Name: experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC; GNT1149990), il Centro australiano per la ricerca sull'HIV e la virologia dell'epatite (ACH2), nonché un dono della tenuta di Réjane Louise Langlois. F.C. riconosce l'assegnazione di una borsa di ricerca principale senior del National Health and Medical Research Council (NHMRC) (GNT1135806). La Figura 1 e la Figura 2 sono state create con BioRender.com.

1. Scegliere il flusso appropriato
<ol><li>Seguire l'albero decisionale descritto nella Figura 1 per determinare il flusso di lavoro migliore (flusso) (Figura 2) per la configurazione sperimentale utilizzata. Fare riferimento alla discussione per ulteriori commenti su questa scelta di flusso.</li>
	<li>Se si segue il flusso del citometro, continuare con i passaggi 2.1.1-2.2.7. Se si segue il flusso di massa, continuare con i passaggi 3.1.1.1-3...

<ol>
	<li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+ORgan+Targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR/Cas+gene+editing.">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Jackson, N. A. C., Kester, K. 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A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Comfort, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+tracking+analysis+for+the+quantification+and+size+determination+of+extracellular+vesicles.">Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISD3:+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems.">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).</li><li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. 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La caratterizzazione delle interazioni tra vettori di farmaci e cellule sta diventando sempre più importante nello sviluppo di nuovi sistemi di somministrazione di farmaci. In particolare, per consentire la valutazione razionale e il confronto di vari costrutti di portatori, è fondamentale quantificare in modo assoluto le prestazioni di detto vettore per interagire con cellule target e off-target. Questo protocollo descrive una metodologia a due flussi che consente a qualsiasi ricercatore che lavora con un vettore di f...

