Name: experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC; Subsídio do Programa No. GNT1149990), o Centro Australiano de Pesquisa em Virologia de HIV e Hepatite (ACH2), bem como um presente do espólio de Réjane Louise Langlois. F.C. reconhece a concessão de uma Bolsa de Pesquisa Principal Sênior do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (NHMRC) (GNT1135806). A Figura 1 e a Figura 2 foram criadas com BioRender.com.

1. Escolhendo o fluxo apropriado
<ol><li>Siga a árvore de decisão descrita na Figura 1 para determinar o melhor fluxo de trabalho (fluxo) (Figura 2) para a configuração experimental usada. Consulte a discussão para mais comentários sobre essa escolha de fluxo.</li>
	<li>Se seguir o fluxo do citômetro, continue com as etapas 2.1.1-2.2.7. Se estiver seguindo o Bulk Stream, continue com as etapas 3.1.1.1-3.1.5.7.</li>
</ol><p class="jove_c...

<ol>
	<li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+ORgan+Targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR/Cas+gene+editing.">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+mRNA+vaccines:+A+biotech+and+industrial+perspective.">The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective.</a> npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).</li><li>Press, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo-carrier+interactions+significantly+contribute+to+micellar+conformation+and+biodistribution.">Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution.</a> NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).</li><li>Cevaal, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+T+cell-targeting+nanoparticle+drug+delivery+systems:+Considerations+for+rational+design.">In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design.</a> ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).</li><li>Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-nano+science:+Better+metrics+would+accelerate+progress.">Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress.</a> Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).</li><li>Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+level+of+nanoparticle+uptake+in+mammalian+cells+using+flow+cytometry.">Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry.</a> Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).</li><li>Lozano-Andr&#233;s, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+MESF-bead+based+assignment+of+absolute+fluorescence+values+to+nanoparticles+and+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Schwartz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalization+of+the+MESF+unit+of+fluorescence+intensity.">Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cell-particle+association+in+vitro:+A+quantitative+method+to+compare+particle+performance.">Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance.</a> Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Comfort, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+tracking+analysis+for+the+quantification+and+size+determination+of+extracellular+vesicles.">Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+particle+imaging+for+quantification+of+nano-+and+microparticles.">Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles.</a> Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+Towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISD3:+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems.">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).</li><li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions.">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).</li><li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density.">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature.">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li></ol>

Caracterizar as interações entre portadores de drogas e células está se tornando cada vez mais importante no desenvolvimento de novos sistemas de liberação de medicamentos. Especificamente, para permitir a avaliação racional e a comparação de vários construtos de portadores, a quantificação absoluta do desempenho do referido portador para interagir com células-alvo e fora do alvo é fundamental. Este protocolo descreve uma metodologia de dois fluxos que permite a qualquer pesquisador que trabalhe com um por...

