पर किया जा सकता है। जब ज्ञात एकाग्रता के वाहक निलंबन पर इस तरह के थोक परिमाणीकरण किए जाते हैं, तो एक नमूने के प्रति सेल वाहक की संख्या, एक बार फिर से गणना की जा सकती है।
जबकि यह काम वाहक संघ को मापने की प्रक्रिया को प्रदर्शित करता है (जैसा कि मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा निर्धारित किया जाता है), सेल-वाहक बातचीत के अन्य उपायों के लिए एक अनुरूप प्रोटोकॉल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल जो आंतरिक और झिल्ली-बाध्य वाहक को अलग करता है)। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल काफी हद तक समान होगा यदि एसोसिएशन को गैर-फ्लोरोसेंट परख (उदाहरण के लिए, मास साइटोमेट्री के माध्यम से) के माध्यम से मापा गया था।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20347</td>
			<td>pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apogee A50 Microflow</td>
			<td>Apogee</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>Tecan Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td>Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum MESF kits Alexa Fluor 647</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>647</td>
			<td>Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation

दवा वितरण प्रणालियों को डिजाइन करने का एक प्रमुख घटक यह चिंता करता है कि विशिष्ट सेल प्रकारों के साथ बातचीत को कैसे बढ़ाया या क्षीण किया जाए। उदाहरण के लिए, एक कीमोथेरेपी को कैंसर कोशिकाओं ("लक्ष्यीकरण") के बंधन को बढ़ाने के लिए एक एंटीबॉडी के साथ कार्यात्मक किया जा सकता है या प्रतिरक्षा कोशिका पहचान ("स्टील्थ") से बचने में मदद करने के लिए पॉलीथीन ग्लाइकोल के साथ कार्यात्मक किया जा सकता है। सेलुलर स्तर पर भी, दवा वाहक के बंधन और उत्थान को अनुकूलित करना एक जटिल जैविक डिजाइन समस्या है। इस प्रकार, यह अलग करना मूल्यवान है कि एक नया वाहक उस सेल में वितरित होने के बाद वाहक के कार्गो की कार्यात्मक प्रभावकारिता से सेल के साथ कितनी दृढ़ता से बातचीत करता है।
कीमोथेरेपी उदाहरण को जारी रखने के लिए, "यह कैंसर कोशिका को कितनी अच्छी तरह बांधता है" "यह कैंसर कोशिका को कितनी अच्छी तरह मारता है" से एक अलग समस्या है। उत्तरार्द्ध के लिए मात्रात्मक इन विट्रो परख अच्छी तरह से स्थापित हैं और आमतौर पर व्यवहार्यता को मापने पर निर्भर करते हैं। हालांकि, सेल-वाहक इंटरैक्शन पर अधिकांश प्रकाशित शोध गुणात्मक या अर्ध-मात्रात्मक है। आम तौर पर, ये माप वाहक के फ्लोरोसेंट लेबलिंग पर भरोसा करते हैं और, परिणामस्वरूप, सापेक्ष या मनमानी इकाइयों में कोशिकाओं के साथ बातचीत की रिपोर्ट करते हैं। हालांकि, इस काम को मानकीकृत किया जा सकता है और लक्षण वर्णन प्रयोगों की एक छोटी संख्या के साथ बिल्कुल मात्रात्मक बनाया जा सकता है। इस तरह का पूर्ण परिमाणीकरण मूल्यवान है, क्योंकि यह विभिन्न दवा वितरण प्रणालियों-नैनोकणों, माइक्रोपार्टिकल्स, वायरस, एंटीबॉडी-ड्रग संयुग्म, इंजीनियर चिकित्सीय कोशिकाओं, या बाह्य पुटिकाओं की तर्कसंगत, अंतर-और इंट्रा-क्लास तुलना की सुविधा प्रदान करता है।
इसके अलावा, बाद के मेटा-विश्लेषण या सिलिको मॉडलिंग दृष्टिकोण में परिमाणीकरण एक शर्त है। इस लेख में, वीडियो गाइड, साथ ही वाहक दवा वितरण प्रणालियों के लिए इन विट्रो परिमाणीकरण कैसे प्राप्त किया जाए, इसके लिए एक निर्णय वृक्ष प्रस्तुत किया गया है, जो वाहक आकार और लेबलिंग पद्धति में अंतर को ध्यान में रखता है। इसके अतिरिक्त, उन्नत दवा वितरण प्रणालियों के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए आगे के विचारों पर चर्चा की जाती है। यह दवा की अगली पीढ़ी के लिए तर्कसंगत मूल्यांकन और डिजाइन में सुधार के लिए एक मूल्यवान संसाधन के रूप में सेवा करने का इरादा है।