La progettazione di costrutti di somministrazione di farmaci che mostrano un comportamento specifico e progettato a seconda del tipo di cellula che incontrano ha attirato un notevole interesse di ricerca. I potenziali costrutti di somministrazione di farmaci o "vettori" includono formulazioni lipidiche, inorganici nano-coltivati, assemblaggi polimerici, vescicole extracellulari, cellule batteriche funzionalizzate o virus modificati. Tutti questi possono mostrare specificità di organi, tessuti o cellule a causa di proprietà fisiche, proprietà superficiali o funzionalizzazioni chimiche ingegnerizzate come l'attacco anticorpale 1,2.
Un passo quasi onnipresente nella valutazione del vettore in vitro è quello di incubare le cellule con una sospensione contenente detto vettore caricato di farmaco. Dopo l'incubazione, le prestazioni del vettore vengono misurate tramite una lettura funzionale delle prestazioni del carico di droga, ad esempio l'efficienza di trasfezione o la tossicità. Le letture funzionali sono utili, in quanto sono una misura a valle dell'efficacia del vettore. Tuttavia, per costrutti di somministrazione di farmaci più complessi, è sempre più importante andare oltre le letture funzionali e quantificare separatamente il grado di interazione del vettore con la cellula di interesse. Ci sono alcune ragioni per questo.
In primo luogo, c'è un crescente interesse nella scoperta (e nel miglioramento iterativo) di tecnologie di trasporto "piattaforma", che possono trasportare una varietà di merci. Ad esempio, le nanoparticelle lipidiche (LNP) progettate per incapsulare l'RNA possono scambiare una sequenza di RNA con un'altra con pochi avvertimenti3. Pertanto, per migliorare iterativamente la tecnologia del vettore, è fondamentale quantificarne le prestazioni indipendentemente dalla funzionalità del carico. In secondo luogo, le letture funzionali potrebbero non essere semplici per il carico di interesse, compromettendo la capacità di iterare e valutare rapidamente le formulazioni del vettore. Mentre si potrebbe eseguire l'ottimizzazione in vitro utilizzando un modello di carico con una semplice lettura funzionale (ad esempio, fluorescenza), la modifica del carico può cambiare la risposta biologica a un vettore4 e può, quindi, non produrre risultati rappresentativi. In terzo luogo, molti portatori sono progettati per interagire ed essere assorbiti da un tipo di cellula specifico. Tale capacità di targeting di un vettore può e deve essere differenziata dalle prestazioni del suo targeting terapeutico del carico di carico. Per continuare l'esempio LNP, un carico di RNA potrebbe essere estremamente potente, ma se l'LNP non è in grado di legarsi alla cellula, essere internalizzato e rilasciare l'RNA, non si osserverà alcun effetto funzionale a valle. Questo può essere un problema in particolare per i portatori destinati a colpire tipi di cellule difficili da trasfettare, come le cellule T5. Al contrario, un LNP potrebbe colpire in modo estremamente efficace, ma il carico di RNA potrebbe non funzionare. Un test a valle che si limiti a misurare la funzionalità del carico non sarà in grado di distinguere tra queste due situazioni, complicando così lo sviluppo e l'ottimizzazione dei sistemi di somministrazione di farmaci carrier.
In questo lavoro, viene discusso come quantificare assolutamente l'associazione del vettore. Associazione è un termine che si riferisce al grado di interazione misurato sperimentalmente tra un vettore e una cellula. L'associazione non distingue tra legame di membrana e internalizzazione: un vettore può essere associato perché è legato alla superficie cellulare o perché la cellula l'ha interiorizzata. L'associazione è comunemente misurata come parte degli esperimenti di incubazione del vettore cellulare. Storicamente, l'associazione è stata riportata sia in unità fluorescenti arbitrarie (tipicamente "intensità di fluorescenza mediana" o MFI) o come "associazione percentuale", metriche le cui limitazioni sono state precedentemente discusse6. In breve, queste misurazioni non sono comparabili tra esperimenti, laboratori e vettori di farmaci a causa delle differenze nei protocolli sperimentali, nelle impostazioni del citometro a flusso e nelle intensità di etichettatura dei diversi vettori. Sono stati fatti sforzi per superare il primo calibrando il citometro, convertendo così la misura relativa delle IFM in una misura assolutamente quantitativa della fluorescenza7. Tuttavia, questo metodo non tiene conto della variabilità dell'intensità di etichettatura dei vari vettori e, quindi, non consente il confronto razionale delle varie prestazioni del vettore in una cella target di scelta8.
Qui, come convertire praticamente da unità fluorescenti relative e arbitrarie alla metrica quantitativa assoluta del "numero di portatori per cella" è dimostrato eseguendo un piccolo numero di ulteriori esperimenti di caratterizzazione. Se si desidera un'altra metrica di concentrazione del vettore (ad esempio, massa portante per cella o volume portante per cella), è semplice convertire da portatori per cella, a condizione che sia stata eseguita la caratterizzazione del vettore. Per brevità e per evitare il gergo, la parola "vettore" è usata all'interno di questo lavoro per riferirsi al vasto assortimento di costrutti di somministrazione di farmaci. Queste tecniche di quantificazione sono ugualmente applicabili, sia applicate a una particella d'oro nano-ingegnerizzata o a un batterio bio-ingegnerizzato.
Alcuni fatti consentono la conversione da unità fluorescenti arbitrarie a vettori per cella. In primo luogo, l'intensità di fluorescenza misurata è proporzionale alla concentrazione di un fluoroforo9 (o di un vettore marcato con fluorescenza), supponendo che la fluorescenza rientri nei limiti di rilevazione dello strumento e che le impostazioni della strumentazione siano le stesse. Pertanto, se la fluorescenza di un vettore e la fluorescenza di un campione sono note, si può determinare quanti portatori sono presenti in quel campione se tutte le misurazioni sono state eseguite nelle stesse impostazioni e condizioni. Tuttavia, soprattutto per i vettori più piccoli, potrebbe non essere possibile misurare la fluorescenza del vettore, l'autofluorescenza cellulare e la fluorescenza associata alle cellule sullo stesso strumento con le stesse impostazioni. In questo caso, esiste un secondo requisito per rendere possibile la conversione tra fluorescenza misurata su uno strumento e fluorescenza misurata su un altro. Per fare ciò, è possibile stabilire una curva standard della concentrazione di fluorofori per misurare l'intensità della fluorescenza su entrambi gli strumenti, sfruttando lo standard MESF (Molecules of Equivalent Solubili Fluorochrome)9. Ciò consente quindi la misurazione della fluorescenza del vettore in massa su un non citometro, una misurazione che può essere eseguita su portatori di qualsiasi dimensione o caratteristica. Quando tale quantificazione di massa viene effettuata su una sospensione portante di concentrazione nota, il numero di portatori per cellula di un campione può, ancora una volta, essere calcolato.
Mentre questo lavoro dimostra il processo per misurare l'associazione dei portatori (come determinato dall'intensità di fluorescenza misurata), un protocollo analogo potrebbe essere eseguito per altre misure di interazione cellula-vettore (ad esempio, un protocollo sperimentale che differenzia i portatori internalizzati e legati alla membrana). Inoltre, questo protocollo sarebbe in gran parte lo stesso se l'associazione fosse misurata attraverso un saggio non fluorescente (ad esempio, attraverso la citometria di massa).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20347</td>
			<td>pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apogee A50 Microflow</td>
			<td>Apogee</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>Tecan Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td>Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum MESF kits Alexa Fluor 647</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>647</td>
			<td>Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation

Una componente importante della progettazione di sistemi di somministrazione di farmaci riguarda come amplificare o attenuare le interazioni con specifici tipi di cellule. Ad esempio, un chemioterapico potrebbe essere funzionalizzato con un anticorpo per migliorare il legame alle cellule tumorali ("targeting") o funzionalizzato con glicole polietilenico per aiutare a eludere il riconoscimento delle cellule immunitarie ("stealth"). Anche a livello cellulare, ottimizzare il legame e l'assorbimento di un vettore di farmaci è un problema di progettazione biologica complesso. Pertanto, è importante separare la forza con cui un nuovo vettore interagisce con una cella dall'efficacia funzionale del carico di un vettore una volta consegnato a quella cella.
Per continuare l'esempio chemioterapico, "quanto bene si lega a una cellula tumorale" è un problema separato da "quanto bene uccide una cellula tumorale". I saggi quantitativi in vitro per questi ultimi sono ben consolidati e di solito si basano sulla misurazione della vitalità. Tuttavia, la maggior parte delle ricerche pubblicate sulle interazioni cellula-vettore è qualitativa o semiquantitativa. Generalmente, queste misurazioni si basano sull'etichettatura fluorescente del vettore e, di conseguenza, riportano interazioni con le cellule in unità relative o arbitrarie. Tuttavia, questo lavoro può essere standardizzato ed essere reso assolutamente quantitativo con un piccolo numero di esperimenti di caratterizzazione. Tale quantificazione assoluta è preziosa, in quanto facilita confronti razionali, inter- e intra-classe di vari sistemi di somministrazione di farmaci: nanoparticelle, microparticelle, virus, coniugati anticorpo-farmaco, cellule terapeutiche ingegnerizzate o vescicole extracellulari.
Inoltre, la quantificazione è un prerequisito per successive meta-analisi o approcci di modellazione in silico . In questo articolo vengono presentate le guide video e un albero decisionale su come ottenere la quantificazione in vitro per i sistemi di somministrazione di farmaci carrier, che tengono conto delle differenze nelle dimensioni del vettore e nella modalità di etichettatura. Inoltre, vengono discusse ulteriori considerazioni per la valutazione quantitativa dei sistemi avanzati di somministrazione di farmaci. Questo è destinato a servire come una risorsa preziosa per migliorare la valutazione razionale e la progettazione per la prossima generazione di medicina.

Come discusso in precedenza, diversi tipi di vettori di farmaci richiedono l'uso di tecniche diverse per la quantificazione assoluta dell'associazione cellula-vettore. Ad esempio, le particelle del guscio centrale di poli(acido metacrilico) (PMASH) stabilizzate con disolfuro a 633 nm sono abbastanza grandi e dense per il rilevamento utilizzando un citometro a flusso sensibile. Come tali, queste particelle sono state etichettate in modo fluorescente, quindi controllate e contate utilizzando la diffusione della ...

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Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Viene dimostrato un flusso di lavoro per la quantificazione assoluta delle interazioni farmaco-cellula trasportatrice utilizzando la citometria a flusso per consentire una migliore valutazione razionale di nuovi sistemi di somministrazione di farmaci. Questo flusso di lavoro è applicabile ai vettori di droga di qualsiasi tipo.