O design de construções de entrega de medicamentos que exibem um comportamento específico e projetado, dependendo do tipo de célula que encontram, atraiu um interesse substancial da pesquisa. Potenciais construções de liberação de medicamentos ou "transportadores" incluem formulações lipídicas, inorgânicos nano-cultivados, conjuntos poliméricos, vesículas extracelulares, células bacterianas funcionalizadas ou vírus modificados. Todos estes podem apresentar especificidade de órgãos, tecidos ou células devido a propriedades físicas, propriedades de superfície ou funcionalizações químicas modificadas, como a fixação de anticorpos 1,2.
Um passo quase onipresente na avaliação do transportador in vitro é incubar células com uma suspensão contendo o referido transportador carregado de drogas. Após a incubação, o desempenho do transportador é medido por meio de uma leitura funcional do desempenho da carga do medicamento, por exemplo, eficiência ou toxicidade da transfecção. As leituras funcionais são úteis, pois são uma medida a jusante da eficácia da transportadora. No entanto, para construções de liberação de medicamentos mais complexas, é cada vez mais importante ir além das leituras funcionais e quantificar separadamente o grau de interação do transportador com a célula de interesse. Existem algumas razões para isso.
Primeiro, há um interesse crescente em descobrir (e melhorar iterativamente) tecnologias de transportadoras de "plataforma", que podem transportar uma variedade de cargas. Por exemplo, nanopartículas lipídicas (LNPs) projetadas para encapsular RNA podem trocar uma sequência de RNA por outra com poucas ressalvas3. Assim, para melhorar iterativamente a tecnologia da transportadora, é fundamental quantificar seu desempenho independentemente da funcionalidade da carga. Em segundo lugar, as leituras funcionais podem não ser simples para a carga de interesse, comprometendo a capacidade de iterar e avaliar rapidamente as formulações da transportadora. Embora se possa realizar a otimização in vitro usando uma carga modelo com uma leitura funcional direta (por exemplo, fluorescência), a alteração da carga pode alterar a resposta biológica a um transportador4 e, portanto, não produzir resultados representativos. Em terceiro lugar, muitos portadores são projetados para interagir e ser absorvidos por um tipo específico de célula. Essa capacidade de segmentação de um transportador pode e deve ser diferenciada do desempenho da sua segmentação terapêutica de postos de carga. Para continuar o exemplo do LNP, uma carga de RNA pode ser extremamente potente, mas se o LNP for incapaz de se ligar à célula, ser internalizado e liberar o RNA, nenhum efeito funcional a jusante será observado. Isso pode ser um problema particularmente para portadores destinados a atingir tipos de células difíceis de transfectar, como as células T5. Por outro lado, um LNP poderia atingir de forma extremamente eficaz, mas a carga de RNA pode não funcionar. Um ensaio a jusante que mede apenas a funcionalidade da carga não será capaz de diferenciar entre essas duas situações, complicando assim o desenvolvimento e a otimização dos sistemas de entrega de medicamentos transportadores.
Neste trabalho, discute-se como quantificar absolutamente a associação de operadores. Associação é um termo que se refere ao grau de interação medido experimentalmente entre um portador e uma célula. A associação não diferencia entre ligação à membrana e internalização – um transportador pode estar associado porque está ligado à superfície celular ou porque a célula o internalizou. A associação é comumente medida como parte de experimentos de incubação de portadores de células. Historicamente, a associação tem sido relatada em unidades fluorescentes arbitrárias (tipicamente "intensidade de fluorescência mediana" ou MFI) ou como "associação percentual", métricas cujas limitações foram discutidas anteriormente6. Em suma, essas medições não são comparáveis entre experimentos, laboratórios e portadores de medicamentos devido a diferenças nos protocolos experimentais, configurações de citômetros de fluxo e intensidades de marcação de diferentes portadores. Esforços têm sido feitos para superar o primeiro calibrando o citômetro, convertendo assim a medida relativa da IFM em uma medida absolutamente quantitativa de fluorescência7. No entanto, esse método não leva em conta a variabilidade na intensidade de marcação de vários portadores e, portanto, não permite a comparação racional de vários desempenhos de portadores em uma célula-alvo de escolha8.
Aqui, como converter praticamente de unidades fluorescentes arbitrárias relativas para a métrica quantitativa absoluta do "número de portadores por célula" é demonstrado pela realização de um pequeno número de experimentos de caracterização adicionais. Se outra métrica de concentração de transportador for desejada (por exemplo, massa de transportador por célula ou volume de transportador por célula), é simples converter de portadores por célula, desde que a caracterização do transportador tenha sido feita. Para brevidade e para evitar jargões, a palavra "portador" é usada neste trabalho para se referir à vasta variedade de construções de entrega de drogas. Essas técnicas de quantificação são igualmente aplicáveis, sejam aplicadas a uma partícula de ouro nano-modificada ou a uma bactéria de bioengenharia.
Alguns fatos permitem a conversão de unidades fluorescentes arbitrárias em portadores por célula. Primeiro, a intensidade de fluorescência medida é proporcional à concentração de um fluoróforo9 (ou um transportador marcado fluorescentemente), assumindo que a fluorescência está dentro dos limites de detecção do instrumento e as configurações de instrumentação são as mesmas. Assim, se a fluorescência de um transportador e a fluorescência de uma amostra são conhecidas, pode-se determinar quantos portadores estão presentes nessa amostra se todas as medições foram realizadas sob as mesmas configurações e condições. No entanto, especialmente para portadores menores, pode não ser possível medir a fluorescência do portador, a autofluorescência celular e a fluorescência associada à célula com portadores no mesmo instrumento com as mesmas configurações. Neste caso, há um segundo requisito para tornar possível a conversão entre a fluorescência medida em um instrumento e a fluorescência medida em outro. Para tanto, uma curva padrão de concentração de fluoróforo pode ser estabelecida para medir a intensidade de fluorescência em ambos os instrumentos, aproveitandoo padrão 9 de Moléculas de Fluorocromo Solúvel Equivalente (MESF). Isso permite a medição da fluorescência do transportador em massa em um não-citômetro, uma medição que pode ser feita em portadores de qualquer tamanho ou característica. Quando essa quantificação a granel é feita numa suspensão transportadora de concentração conhecida, o número de transportadores por célula de uma amostra pode, uma vez mais, ser calculado.
Embora este trabalho demonstre o processo de medição da associação do transportador (determinado pela intensidade de fluorescência medida), um protocolo análogo poderia ser realizado para outras medidas de interação célula-portador (por exemplo, um protocolo experimental que diferencia portadores internalizados e ligados à membrana). Além disso, este protocolo seria em grande parte o mesmo se a associação fosse medida através de um ensaio não fluorescente (por exemplo, através de citometria de massa).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20347</td>
			<td>pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apogee A50 Microflow</td>
			<td>Apogee</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>Tecan Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td>Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum MESF kits Alexa Fluor 647</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>647</td>
			<td>Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation

Um componente importante do projeto de sistemas de liberação de medicamentos diz respeito a como amplificar ou atenuar as interações com tipos específicos de células. Por exemplo, um quimioterápico pode ser funcionalizado com um anticorpo para melhorar a ligação às células cancerosas ("direcionamento") ou funcionalizado com polietilenoglicol para ajudar a evitar o reconhecimento de células imunes ("stealth"). Mesmo em um nível celular, otimizar a ligação e a absorção de um portador de medicamentos é um problema complexo de design biológico. Assim, é valioso separar o quão fortemente um novo transportador interage com uma célula da eficácia funcional da carga de uma transportadora uma vez entregue a essa célula.
Para continuar o exemplo quimioterápico, "quão bem ele se liga a uma célula cancerosa" é um problema separado de "quão bem ele mata uma célula cancerosa". Os ensaios quantitativos in vitro para estes últimos estão bem estabelecidos e geralmente dependem da medição da viabilidade. No entanto, a maioria das pesquisas publicadas sobre interações célula-portador é qualitativa ou semiquantitativa. Geralmente, essas medições dependem da marcação fluorescente do portador e, consequentemente, relatam interações com células em unidades relativas ou arbitrárias. No entanto, este trabalho pode ser padronizado e ser feito absolutamente quantitativo com um pequeno número de experimentos de caracterização. Essa quantificação absoluta é valiosa, pois facilita comparações racionais, inter e intraclasse de vários sistemas de liberação de drogas - nanopartículas, micropartículas, vírus, conjugados anticorpo-droga, células terapêuticas modificadas ou vesículas extracelulares.
Além disso, a quantificação é um pré-requisito para meta-análises subsequentes ou abordagens de modelagem in silico . Neste artigo, são apresentados guias em vídeo, bem como uma árvore de decisão sobre como alcançar a quantificação in vitro para sistemas de liberação de medicamentos transportadores, que levam em conta diferenças no tamanho do transportador e na modalidade de rotulagem. Além disso, outras considerações para a avaliação quantitativa de sistemas avançados de liberação de medicamentos são discutidas. Pretende-se que isso sirva como um recurso valioso para melhorar a avaliação racional e o design para a próxima geração de medicamentos.

