Name: experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC; GNT1149990), Australian Centre for HIV and Hepatitis Virology Research (ACH2), samt en gave fra boet til Réjane Louise Langlois. F.C. anerkjenner tildelingen av et National Health and Medical Research Council (NHMRC) Senior Principal Research Fellowship (GNT1135806). Figur 1 og figur 2 ble laget med BioRender.com.

1. Velge riktig strøm
<ol><li>Følg beslutningstreet som er beskrevet i figur 1 , for å finne den beste arbeidsflyten (strøm) (figur 2) for det eksperimentelle oppsettet som brukes. Se diskusjonen for ytterligere kommentarer til dette valget av strøm.</li>
	<li>Hvis du følger cytometerstrømmen, fortsett med trinn 2.1.1-2.2.7. Hvis du følger Bulk Stream, fortsetter du med trinn 3.1.1.1-3.1.5.7.</li>
</ol><p class="jove_content biglegend"...

<ol>
	<li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+ORgan+Targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR/Cas+gene+editing.">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+mRNA+vaccines:+A+biotech+and+industrial+perspective.">The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective.</a> npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).</li><li>Press, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo-carrier+interactions+significantly+contribute+to+micellar+conformation+and+biodistribution.">Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution.</a> NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).</li><li>Cevaal, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+T+cell-targeting+nanoparticle+drug+delivery+systems:+Considerations+for+rational+design.">In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design.</a> ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).</li><li>Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-nano+science:+Better+metrics+would+accelerate+progress.">Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress.</a> Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).</li><li>Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+level+of+nanoparticle+uptake+in+mammalian+cells+using+flow+cytometry.">Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry.</a> Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).</li><li>Lozano-Andr&#233;s, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+MESF-bead+based+assignment+of+absolute+fluorescence+values+to+nanoparticles+and+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Schwartz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalization+of+the+MESF+unit+of+fluorescence+intensity.">Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cell-particle+association+in+vitro:+A+quantitative+method+to+compare+particle+performance.">Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance.</a> Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Comfort, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+tracking+analysis+for+the+quantification+and+size+determination+of+extracellular+vesicles.">Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+particle+imaging+for+quantification+of+nano-+and+microparticles.">Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles.</a> Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+Towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISD3:+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems.">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).</li><li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions.">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).</li><li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density.">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature.">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li></ol>

Karakterisering av samspillet mellom legemiddelbærere og celler blir stadig viktigere i utviklingen av nye legemiddelleveringssystemer. Spesielt for å tillate rasjonell evaluering og sammenligning av ulike bærerkonstruksjoner, er absolutt kvantifisering av ytelsen til transportøren til å samhandle med mål- og off-target-celler kritisk. Denne protokollen beskriver en tostrømsmetode som gjør det mulig for enhver forsker som arbeider med en legemiddelbærer å konvertere relative, semikvantitative flowcytometridata ...

