Name: experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00
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この作業は、オーストラリア国立保健医療研究評議会(NHMRC;プログラム助成金番号GNT1149990)、オーストラリアHIVおよび肝炎ウイルス学研究センター(ACH2)、およびレジェーンルイーズラングロワの不動産からの贈り物。FCは、国立保健医療研究評議会(NHMRC)のシニアプリンシパルリサーチフェローシップ(GNT1135806)の授与を認めています。図 1 と 図 2 は BioRender.com を使用して作成されました。

1.適切なストリームの選択
<ol><li>図 1 で概説されている決定木に従って、使用する実験セットアップに最適なワークフロー (ストリーム) (図 2) を決定します。このストリームの選択に関するさらなるコメントについては、ディスカッションを参照してください。</li>
	<li>サイトメーターストリームに従う場合は、手順2.1.1〜2.2.7に進み?...

<ol>
	<li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+ORgan+Targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR/Cas+gene+editing.">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+mRNA+vaccines:+A+biotech+and+industrial+perspective.">The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective.</a> npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).</li><li>Press, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo-carrier+interactions+significantly+contribute+to+micellar+conformation+and+biodistribution.">Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution.</a> NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).</li><li>Cevaal, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+T+cell-targeting+nanoparticle+drug+delivery+systems:+Considerations+for+rational+design.">In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design.</a> ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).</li><li>Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-nano+science:+Better+metrics+would+accelerate+progress.">Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress.</a> Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).</li><li>Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+level+of+nanoparticle+uptake+in+mammalian+cells+using+flow+cytometry.">Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry.</a> Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).</li><li>Lozano-Andr&#233;s, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+MESF-bead+based+assignment+of+absolute+fluorescence+values+to+nanoparticles+and+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Schwartz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalization+of+the+MESF+unit+of+fluorescence+intensity.">Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cell-particle+association+in+vitro:+A+quantitative+method+to+compare+particle+performance.">Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance.</a> Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Comfort, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+tracking+analysis+for+the+quantification+and+size+determination+of+extracellular+vesicles.">Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+particle+imaging+for+quantification+of+nano-+and+microparticles.">Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles.</a> Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+Towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISD3:+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems.">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).</li><li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions.">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).</li><li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density.">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature.">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li></ol>

薬物キャリアと細胞の間の相互作用を特徴づけることは、新しい薬物送達システムの開発においてますます重要になっています。具体的には、様々な担体構築物の合理的な評価および比較を可能にするために、標的細胞およびオフ標的細胞と相互作用する前記担体の性能の絶対定量化が重要である。このプロトコルは、薬物キャリアを扱う研究者が、細胞キャリアの会合に関する相対的な半?...