Como discutido anteriormente, diferentes tipos de portadores de drogas requerem o uso de diferentes técnicas para a quantificação absoluta da associação célula-portador. Por exemplo, as partículas de núcleo-casca de poli(ácido metacrílico) estabilizadas com dissulfeto de 633 nm (PMASH) são grandes e densas o suficiente para detecção usando um citômetro de fluxo sensível. Dessa forma, essas partículas foram marcadas fluorescentemente, depois fechadas e contadas por meio de espalhamento de luz de...

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Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Um fluxo de trabalho é demonstrado para a quantificação absoluta das interações fármaco-célula transportadora usando citometria de fluxo para permitir uma melhor avaliação racional de novos sistemas de liberação de medicamentos. Este fluxo de trabalho é aplicável a portadores de medicamentos de qualquer tipo.

Quantificação Experimental de Interações entre Sistemas de Liberação de Medicamentos e Células In Vitro: Um Guia para Avaliação Pré-Clínica de Nanomedicina

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Este protocolo fornece dados quantitativos sobre como os sistemas portadores interagem com as células. Dados quantitativos são fundamentais para engenharia e otimização. Permite-nos passar de questões biológicas sim ou não, para quantas perguntas.Essa técnica é útil para converter resultados do desempenho pré-clínico do portador de medicamentos, que foram qualitativos, em resultados quantitativos. E isso funciona mesmo quando você caracteriza seu portador em um sistema diferente do que você caracteriza suas células. Pode levar algumas iterações para encontrar a diluição ideal do transportador que se enquadra nas faixas lineares ou quantitativas do lado nano.Leve o seu tempo para encontrar as condições certas. Para começar, monte a célula de fluxo no módulo laser. Lave lentamente a célula de fluxo à taxa de 0,1 mililitro por segundo com um mililitro de água destilada.Se as bolhas se formarem dentro da célula de fluxo, retraia parcialmente a suspensão para fundir a bolha com a interface ar-líquido antes de prosseguir. Em seguida, trave todo o módulo laser no lugar dentro do instrumento. Inicie a câmera aproximadamente na metade do caminho através da descarga.Certifique-se de confirmar que os detritos da transportadora estão lavados. Selecione capturar para abrir a guia Configurações de captura e clique em Iniciar câmera. Acione o sistema com um mililitro de ar.Se algum portador estático estiver visível na tela, limpe a célula de fluxo de acordo com as instruções do fabricante. Prepare os portadores para a análise de rastreamento de nanopartículas, garantindo que os portadores estejam bem suspensos via sonicação ou vórtice, dependendo do sistema de suporte envolvido. Diluir os transportadores em água para preparar pelo menos 0,6 a um mililitro de cada amostra com uma concentração de transportador entre 1x10 ao sétimo e 1x10 ao nono carretriz por mililitro.Retire o módulo laser e coloque-o na posição vertical. Solte a primeira amostra transportadora numa seringa de um mililitro e prenda a seringa à entrada do tubo. Em seguida, carregue cuidadosamente a amostra na célula de fluxo.Se as bolhas se formarem dentro da célula de fluxo, retraia a suspensão parcialmente para fundir a bolha com a interface ar-líquido antes de prosseguir. Certifique-se de que toda a célula de fluxo esteja cheia de líquido e, em seguida, pause o carregamento. Ajuste o foco da câmera, se necessário, para visualizar suportes individuais.Faça ajustes grosseiros de foco com o botão rotativo no lado direito do instrumento. Faça ajustes mais finos selecionando a guia hardware. Altere o foco ajustando o controle deslizante de foco.Para garantir que não haja saturação excessiva, selecione o nível de câmera ideal ajustando o controle deslizante na guia de captura. Se o instrumento estiver equipado com este acessório, carregue a seringa que contém a amostra