Utformingen av legemiddelleveringskonstruksjoner som viser spesifikk, designet oppførsel avhengig av hvilken celletype de møter, har tiltrukket seg betydelig forskningsinteresse. Potensielle legemiddelleveringskonstruksjoner eller "bærere" inkluderer lipidformuleringer, nano-dyrkede uorganiske stoffer, polymere forsamlinger, ekstracellulære vesikler, funksjonaliserte bakterieceller eller modifiserte virus. Alle disse kan utvise organ-, vevs- eller cellespesifisitet på grunn av fysiske egenskaper, overflateegenskaper eller konstruerte kjemiske funksjonaliseringer som antistofffeste 1,2.
Et nesten allestedsnærværende trinn i in vitro-bærerevaluering er å inkubere celler med en suspensjon som inneholder den legemiddelbelastede bæreren. Etter inkubasjon måles bærerens ytelse via en funksjonell avlesning av legemiddellastens ytelse, for eksempel transfeksjonseffektivitet eller toksisitet. Funksjonelle avlesninger er nyttige, da de er et nedstrøms mål på transportørens effektivitet. For mer komplekse legemiddelleveringskonstruksjoner er det imidlertid stadig viktigere å bevege seg utover funksjonelle avlesninger og separat kvantifisere graden av bærerinteraksjon med cellen av interesse. Det er noen grunner til dette.
For det første er det økende interesse for å oppdage (og iterativt forbedre) "plattform" transportørteknologier, som kan bære en rekke last. For eksempel kan lipid nanopartikler (LNPs) designet for å innkapsle RNA bytte en RNA-sekvens for en annen med få advarsler3. For å iterativt forbedre transportørteknologien er det derfor avgjørende å kvantifisere ytelsen uavhengig av lastfunksjonaliteten. For det andre kan funksjonelle avlesninger ikke være enkle for lasten av interesse, noe som kompromitterer evnen til raskt å iterere og evaluere transportørformuleringer. Mens man kan utføre in vitro-optimalisering ved hjelp av en modelllast med en enkel funksjonell avlesning (for eksempel fluorescens), kan endring av lasten endre den biologiske responsen til en bærer4 og kan dermed ikke gi representative resultater. For det tredje er mange bærere designet for å samhandle med og bli tatt opp av en bestemt celletype. En slik målrettingsevne for en transportør kan og bør differensieres fra ytelsen til den terapeutiske lastpostmålrettingen. For å fortsette LNP-eksemplet kan en RNA-last være ekstremt kraftig, men hvis LNP ikke klarer å binde seg til cellen, internaliseres og frigjøre RNA, vil ingen nedstrøms funksjonell effekt bli observert. Dette kan være et problem spesielt for bærere som er ment å målrette mot celletyper som er vanskelige å transfektere, for eksempel T-celler5. Omvendt kan en LNP målrette ekstremt effektivt, men RNA-lasten fungerer kanskje ikke. En nedstrøms analyse som bare måler lastfunksjonalitet, vil ikke kunne skille mellom disse to situasjonene, og dermed komplisere utviklingen og optimaliseringen av transportørens legemiddelleveringssystemer.
I dette arbeidet diskuteres hvordan man absolutt kvantifiserer transportørforening . Forening er et begrep som refererer til den eksperimentelt målte graden av interaksjon mellom en bærer og en celle. Assosiasjon skiller ikke mellom membranbinding og internalisering - en bærer kan være assosiert fordi den er bundet til celleoverflaten eller fordi cellen har internalisert den. Forening måles vanligvis som en del av cellebærerinkubasjonseksperimenter. Historisk har assosiasjon blitt rapportert enten i vilkårlige fluorescerende enheter (typisk "median fluorescensintensitet" eller MFI) eller som "prosentforening", beregninger hvis begrensninger tidligere har blitt diskutert6. Kort sagt, disse målingene er ikke sammenlignbare mellom eksperimenter, laboratorier og legemiddelbærere på grunn av forskjeller i eksperimentelle protokoller, flowcytometerinnstillinger og merkingsintensitetene til forskjellige bærere. Det er gjort anstrengelser for å overvinne førstnevnte ved å kalibrere cytometeret, og dermed konvertere det relative målet for MFI til et absolutt kvantitativt mål for fluorescens7. Denne metoden tar imidlertid ikke hensyn til variabiliteten i merkingsintensiteten til forskjellige bærere, og tillater dermed ikke den rasjonelle sammenligningen av ulike bærerprestasjoner i en målcelle av valg8.
Her demonstreres hvordan man praktisk talt konverterer fra relative, vilkårlige fluorescerende enheter til den absolutte kvantitative metriske av "antall bærere per celle" ved å utføre et lite antall ytterligere karakteriseringseksperimenter. Hvis en annen beregning av bærerkonsentrasjon er ønsket (f.eks. Bærermasse per celle eller bærervolum per celle), er det enkelt å konvertere fra bærere per celle, forutsatt at bærerkarakterisering er gjort. For korthet og for å unngå sjargong, brukes ordet "bærer" i dette arbeidet for å referere til det store utvalget av legemiddelleveringskonstruksjoner. Disse kvantifiseringsteknikkene er like anvendelige, enten de brukes på en nanokonstruert gullpartikkel eller en biokonstruert bakterie.
Noen få fakta muliggjør konvertering fra vilkårlige fluorescerende enheter til bærere per celle. For det første er den målte fluorescensintensiteten proporsjonal med konsentrasjonen av en fluorofor9 (eller en fluorescerende merket bærer), forutsatt at fluorescensen er innenfor instrumentets deteksjonsgrenser og instrumenteringsinnstillingene er de samme. Således, hvis fluorescensen til en bærer og fluorescensen til en prøve er kjent, kan man bestemme hvor mange bærere som er tilstede i den prøven hvis alle målingene ble utført under de samme innstillingene og forholdene. Imidlertid, spesielt for mindre bærere, kan det ikke være mulig å måle bærerfluorescens, celle autofluorescens og celle-assosiert-med-bærere fluorescens på samme instrument med de samme innstillingene. I dette tilfellet er det et annet krav for å gjøre det mulig å konvertere mellom målt fluorescens på ett instrument og målt fluorescens på et annet. For å gjøre dette kan en standardkurve for fluoroforkonsentrasjon etableres for å måle fluorescensintensiteten på begge instrumentene, og dra nytte av molekylene av ekvivalent løselig fluorokrom (MESF) standard9. Dette tillater deretter måling av bærerfluorescensen i bulk på et ikke-cytometer, en måling som kan gjøres på bærere av enhver størrelse eller egenskap. Når slik bulkkvantifisering gjøres på en bærersuspensjon av kjent konsentrasjon, kan antall bærere per celle i en prøve igjen beregnes.
Selv om dette arbeidet demonstrerer prosessen for måling av bærerassosiasjon (som bestemt av målt fluorescensintensitet), kan en analog protokoll utføres for andre målinger av cellebærerinteraksjon (f.eks. En eksperimentell protokoll som skiller internaliserte og membranbundne bærere). I tillegg ville denne protokollen i stor grad være den samme hvis foreningen ble målt gjennom en ikke-fluorescerende analyse (for eksempel gjennom massecytometri).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20347</td>
			<td>pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apogee A50 Microflow</td>
			<td>Apogee</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>Tecan Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td>Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum MESF kits Alexa Fluor 647</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>647</td>
			<td>Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation

En viktig komponent i utformingen av legemiddelleveringssystemer gjelder hvordan man forsterker eller demper interaksjoner med bestemte celletyper. For eksempel kan en kjemoterapeutisk bli funksjonalisert med et antistoff for å forbedre bindingen til kreftceller ("målretting") eller funksjonalisert med polyetylenglykol for å unngå immuncellegjenkjenning ("stealth"). Selv på mobilnivå er optimalisering av binding og opptak av en legemiddelbærer et komplekst biologisk designproblem. Dermed er det verdifullt å skille hvor sterkt en ny bærer interagerer med en celle fra den funksjonelle effekten av en transportørs last når den er levert til den cellen.
For å fortsette det kjemoterapeutiske eksemplet, "hvor godt det binder seg til en kreftcelle" er et eget problem fra "hvor godt det dreper en kreftcelle". Kvantitative in vitro-analyser for sistnevnte er veletablerte og er vanligvis avhengige av å måle levedyktighet. Imidlertid er mest publisert forskning på cellebærerinteraksjoner kvalitativ eller semikvantitativ. Vanligvis er disse målingene avhengige av fluorescerende merking av bæreren og rapporterer følgelig interaksjoner med celler i relative eller vilkårlige enheter. Dette arbeidet kan imidlertid standardiseres og gjøres helt kvantitativt med et lite antall karakteriseringseksperimenter. Slik absolutt kvantifisering er verdifull, da det letter rasjonelle, inter- og intra-klasse sammenligninger av ulike legemiddelleveringssystemer-nanopartikler, mikropartikler, virus, antistoff-legemiddelkonjugater, konstruerte terapeutiske celler eller ekstracellulære vesikler.
Videre er kvantifisering en forutsetning for senere metaanalyser eller i silikomodelleringsmetoder . I denne artikkelen presenteres videoguider, samt et beslutningstre for hvordan man oppnår in vitro-kvantifisering for bærermedisinleveringssystemer, som tar hensyn til forskjeller i bærerstørrelse og merkingsmodalitet. I tillegg drøftes ytterligere vurderinger for kvantitativ vurdering av avanserte legemiddelleveringssystemer. Dette er ment å tjene som en verdifull ressurs for å forbedre rasjonell evaluering og design for neste generasjon medisin.

Som diskutert tidligere, krever forskjellige legemiddelbærertyper bruk av forskjellige teknikker for absolutt kvantifisering av cellebærerassosiasjon. For eksempel er 633 nm disulfidstabilisert poly (metakrylsyre) (PMASH) kjerneskallpartikler store og tette nok til deteksjon ved bruk av et følsomt flowcytometer. Som sådan ble disse partiklene merket fluorescerende, deretter inngjerdet og talt ved hjelp av sidevinklet lysspredning (SALS, analog med SSC), samt riktig fluorescerende kanal (<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

En arbeidsflyt er demonstrert for absolutt kvantifisering av legemiddelbærer-celleinteraksjoner ved bruk av flowcytometri for å muliggjøre bedre rasjonell evaluering av nye legemiddelleveringssystemer. Denne arbeidsflyten gjelder for legemiddelbærere av alle typer.