जैसा कि पहले चर्चा की गई है, विभिन्न दवा वाहक प्रकारों को सेल-वाहक संघ के पूर्ण परिमाणीकरण के लिए विभिन्न तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, 633 एनएम डाइसल्फ़ाइड-स्टेबलाइज्ड पॉली (मेथैक?...

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Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

नई दवा वितरण प्रणालियों के बेहतर तर्कसंगत मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके दवा वाहक-सेल इंटरैक्शन की पूर्ण मात्रा का ठहराव करने के लिए एक वर्कफ़्लो का प्रदर्शन किया जाता है। यह वर्कफ़्लो किसी भी प्रकार के दवा वाहक पर लागू होता है।

इन विट्रो में ड्रग डिलीवरी सिस्टम और कोशिकाओं के बीच बातचीत का प्रयोगात्मक परिमाणीकरण: प्रीक्लिनिकल नैनोमेडिसिन मूल्यांकन के लिए एक गाइड

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

यह प्रोटोकॉल मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है कि वाहक सिस्टम कोशिकाओं के साथ कैसे बातचीत करते हैं। मात्रात्मक डेटा इंजीनियरिंग और अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण है। यह हमें हां या नहीं जैविक प्रश्नों से कितने प्रश्नों तक जाने की अनुमति देता है।यह तकनीक प्रीक्लिनिकल दवा वाहक प्रदर्शन के परिणामों को मात्रात्मक परिणामों में परिवर्तित करने के लिए उपयोगी है, जो गुणात्मक थे। और यह तब भी काम करता है जब आप अपने वाहक को अपनी कोशिकाओं को चिह्नित करने की तुलना में एक अलग प्रणाली पर चिह्नित करते हैं। नैनो साइड के रैखिक या मात्रात्मक सीमाओं के भीतर आने वाले इष्टतम वाहक कमजोर पड़ने को खोजने में कुछ पुनरावृत्तियां लग सकती हैं।सही परिस्थितियों को खोजने के लिए अपना समय लें। शुरू करने के लिए, लेजर मॉड्यूल पर प्रवाह सेल माउंट करें। धीरे-धीरे एक मिलीलीटर आसुत जल के साथ 0.1 मिलीलीटर प्रति सेकंड की दर से प्रवाह सेल को फ्लश करें।यदि प्रवाह सेल के भीतर बुलबुले बनते हैं, तो आगे बढ़ने से पहले बुलबुले को एयर-लिक्विड इंटरफ़ेस के साथ विलय करने के लिए निलंबन को आंशिक रूप से वापस लें। फिर उपकरण के अंदर पूरे लेजर मॉड्यूल को लॉक करें। फ्लशिंग के माध्यम से कैमरे को लगभग आधे रास्ते में शुरू करें।यह पुष्टि करना सुनिश्चित करें कि वाहक मलबे बह गया है। कैप्चर सेटिंग्स टैब खोलने के लिए कैप्चर का चयन करें और स्टार्ट कैमरा क्लिक करें। सिस्टम को एक मिलीलीटर हवा के साथ ड्राइव करें।यदि स्क्रीन पर कोई स्थिर वाहक दिखाई दे रहा है, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रवाह सेल को साफ करें। नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए वाहक तैयार करें, यह सुनिश्चित करके कि वाहक शामिल वाहक प्रणाली के आधार पर सोनिकेशन या भंवर के माध्यम से वाहक अच्छी तरह से निलंबित हैं। वाहक को पानी में पतला करें ताकि प्रत्येक नमूने के कम से कम 0.6 से एक मिलीलीटर को तैयार किया जा सके, जिसमें 1x10 से सातवें और 1x10 से नौवें वाहक प्रति मिलीलीटर के बीच वाहक एकाग्रता हो।लेजर मॉड्यूल को बाहर निकालें और इसे सीधा रखें। पहले वाहक नमूने को एक मिलीलीटर सिरिंज में छोड़ दें और सिरिंज को ट्यूब इनलेट से संलग्न करें। फिर सावधानीपूर्वक नमूने को प्रवाह सेल में लोड करें।