遭遇する細胞タイプに応じて特異的に設計された挙動を示すドラッグデリバリーコンストラクトの設計は、大きな研究関心を集めています。潜在的な薬物送達構築物または「担体」には、脂質製剤、ナノ成長無機物、ポリマー集合体、細胞外小胞、機能化された細菌細胞、または修飾ウイルスが含まれる。これらはすべて、物理的特性、表面特性、または抗体付着などの操作された化学的機能化により、臓器、組織、または細胞の特異性を示す可能性があります1,2。
in vitro担体評価におけるほぼユビキタスなステップは、前記薬物担持担体を含む懸濁液と共に細胞をインキュベートすることである。インキュベーション後、キャリア性能は、トランスフェクション効率や毒性などの薬剤貨物の性能の機能的読み出しによって測定されます。機能読み出しは、キャリアの有効性の下流の尺度であるため、有用です。しかし、より複雑な薬物送達構築物の場合、機能的な読み出しを超えて、目的の細胞とのキャリア相互作用の程度を個別に定量することがますます重要になっています。これにはいくつかの理由があります。
第一に、さまざまな貨物を運ぶことができる「プラットフォーム」キャリア技術の発見(および反復的な改善)への関心が高まっています。例えば、RNAをカプセル化するように設計された脂質ナノ粒子(LNP)は、あるRNA配列を別のRNA配列と交換することができますが、いくつかの注意点があります3。したがって、運送業者の技術を反復的に改善するには、貨物の機能に関係なくその性能を定量化することが重要です。第二に、関心のある貨物にとって機能的な読み出しは単純ではない可能性があり、キャリアの処方を迅速に反復して評価する能力を損なう可能性があります。単純な機能読み出し(例えば、蛍光)を有するモデル貨物を用いてin vitro最適化を行うことができるが、貨物を変更すると、担体4に対する生物学的応答が変化する可能性があり、したがって、代表的な結果をもたらさない可能性がある。第三に、多くのキャリアは、特定の細胞型と相互作用し、取り込まれるように設計されています。運送業者のこのようなターゲティング能力は、その治療用貨物ポストターゲティングの性能と区別することができ、また区別されるべきである。LNPの例を続けると、RNAカーゴは非常に強力かもしれませんが、LNPが細胞に結合し、内在化され、RNAを放出できない場合、下流の機能的影響は観察されません。これは、T細胞5などのトランスフェクションが困難な細胞型を標的とすることを目的としたキャリアにとって特に問題になる可能性があります。逆に、LNPは非常に効果的に標的化することができますが、RNA貨物は機能しない可能性があります。貨物の機能を測定するだけのダウンストリームアッセイでは、これら2つの状況を区別できないため、キャリアドラッグデリバリーシステムの開発と最適化が複雑になります。
この作業では、キャリア の関連付け を絶対的に定量化する方法について説明します。会合は、担体と細胞との間の相互作用の実験的に測定された程度を指す用語である。会合は膜結合とインターナリゼーションを区別しない−担体は、それが細胞表面に結合しているため、または細胞がそれをインターナリゼーションしたために会合し得る。会合は、通常、細胞キャリアインキュベーション実験の一部として測定されます。歴史的に、関連性は任意の蛍光単位(典型的には「蛍光強度の中央値」またはMFI)または「パーセントアソシエーション」のいずれかで報告されており、その限界は以前に議論されている指標です6。要するに、これらの測定値は、実験プロトコル、フローサイトメーターの設定、および異なるキャリアの標識強度の違いにより、実験、実験室、および薬物キャリア間で比較できません。サイトメーターを較正し、それによってMFIの相対測定値を蛍光の絶対定量的測定値に変換することにより、前者を克服するための努力がなされてきました7。しかしながら、この方法は、様々なキャリアの標識強度の変動を考慮していないため、選択した標的細胞における様々なキャリア性能の合理的な比較はできない8。
ここで、相対的な任意の蛍光単位から「細胞当たりのキャリア数」の絶対定量的測定基準に実際的に変換する方法は、少数の追加の特性評価実験を行うことによって実証される。キャリア濃度の別のメトリック(例えば、細胞当たりのキャリア質量または細胞当たりのキャリア体積)が望まれる場合、キャリア特性評価が行われていれば、細胞当たりのキャリアから変換することは容易である。簡潔にするために、専門用語を避けるために、この作品では「キャリア」という言葉を使用して、膨大な品揃えのドラッグデリバリー構造を指します。これらの定量技術は、ナノエンジニアリングされた金粒子またはバイオエンジニアリングされた細菌に適用されるかどうかにかかわらず、等しく適用できます。
いくつかの事実により、任意の蛍光単位から細胞当たりの担体への変換が可能になります。まず、測定された蛍光強度は、蛍光が装置の検出限界内にあり、機器設定が同じであると仮定して、蛍光色素9 (または蛍光標識された担体)の濃度に比例します。したがって、担体の蛍光とサンプルの蛍光がわかっている場合、すべての測定が同じ設定および条件下で行われた場合、そのサンプルに存在するキャリアの数を決定できます。ただし、特に小型のキャリアの場合、キャリア蛍光、細胞自家蛍光、および細胞会合蛍光を同じ装置で同じ設定で測定できない場合があります。この場合、ある装置で測定された蛍光と別の装置で測定された蛍光の間で変換できるようにするという2番目の要件があります。そのために、蛍光色素濃度の標準曲線を確立して、当量可溶性蛍光色素分子(MESF)標準9を利用して、両方の機器の蛍光強度を測定することができます。これにより、次いで、非サイトメーター上でのキャリア蛍光のバルクの測定が可能になり、任意のサイズまたは特性のキャリア上で行うことができる測定が可能になります。このようなバルク定量が既知の濃度の担体懸濁液に対して行われる場合、サンプルの細胞当たりの担体の数を、もう一度計算することができる。
この研究は、キャリア会合(測定された蛍光強度によって決定される)を測定するプロセスを実証しているが、細胞-キャリア相互作用の他の測定(例えば、インターナライズドキャリアと膜結合キャリアを区別する実験プロトコル)についても同様のプロトコルを実行することができる。さらに、このプロトコルは、非蛍光アッセイ(例えば、マスサイトメトリー)によって関連が測定された場合、ほぼ同じであろう。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20347</td>
			<td>pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apogee A50 Microflow</td>
			<td>Apogee</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>Tecan Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td>Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum MESF kits Alexa Fluor 647</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>647</td>
			<td>Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation

ドラッグデリバリーシステムの設計の主要なコンポーネントは、特定の細胞タイプとの相互作用を増幅または減衰させる方法に関係しています。例えば、化学療法は、癌細胞への結合を増強するために抗体で機能化され(「ターゲティング」)、または免疫細胞の認識を回避するのを助けるためにポリエチレングリコールで機能化され得る(「ステルス」)。細胞レベルであっても、薬物キャリアの結合と取り込みを最適化することは、複雑な生物学的設計上の問題です。したがって、新しい運送業者がセルとどの程度強く相互作用するかを、そのセルに配送された運送業者の貨物の機能的有効性から分離することは価値があります。
化学療法の例を続けると、「がん細胞にどれだけうまく結合するか」は、「がん細胞をどれだけうまく殺すか」とは別の問題です。後者の定量的 in vitro アッセイは十分に確立されており、通常は生存率の測定に依存しています。ただし、細胞キャリア相互作用に関するほとんどの公開された研究は、定性的または半定量的です。一般に、これらの測定は担体の蛍光標識に依存しており、その結果、細胞との相互作用を相対的または任意の単位で報告します。ただし、この作業は標準化され、少数の特性評価実験で絶対的に定量化できます。このような絶対定量は、ナノ粒子、微粒子、ウイルス、抗体薬物複合体、操作された治療細胞、または細胞外小胞など、さまざまな薬物送達システムの合理的なクラス間およびクラス内の比較を容易にするため、価値があります。
さらに、定量化は、その後のメタアナリ シスまたはインシリコ モデリングアプローチの前提条件です。この記事では、キャリアサイズと標識モダリティの違いを考慮したビデオガイドと、キャリアドラッグデリバリーシステムの in vitro 定量を実現する方法の決定木を紹介します。さらに、高度なドラッグデリバリーシステムの定量的評価に関するさらなる考慮事項について説明します。これは、次世代の医療の合理的な評価と設計を改善するための貴重なリソースとして機能することを目的としています。

前述のように、異なる薬物キャリアタイプは、細胞キャリア会合の絶対定量のために異なる技術の使用を必要とする。例えば、633 nmのジスルフィド安定化ポリ(メタクリル酸)(PMASH)コアシェル粒子は、高感度フローサイトメーターを使用して検出するのに十分な大きさと密度です。そのため、これらの粒子を蛍光標識し、サイドアングル光散乱(SALS、SSCに類似)と適切な蛍光チャネルを?...

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Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

フローサイトメトリーを使用して薬物キャリアと細胞間相互作用の絶対定量を行うためのワークフローが実証され、新しい薬物送達システムのより合理的な評価が可能になります。このワークフローは、あらゆるタイプの薬物キャリアに適用できます。