Eksperimentell kvantifisering av interaksjoner mellom legemiddelleveringssystemer og celler in vitro: En veiledning for preklinisk nanomedisinevaluering

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Denne protokollen gir kvantitative data om hvordan bærersystemer samhandler med celler. Kvantitative data er nøkkelen til prosjektering og optimalisering. Det tillater oss å bevege oss fra ja eller nei biologiske spørsmål, til hvor mye spørsmål.Denne teknikken er nyttig for å konvertere resultater fra preklinisk legemiddelbærerytelse, som var kvalitative, til kvantitative resultater. Og dette fungerer selv når du karakteriserer bæreren din på et annet system enn du karakteriserer cellene dine. Det kan ta noen iterasjoner for å finne den optimale bærerfortynningen som faller innenfor de lineære eller kvantitative områdene på nanosiden.Ta deg god tid til å finne de rette forholdene. For å begynne, monter strømningscellen på lasermodulen. Skyll sakte strømningscellen med en hastighet på 0, 1 milliliter per sekund med en milliliter destillert vann.Hvis det dannes bobler i strømningscellen, trekker du suspensjonen delvis inn for å slå sammen boblen med luft-væskegrensesnittet før du fortsetter. Lås deretter hele lasermodulen på plass inne i instrumentet. Start kameraet omtrent halvveis i spylingen.Sørg for å bekrefte at bærerens rusk er vasket ut. Velg opptak for å åpne opptaksinnstillingsfanen og klikk start kamera. Kjør systemet med en milliliter luft.Hvis noen statiske bærere er synlige på skjermen, rengjør du flytcellen i henhold til produsentens instruksjoner. Forbered bærerne for nanopartikkelsporingsanalyse, ved å sikre at bærerne er godt suspendert via sonikering eller vortexing, avhengig av bæresystemet som er involvert. Fortynn bærerne i vann for å forberede minst 0, 6 til en milliliter av hver prøve med en bærerkonsentrasjon mellom 1x10 til syvende og 1x10 til niende bærere per milliliter.Ta ut lasermodulen og plasser den oppreist. Slipp den første bæreprøven i en milliliter sprøyte og fest sprøyten til rørinnløpet. Last deretter prøven forsiktig inn i strømningscellen.Hvis det dannes bobler i strømningscellen, trekker du suspensjonen delvis tilbake for å fusjonere boblen med luft-væske-grensesnittet før du fortsetter. Forsikre deg om at hele strømningscellen er fylt med væske, og sett deretter lastingen på pause. Juster kamerafokuset om nødvendig for å visualisere individuelle operatører.Gjør grove fokusjusteringer med den roterende knappen på høyre side av instrumentet. Gjør finere justeringer ved å velge kategorien maskinvare. Endre fokus ved å justere skyvekontrollen for fokus.For å sikre at det ikke er overmetning, velg det optimale kameranivået ved å justere glidebryteren i opptaksfanen. Hvis instrumentet er utstyrt med dette tilbehøret, legger du sprøyten som inneholder bæreprøven i sprøytepumpen. Under SOP-fanen velger du standardmåling for å ta fem bilder på 30 sekunder hver.Skriv inn basisfilnavn, og legg om ønskelig til ytterligere eksempelinformasjon ved å klikke på avansert-knappen som åpner en modal dialog med forskjellige valg. Trykk på opprett og kjør skript og vent til en popup vises, og be om å gå videre med prøven. Hvis du bruker sprøytepumpen, velger du maskinvarefliken og deretter sprøytepumpefliken.Still inn ønsket infusjonshastighet og trykk infuse. Hvis du ikke bruker sprøytepumpen, må du avansere prøven manuelt. I popup-vinduet velger du OK for å begynne å fange.Etter at hver av de fem opptakene, når den avanserte prøven dukker opp igjen, må du kontrollere at prøven fortsatt beveger seg gjennom flytcellen. Velg deretter OK for å fortsette med neste opptak. I prosessfanen justerer du glidebryteren for deteksjonsterskel mellom fire og åtte for å identifisere forskjellige bærere som er synlige på skjermen på riktig måte.Du kan justere skjermforsterkningen for å hjelpe visualisering, det vil ikke påvirke nedstrømsanalysen. I popup-vinduet trykker du på OK for å starte sporingsanalyse. Overvåk analysefremdriften ved å klikke på analysen i kategorien enkeltanalyse.Når analysen er ferdig, kan du se etter en ledetekst for eksportinnstillinger. Bekreft at det er merket av for inkluder PDF-fil og inkluder eksperimentsammendrag. Velg eventuelle andre eksportformater etter ønske.I resultatdelen av PDF-dataeksporten, for å sikre at konsentrasjonen som måles er pålitelig, må du kontrollere at den målte bærerkonsentrasjonen er mellom 1x10 og den syvende og 1x10 til den niende bæreren per milliliter og se etter feilmeldinger eller forsiktighetsmeldinger under konsentrasjonsmålingsresultatet. Gjenta