यदि प्रवाह सेल के भीतर बुलबुले बनते हैं, तो आगे बढ़ने से पहले बुलबुले को एयर-लिक्विड इंटरफ़ेस के साथ विलय करने के लिए निलंबन को आंशिक रूप से वापस लें। सुनिश्चित करें कि पूरा प्रवाह सेल तरल से भरा हुआ है, फिर लोडिंग को रोकें। व्यक्तिगत वाहक की कल्पना करने के लिए यदि आवश्यक हो तो कैमरा फोकस समायोजित करें।उपकरण के दाहिने हाथ की ओर घूमने वाले नॉब के साथ मोटे फोकस समायोजन करें। हार्डवेयर टैब का चयन करके बेहतर समायोजन करें. फ़ोकस स्लाइडर समायोजित करके फ़ोकस बदलें.यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई ओवरसैचुरेशन नहीं है, कैप्चर टैब के भीतर स्लाइडर को समायोजित करके इष्टतम कैमरा स्तर का चयन करें। यदि उपकरण इस सहायक से लैस है, तो वाहक नमूने वाले सिरिंज को सिरिंज पंप में लोड करें। एसओपी टैब के तहत, 30 सेकंड के पांच कैप्चर लेने के लिए मानक माप का चयन करें।आधार फ़ाइल नाम दर्ज करें, और यदि वांछित हो, तो उन्नत बटन पर क्लिक करके अतिरिक्त नमूना जानकारी जोड़ें जो विभिन्न विकल्पों के साथ एक मोडल संवाद खोल देगा। स्क्रिप्ट बनाएँ और चलाएँ दबाएँ और कृपया अग्रिम नमूना मांगने के लिए पॉप-अप दिखाई देने की प्रतीक्षा करें. यदि सिरिंज पंप का उपयोग कर रहे हैं, तो हार्डवेयर टैब का चयन करें और फिर सिरिंज पंप टैब।वांछित जलसेक दर सेट करें और इंफ्यूज दबाएं। यदि सिरिंज पंप का उपयोग नहीं कर रहे हैं, तो मैन्युअल रूप से नमूने को अग्रिम करें। पॉपअप विंडो में, कैप्चरिंग प्रारंभ करने के लिए ठीक का चयन करें.पांच कैप्चर में से प्रत्येक के बाद, जब कृपया उन्नत नमूना पॉप अप फिर से प्रकट होता है, तो जांचें कि नमूना अभी भी प्रवाह सेल के माध्यम से आगे बढ़ रहा है। फिर अगले कैप्चर के साथ आगे बढ़ने के लिए ठीक का चयन करें। प्रक्रिया टैब में, स्क्रीन पर दिखाई देने वाले अलग-अलग वाहकों की सही पहचान करने के लिए चार और आठ के बीच डिटेक्शन थ्रेशोल्ड स्लाइडर समायोजित करें।आप विज़ुअलाइज़ेशन की सहायता के लिए स्क्रीन लाभ को समायोजित कर सकते हैं, यह डाउनस्ट्रीम विश्लेषण को प्रभावित नहीं करेगा। पॉप-अप में, ट्रैकिंग विश्लेषण शुरू करने के लिए ठीक दबाएं। एकल विश्लेषण टैब में विश्लेषण पर क्लिक करके विश्लेषण प्रगति की निगरानी करें।एक बार विश्लेषण समाप्त हो जाने के बाद, प्रकट होने के लिए एक निर्यात सेटिंग्स प्रॉम्प्ट देखें। पुष्टि करें कि पीडीएफ शामिल करें और प्रयोग सारांश शामिल करें। इच्छानुसार किसी भी अन्य निर्यात प्रारूप का चयन करें।पीडीएफ डेटा निर्यात के परिणाम अनुभाग में, यह सुनिश्चित करने के लिए कि मापा गया एकाग्रता विश्वसनीय है, सत्यापित करें कि मापा वाहक एकाग्रता 1x10 से सातवें और 1x10 से नौवें वाहक प्रति मिलीलीटर के बीच है और एकाग्रता माप परिणाम के तहत किसी भी त्रुटि संदेश या सावधानी के संदेशों की जांच करें। स्टॉक से अलग-अलग कमजोर पड़ने के साथ प्रक्रिया को दो या अधिक बार दोहराएं, और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूने की एकाग्रता उपकरण की रैखिक सीमा के भीतर आती है। पाठ पांडुलिपि में वर्णित स्टॉक वाहक एकाग्रता की गणना करें।पाठ पांडुलिपि में वर्णित मुक्त या एंटीबॉडी संयुग्मित फ्लोरोक्रोम समाधान तैयार करें। समीकरण में दिखाए गए अनुसार एकाग्रता, आणविक भार और एवोगाड्रो की संख्या से स्टॉक समाधान की एकाग्रता की गणना करें। फिर मानक वक्र नमूने उत्पन्न करने के लिए वाहक डिल्यूएंट में डाई का एक सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।