Quantificazione sperimentale delle interazioni tra sistemi di somministrazione di farmaci e cellule in vitro: una guida per la valutazione preclinica della nanomedicina

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Questo protocollo fornisce dati quantitativi su come i sistemi carrier interagiscono con le cellule. I dati quantitativi sono fondamentali per l'ingegneria e l'ottimizzazione. Ci permette di passare da domande biologiche sì o no, a quante domande.Questa tecnica è utile per convertire i risultati delle prestazioni precliniche dei vettori di farmaci, che erano qualitativi, in risultati quantitativi. E questo funziona anche quando si caratterizza il vettore su un sistema diverso da quello che si caratterizzano le cellule. Possono essere necessarie alcune iterazioni per trovare la diluizione ottimale del vettore che rientra negli intervalli lineari o quantitativi del lato nano.Prenditi il tuo tempo per trovare le giuste condizioni. Per iniziare, montare la cella di flusso sul modulo laser. Lavare lentamente la cella di flusso alla velocità di 0,1 millilitri al secondo con un millilitro di acqua distillata.Se si formano bolle all'interno della cella di flusso, ritrarre parzialmente la sospensione per unire la bolla con l'interfaccia aria-liquido prima di procedere. Quindi bloccare l'intero modulo laser in posizione all'interno dello strumento. Avviare la fotocamera all'incirca a metà del lavaggio.Assicurati di confermare che i detriti del vettore siano stati lavati. Selezionare acquisizione per aprire la scheda delle impostazioni di acquisizione e fare clic su Avvia fotocamera. Guida il sistema con un millilitro d'aria.Se sullo schermo sono visibili supporti statici, pulire la cella di flusso seguendo le istruzioni del produttore. Preparare i vettori per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, assicurandosi che i vettori siano ben sospesi tramite sonicazione o vortice, a seconda del sistema di trasporto coinvolto. Diluire i supporti in acqua per preparare almeno da 0,6 a un millilitro di ciascun campione con una concentrazione di supporto compresa tra 1x10 e 1x10 al nono supporto per millilitro.Estrarre il modulo laser e posizionarlo in posizione verticale. Far cadere il primo campione di supporto in una siringa da un millilitro e collegare la siringa all'ingresso del tubo. Quindi caricare con attenzione il campione nella cella di flusso.Se si formano bolle all'interno della cella di flusso, ritrarre parzialmente la sospensione per unire la bolla con l'interfaccia aria-liquido prima di procedere. Assicurarsi che l'intera cella di flusso sia piena di liquido, quindi mettere in pausa il caricamento. Regolare la messa a fuoco della fotocamera, se necessario, per visualizzare i singoli operatori.Effettuare regolazioni grossolane della messa a fuoco con la manopola rotante sul lato destro dello strumento. Effettua regolazioni più precise selezionando la scheda hardware. Modificare la messa a fuoco regolando il cursore di messa a fuoco.Per assicurarti che non ci sia sovrasaturazione, seleziona il livello ottimale della fotocamera regolando il cursore all'interno della scheda di acquisizione. Se lo strumento è dotato di questo accessorio, caricare la siringa contenente il campione di supporto nella pompa della siringa. Nella scheda SOP, selezionare la misurazione standard per acquisire cinque acquisizioni di 30 secondi ciascuna.Immettere il nome del file di base e, se lo si desidera, aggiungere ulteriori informazioni di esempio facendo clic sul pulsante avanzato che aprirà un dialogo modale con varie scelte. Premi crea ed esegui script e attendi che appaia un pop-up che chiede di anticipare il campione. Se si utilizza la pompa a siringa, selezionare la scheda hardware e quindi la scheda pompa a siringa.Impostare la velocità di infusione desiderata e premere l'infusione. Se non si utilizza la pompa a siringa, far avanzare manualmente il campione. Nella finestra popup, selezionare OK per avviare l'acquisizione.Dopo ciascuna delle cinque acquisizioni, quando riappare il pop-up del campione avanzato, verificare che il campione si stia ancora muovendo attraverso la cella di flusso. Quindi selezionare OK per procedere con l'acquisizione successiva. Nella scheda processo, regolare il dispositivo di scorrimento della soglia di rilevamento tra quattro e otto per identificare correttamente i vettori distinti visibili sullo schermo.