prosedyren to eller flere ganger med forskjellige fortynninger fra bestanden, og sørg for at konsentrasjonen av hver prøve faller innenfor instrumentets lineære område. Beregn lagerbærerkonsentrasjonen som beskrevet i tekstmanuskriptet.Klargjør den frie eller antistoffkonjugerte fluorokromoppløsningen som beskrevet i tekstmanuskriptet. Beregn konsentrasjonen av stamløsningen fra konsentrasjonen, molekylvekten og Avogadros tall som vist i ligningen. Utfør deretter en seriell fortynning av fargestoffet i bærerfortynningsmidlet for å generere standardkurveprøver.Legg deretter bæreprøven til måleplaten og mål fluorescens ved hjelp av en mikroplateleser. Generer standardkurven som beskrevet i tekstmanuskriptet. Beregn den absolutte fluorescensintensiteten per bærer ved å dele bulkfluorescensen med bærerkonsentrasjonen.Sett opp flowcytometeret for det endelige bærercelleeksperimentet ved å bestemme optimale PMT-spenningsinnstillinger i de relevante kanalene. Kjør en negativ kontrollprøve der cellene ikke inkuberes med bærere for å bestemme bakgrunnsfluorescensen. Forbered og suspender flowcytometri-kvantifiseringsperlene på nytt.Bruk samme buffer som brukes for celleprøvene. Hvis perlepopulasjonene leveres separat, trekk dem sammen. Kjør flowcytometri-kvantifiseringsperlen og bærercelleprøvene for å bestemme fluorescensintensiteten per celle.Kjør flowcytometer-kvantifiseringsperlene for å generere en standardkurve, og konverter den absolutte fluorescerende intensiteten til MFI. Bruk dette til å beregne transportørenes teoretiske MFI som beskrevet i tekstmanuskriptet. Kjør cellebærerprøvene for å bestemme fluorescerende intensitet per celle i hver prøve.Til slutt beregner du antall bærere per celle for hver prøve ved å trekke bakgrunnsfluorescensen fra den målte fluorescensen til prøven, og deretter dele med fluorescensen per partikkel. For 633 nanometer polymetakrylsyrekjerneskallpartikler var konsentrasjonen og fluorescerende intensitet per bærer direkte kvantifiserbar ved bruk av cytometerstrømmen. I motsetning til dette var 100 nanometer superparamagnetiske jernoksid nanopartikler for små til å oppdage individuelt og ble analysert ved hjelp av bulkstrømmen.Merkede kvantifiseringsperler ble brukt på flere dager for å generere standardkurver på et flowcytometer. Korrelasjonen mellom den målte MFI- og MESF-verdien av kvantifiseringsperlene var lineær og stort sett lik mellom de målte datoene. Tidsforløpseksperimenter ved bruk av fluorescerende merkede HeLa-celler med 235 nanometer polymetakrylsyrekapsler fra null til 24 timer viste en økning i MFI over tid, noe som indikerer at kapslene var assosiert med HeLa-celler.Forskjellen i den tilsynelatende cellulære responsen til bærere var sterk, avhengig av relativ eller absolutt kvantifisering. Den absolutte kvantifiseringen var uavhengig av merkeintensitet og dermed mer sammenlignbar. Disse teknikkene er grunnlaget for dypere analyse og sammenligning av partikkelytelse.Vi er glade for å bruke disse teknikkene til å parameterisere matematiske modeller som vil tillate oss å karakterisere partikkelytelse uavhengig av et bestemt eksperiment.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modeller og metoder for å vurdere transport av Drug Delivery Systems Across Cellular Barrierer

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Tilpasning av electro prosess for å gi tre unike miljøer for en Tri-lag<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Sandwich-lignende microenvironments å utnytte Cell / Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Syntese av Functionalized 10-nm Polymer-belagt gull partikler for endotelet målretting og narkotika-leveranser

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Omfattende evaluering av effektiviteten og sikkerheten til morkaken målrettede narkotika-leveranser med tre komplementære metoder

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Bruk av høy gjennomstrømming automatisert Microbioreactor System for produksjon av modellen IgG1 i CHO celler

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Rensing og analyse av en monoklonale antistoff fra kinesisk hamster eggstokk celler ved hjelp av en automatisert Microbioreactor system

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

En kvantitativ fluorescens mikroskopi-basert enkelt liposome-analyse for registrering av Inhomogeneity mellom individuelle liposomer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primær avklaring av CHO Harvested Cell Culture Fluid ved hjelp av en akustisk separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...