फिर वाहक नमूना माप प्लेट में जोड़ें और माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति को मापें। पाठ पांडुलिपि में वर्णित मानक वक्र उत्पन्न करें। वाहक एकाग्रता द्वारा थोक प्रतिदीप्ति को विभाजित करके प्रति वाहक पूर्ण प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना करें।संबंधित चैनलों में इष्टतम पीएमटी वोल्टेज सेटिंग्स निर्धारित करके अंतिम वाहक सेल प्रयोग के लिए प्रवाह साइटोमीटर सेट करें। एक नकारात्मक नियंत्रण नमूना चलाएं जहां पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं को वाहक के साथ इनक्यूबेट नहीं किया जाता है। फ्लो साइटोमेट्री मात्रा निर्धारण मोती तैयार करें और फिर से निलंबित करें।सेल नमूने के लिए उपयोग किए जाने वाले उसी बफर का उपयोग करें। यदि मोती आबादी अलग से प्रदान की जाती है, तो उन्हें एक साथ खींचें। प्रति सेल प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री क्वांटिटेशन बीड और वाहक सेल नमूने चलाएं।एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए प्रवाह साइटोमीटर की मात्रा को चलाएं, पूर्ण फ्लोरोसेंट तीव्रता को एमएफआई में परिवर्तित करें। पाठ पांडुलिपि में वर्णित वाहक के सैद्धांतिक एमएफआई की गणना करने के लिए इसका उपयोग करें। प्रत्येक नमूने के प्रति सेल फ्लोरोसेंट तीव्रता निर्धारित करने के लिए सेल वाहक नमूने चलाएं।अंत में, नमूने के मापा प्रतिदीप्ति से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को घटाकर प्रत्येक नमूने के लिए प्रति सेल वाहक की संख्या की गणना करें, और फिर प्रति कण प्रतिदीप्ति से विभाजित करें। 633 नैनोमीटर पॉलीमेथैक्रेलिक एसिड कोर शेल कणों के लिए, प्रति वाहक एकाग्रता और फ्लोरोसेंट तीव्रता सीधे साइटोमीटर स्ट्रीम का उपयोग करके मात्रात्मक थी। इसके विपरीत, 100 नैनोमीटर सुपर पैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड नैनोकणों को व्यक्तिगत रूप से पता लगाने के लिए बहुत छोटा था और थोक धारा का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था।एक प्रवाह साइटोमीटर पर मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए कई दिनों में लेबल किए गए मात्रा मोतियों का उपयोग किया गया था। मापे गए एमएफआई और मात्रा की मात्रा के एमईएसएफ मूल्य के बीच सहसंबंध रैखिक था और मोटे तौर पर मापा तिथियों के बीच समान था। शून्य से 24 घंटे तक 235 नैनोमीटर पॉलीमेथैक्रेलिक एसिड कैप्सूल के साथ फ्लोरोसेंट लेबल हेला कोशिकाओं का उपयोग करके टाइम कोर्स प्रयोगों ने समय के साथ एमएफआई में वृद्धि दिखाई, यह दर्शाता है कि कैप्सूल हेला कोशिकाओं के साथ जुड़ रहे थे।वाहक के लिए स्पष्ट सेलुलर प्रतिक्रिया में अंतर सापेक्ष या पूर्ण परिमाणीकरण के आधार पर स्पष्ट था। पूर्ण परिमाणीकरण लेबलिंग तीव्रता से स्वतंत्र था और इस प्रकार अधिक तुलनीय था। ये तकनीकें कण प्रदर्शन के गहन विश्लेषण और तुलना के लिए आधार हैं।हम गणितीय मॉडल को पैरामीटर करने के लिए इन तकनीकों का उपयोग करने के बारे में उत्साहित हैं जो हमें किसी विशेष प्रयोग से स्वतंत्र कण प्रदर्शन को चिह्नित करने की अनुमति देगा।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