È possibile regolare il guadagno dello schermo per facilitare la visualizzazione, non influirà sull'analisi a valle. Nel popup, premere OK per avviare l'analisi di tracciamento. Monitorare l'avanzamento dell'analisi facendo clic sulla scheda Analisi in una singola analisi.Una volta terminata l'analisi, cerca che venga visualizzata una richiesta di impostazioni di esportazione. Verifica che il riepilogo dell'esperimento include PDF e include sia selezionato. Selezionare qualsiasi altro formato di esportazione desiderato.Nella sezione dei risultati dell'esportazione dei dati PDF, per garantire che la concentrazione misurata sia affidabile, verificare che la concentrazione del supporto misurato sia compresa tra 1x10 e il settimo e 1x10 al nono supporto per millilitro e verificare la presenza di eventuali messaggi di errore o messaggi di cautela sotto il risultato della misurazione della concentrazione. Ripetere la procedura due o più volte con diluizioni diverse dal materiale e assicurarsi che la concentrazione di ciascun campione rientri nell'intervallo lineare dello strumento. Calcolare la concentrazione del portatore come descritto nel manoscritto testuale.Preparare la soluzione di fluorocromo coniugato libero o anticorpo come descritto nel manoscritto testuale. Calcolare la concentrazione della soluzione madre dalla concentrazione, dal peso molecolare e dal numero di Avogadro come mostrato nell'equazione. Quindi eseguire una diluizione seriale del colorante nel diluente portante per generare campioni di curva standard.Quindi aggiungere il campione di supporto alla piastra di misurazione e misurare la fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre. Generare la curva standard come descritto nel testo manuscritto. Calcolare l'intensità assoluta di fluorescenza per vettore dividendo la fluorescenza di massa per la concentrazione del vettore.Impostare il citometro a flusso per l'esperimento finale della cella portante determinando le impostazioni ottimali della tensione PMT nei canali pertinenti. Eseguire un campione di controllo negativo in cui le cellule non sono incubate con vettori per determinare la fluorescenza di fondo. Preparare e risospendere le sfere di quantificazione della citometria a flusso.Utilizzare lo stesso buffer utilizzato per i campioni di celle. Se le popolazioni di perline sono fornite separatamente, tirarle insieme. Eseguire il cordone di quantificazione della citometria a flusso e i campioni di cellule portatrici per determinare l'intensità della fluorescenza per cellula.Eseguire le sfere di quantificazione del citometro a flusso per generare una curva standard, convertendo l'intensità fluorescente assoluta in MFI. Utilizzare questo per calcolare l'IFM teorico dei vettori come descritto nel manoscritto di testo. Eseguire i campioni del vettore cellulare per determinare l'intensità fluorescente per cella di ciascun campione.Infine, calcolare il numero di vettori per cella per ciascun campione sottraendo la fluorescenza di fondo dalla fluorescenza misurata del campione e quindi dividendo per la fluorescenza per particella. Per le particelle del guscio del nucleo di acido polimetacrilico a 633 nanometri, la concentrazione e l'intensità fluorescente per vettore sono state quantificate direttamente utilizzando il flusso citometrico. Al contrario, le nanoparticelle di ossido di ferro super paramagnetico a 100 nanometri erano troppo piccole per essere rilevate individualmente e sono state analizzate utilizzando il flusso di massa.Le perle di quantificazione etichettate sono state utilizzate per più giorni per generare curve standard su un citometro a flusso. La correlazione tra l'IFM misurata e il valore MESF delle sfere di quantificazione era lineare e sostanzialmente simile tra le date misurate. Gli esperimenti con cellule HeLa marcate fluorescenti con capsule di acido polimetacrilico a 235 nanometri da zero a 24 ore hanno mostrato un aumento dell'MFI nel tempo, indicando che le capsule si stavano associando alle cellule HeLa.La differenza nella risposta cellulare apparente ai portatori era netta, a seconda della quantificazione relativa o assoluta. La quantificazione assoluta era indipendente dall'intensità dell'etichettatura e quindi più comparabile. Queste tecniche sono la base per un'analisi e un confronto più approfonditi delle prestazioni delle particelle.Siamo entusiasti di utilizzare queste tecniche per parametrizzare modelli matematici che ci permetteranno di caratterizzare le prestazioni delle particelle indipendentemente da qualsiasi particolare esperimento.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modelli e metodi per valutare il trasporto di Drug Delivery Systems attraverso le barriere cellulari

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Ricerca

Bioingegneria

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adattamento del processo Electrospinning per fornire tre ambienti unici per un Tri-livello<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della parete delle vie aeree

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Microambienti sandwich di sfruttare Cellulari / Materiale Interazioni

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Sintesi di particelle d'oro rivestite di polimeri 10-nm funzionalizzate per il Targeting di endotelio e Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Valutazione globale dell'efficacia e della sicurezza di Placenta-Targeted Drug Delivery utilizzando tre metodi complementari

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Chiarificazione primaria del fluido di coltura cellulare raccolto da CHO utilizzando un separatore acustico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...