in vitroでのドラッグデリバリーシステムと細胞間の相互作用の実験的定量:前臨床ナノメディシン評価のためのガイド

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

このプロトコルは、キャリアシステムが細胞とどのように相互作用するかに関する定量的データを提供します。定量的データは、エンジニアリングと最適化の鍵です。それは私たちが生物学的な質問からどれだけの質問に移ることを可能にします。この手法は、定性的であった前臨床薬物キャリア性能の結果を定量的結果に変換するのに役立ちます。そして、これは、細胞を特徴付けるのとは異なるシステムでキャリアを特徴付ける場合でも機能します。ナノ側の直線的または定量的範囲内にある最適なキャリア希釈を見つけるには、数回の反復が必要になる場合があります。適切な条件を見つけるために時間をかけてください。まず、フローセルをレーザーモジュールに取り付けます。1ミリリットルの蒸留水で毎秒0.1ミリリットルの割合でフローセルをゆっくりと洗い流します。フローセル内に気泡が形成された場合は、懸濁液を部分的に引っ込めて気泡を気液界面に融合させてから先に進みます。次に、レーザーモジュール全体を機器内の所定の位置にロックします。フラッシュのほぼ半分でカメラを起動します。キャリアの破片が洗い流されていることを必ず確認してください。[キャプチャ]を選択して[キャプチャ設定]タブを開き、[カメラの起動]をクリックします。1ミリリットルの空気でシステムを駆動します。画面に静電気キャリアが表示されている場合は、製造元の指示に従ってフローセルを清掃します。キャリアが関与するキャリアシステムに応じて、超音波処理またはボルテックスを介してキャリアが十分に懸濁されていることを確認することにより、ナノ粒子追跡分析のためのキャリアを準備します。担体を水で希釈して、ミリリットルあたり1x10から7番目および1x10から9番目の担体の間のキャリア濃度で各サンプルの少なくとも0.6から1ミリリットルを調製する。レーザーモジュールを取り出し、直立させます。最初のキャリアサンプルを1ミリリットルのシリンジに落とし、シリンジをチューブインレットに取り付けます。次に、サンプルをフローセルに慎重にロードします。フローセル内に気泡が形成された場合は、懸濁液を部分的に引っ込めて気泡を気液界面に融合させてから進めてください。フローセル全体が液体で満たされていることを確認してから、ロードを一時停止します。必要に応じてカメラのフォーカスを調整して、個々のキャリアを視覚化します。楽器の右側にある回転ノブで粗いフォーカス調整を行います。ハードウェアタブを選択して、より細かい調整を行います。フォーカススライダーを調整してフォーカスを変更します。過飽和にならないようにするには、[キャプチャ]タブ内のスライダーを調整して最適なカメラレベルを選択します。機器にこのアクセサリが装備されている場合は、キャリアサンプルを含むシリンジをシリンジポンプに入れます。[SOP]タブで、[標準測定]を選択して、それぞれ30秒のキャプチャを5回行います。ベースファイル名を入力し、必要に応じて、さまざまな選択肢を含むモーダルダイアログを開く詳細ボタンをクリックして、サンプル情報を追加します。スクリプトの作成と実行を押し、サンプルを進めるように求めるポップアップが表示されるのを待ちます。シリンジポンプを使用する場合は、[ハードウェア]タブを選択してから、[シリンジポンプ]タブを選択します。希望の注入速度を設定し、注入を押します。シリンジポンプを使用しない場合は、サンプルを手動で進めます。ポップアップ ウィンドウで、[OK] を選択してキャプチャを開始します。5 つのキャプチャのそれぞれが後、[高度なサンプルを指定してください] ポップアップが再表示されたら、サンプルがまだフロー セル内を移動していることを確認します。次に、 [OK] を選択して次のキャプチャを続行します。[プロセス] タブで、検出しきい値スライダーを 4 から 8 の間で調整して、画面に表示される個別のキャリアを正しく識別します。視覚化を支援するために画面ゲインを調整できますが、下流の分析には影響しません。ポップアップで [OK] を押してトラッキング解析を開始します。単一の分析タブで分析をクリックして、分析の進行状況を監視します。分析が終了したら、表示されるエクスポート設定プロンプトを探します。[PDF を含める] と [実験の概要を含める] が選択されていることを確認します。必要に応じて、他のエクスポート形式を選択します。PDFデータエクスポートの結果セクションで、測定された濃度が信頼できることを確認するために、測定されたキャリア濃度がミリリットルあたり1x10から7番目、1x10から9番目のキャリアの間であることを確認し、濃度測定結果の下にエラーメッセージまたは注意メッセージがないか確認します。ストックから異なる希釈液を使用してこの手順を2回以上繰り返し、各サンプルの濃度が機器の直線範囲内にあることを確認します。テキスト原稿に記載されているように、ストックキャリア濃度を計算します。テキスト原稿に記載されているように遊離または抗体結合蛍光色素溶液を調製する。