मॉडल और सेलुलर बाधाओं को पार दवा वितरण प्रणाली के परिवहन का मूल्यांकन करने के तरीके

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

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खंगाला मानव कॉर्निया की तरह उपकला (RHCE) ऊतक मॉडल का उपयोग नेत्र परेशान रसायन का खतरा पहचान के लिए आंखों में जलन टेस्ट (ईआईटी)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

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Electrospinning प्रक्रिया अपनाना एक त्रि-स्तरीय लिए तीन विशिष्ट वातावरण प्रदान करने के लिए<em&gt; इन विट्रो</em&gt; श्वासनली की दीवार के मॉडल

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

सैंडविच की तरह microenvironments सेल / सामग्री सहभागिता के दोहन के लिए

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Endothelium लक्ष्यीकरण और नशीली दवाओं के वितरण के लिए कार्यात्मक 10 एनएम पॉलिमर लेपित सोने के कणों का संश्लेषण

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

तीन पूरक विधियों का उपयोग करके अपरा-लक्षित औषध सुपुर्दगी की प्रभावशीलता और सुरक्षा का व्यापक मूल्यांकन

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

चो कोशिकाओं में मॉडल IgG1 के उत्पादन के लिए उच्च प्रवाह स्वचालित Microbioreactor प्रणाली का उपयोग

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

चीनी हम्सटर अंडाशय कोशिकाओं से एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का शोधन और विश्लेषण एक स्वचालित माइक्रोबायोरिएक्टर सिस्टम का उपयोग करते हुए

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

व्यक्तिगत लिपोसोम्स के बीच रचनात्मक इनमोमोसिटी का पता लगाने के लिए एक मात्रात्मक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित एकल लिपोसम परख

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

ध्वनिक विभाजक का उपयोग करके चो काटा सेल कल्चर फ्लूइड का प्राथमिक स्पष्टीकरण

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...