式に示すように、濃度、分子量、アボガドロ数から原液の濃度を計算します。次いで、担体希釈液中で色素の段階希釈を行い、標準曲線サンプルを生成する。次に、キャリアサンプルを測定プレートに追加し、マイクロプレートリーダーを使用して蛍光を測定します。テキスト原稿に記載されているように検量線を生成します。バルク蛍光をキャリア濃度で割ることにより、担体当たりの絶対蛍光強度を計算する。関連するチャンネルで最適なPMT電圧設定を決定することにより、最終的なキャリア細胞実験用のフローサイトメーターをセットアップします。細胞をキャリアと一緒にインキュベートしていないネガティブコントロールサンプルを実行して、バックグラウンド蛍光を測定します。フローサイトメトリー定量ビーズを準備し、再懸濁します。細胞サンプルに用いたのと同じバッファーを使用してください。ビーズ集団が別々に提供されている場合は、それらを一緒に引っ張ります。フローサイトメトリー定量ビーズおよびキャリア細胞サンプルを実行し、細胞当たりの蛍光強度を測定した。フローサイトメーター定量ビーズを実行して検量線を生成し、絶対蛍光強度をMFIに変換します。これを使用して、テキスト原稿に記載されているキャリアの理論上のMFIを計算します。細胞キャリアサンプルを実行して、各サンプルの細胞あたりの蛍光強度を決定します。最後に、測定されたサンプルの蛍光からバックグラウンド蛍光を差し引き、粒子あたりの蛍光で割ることにより、各サンプルの細胞あたりのキャリア数を計算します。633ナノメートルのポリメタクリル酸コアシェル粒子について、担体当たりの濃度および蛍光強度をサイトメーターストリームを用いて直接定量可能とした。対照的に、100ナノメートルの超常磁性酸化鉄ナノ粒子は小さすぎて個別に検出できず、バルクストリームを使用して分析されました。標識定量ビーズを複数日使用して、フローサイトメーターで標準曲線を作成しました。測定されたMFIと定量ビーズのMESF値との間の相関は線形であり、測定日間でほぼ類似していた。蛍光標識されたHeLa細胞と235ナノメートルのポリメタクリル酸カプセルを用いた0時間から24時間の経時的実験では、時間の経過とともにMFIの増加が示され、カプセルがHeLa細胞と会合していることが示されました。キャリアに対する明らかな細胞応答の違いは、相対的または絶対的な定量に依存して顕著でした。.絶対定量は標識強度とは無関係であり、したがってより比較可能であった。これらの手法は、粒子性能のより深い分析と比較の基礎となります。これらの手法を使用して数学モデルをパラメータ化し、特定の実験とは無関係に粒子の性能を特徴付けることができることに興奮しています。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

携帯の障壁を通過する薬物送達システムの輸送を評価するためのモデルと方法

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

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三層のための3つのユニークな環境を提供するために、エレクトロスピニング法を適応させます<em&gt;インビトロ</em&gt;気道壁のモデル

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

サンドイッチ状の微小環境は、Cell /材料の相互作用を活用します

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Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

粒子の合成機能 10 nm ポリマー コーティング金対象化、血管内皮細胞とドラッグデリバリー

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

3 つの補完的な手法を使用して胎盤をターゲットとした薬剤投与の安全性の総合評価

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Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

高スループットの自動モデル IgG1 CHO 細胞での生産のための Microbioreactor システム

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

自動化された微生物叢システムを用いた中国ハムスター卵巣細胞からのモノクローナル抗体の精製と分析

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

個々のリポソーム間の組成不均一性を検出するための定量的蛍光顕微鏡ベースの単一リポソームアッセイ

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

音響セパレータを用いたCHO採取細胞培養液の一次解明

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...