transportadora na bomba da seringa. Na guia POP, selecione a medição padrão para fazer cinco capturas de 30 segundos cada.Digite o nome do arquivo base e, se desejar, adicione informações de amostra adicionais clicando no botão avançado que abrirá uma diálogo modal com várias opções. Pressione criar e executar script e aguarde até que um pop-up apareça pedindo para adiantar a amostra. Se estiver a utilizar a bomba da seringa, selecione o separador hardware e, em seguida, o separador da bomba da seringa.Defina a taxa de perfusão desejada e prima a perfusão. Se não estiver a utilizar a bomba da seringa, avance manualmente a amostra. Na janela pop-up, selecione OK para iniciar a captura.Após cada uma das cinco capturas, quando o pop-up de amostra avançada reaparecer, verifique se a amostra ainda está se movendo pela célula de fluxo. Em seguida, selecione OK para prosseguir com a próxima captura. Na guia Processo, ajuste o controle deslizante de limite de detecção entre quatro e oito para identificar corretamente portadores distintos visíveis na tela.Você pode ajustar o ganho da tela para ajudar a visualização, isso não afetará a análise a jusante. No pop-up, pressione OK para iniciar a análise de rastreamento. Monitore o progresso da análise clicando na análise em uma única guia de análise.Quando a análise estiver concluída, procure um prompt de configurações de exportação para aparecer. Confirme se a opção incluir PDF e incluir resumo do experimento está selecionada. Selecione quaisquer outros formatos de exportação conforme desejado.Na seção de resultados da exportação de dados em PDF, para garantir que a concentração medida seja confiável, verifique se a concentração do transportador medido está entre 1x10 para o sétimo e 1x10 para o nono portador por mililitro e verifique se há mensagens de erro ou mensagens de cautela abaixo do resultado da medição de concentração. Repetir o procedimento duas ou mais vezes com diluições diferentes da unidade populacional e assegurar que a concentração de cada amostra se situe dentro do intervalo linear do instrumento. Calcule a concentração de estoque de portadores conforme descrito no manuscrito do texto.Preparar a solução de fluorocromo conjugada livre ou de anticorpos conforme descrito no manuscrito do texto. Calcular a concentração da solução-mãe a partir da concentração, do peso molecular e do número de Avogadro, conforme indicado na equação. Em seguida, execute uma diluição em série do corante no diluente transportador para gerar amostras de curva padrão.Em seguida, adicione a amostra transportadora à placa de medição e meça a fluorescência usando um leitor de microplacas. Gere a curva padrão conforme descrito no manuscrito do texto. Calcular a intensidade absoluta de fluorescência por transportador dividindo a fluorescência a granel pela concentração do portador.Configure o citômetro de fluxo para o experimento final da célula portadora determinando as configurações ideais de tensão PMT nos canais relevantes. Execute uma amostra de controle negativo onde as células não são incubadas com portadores para determinar a fluorescência de fundo. Preparar e ressuspender as esferas de quantificação da citometria de fluxo.Use o mesmo buffer usado para as amostras de célula. Se as populações de contas forem fornecidas separadamente, junte-as. Execute o grânulo de quantificação da citometria de fluxo e as amostras de células transportadoras para determinar a intensidade de fluorescência por célula.Execute os grânulos de quantificação do citômetro de fluxo para gerar uma curva padrão, convertendo a intensidade fluorescente absoluta em IFM. Use isso para calcular a IFM teórica dos portadores conforme descrito no manuscrito do texto. Execute as amostras portadoras de células para determinar a intensidade fluorescente por célula de cada amostra.Finalmente, calcule o número de portadores por célula para cada amostra subtraindo a fluorescência de fundo da fluorescência medida da amostra e, em seguida, dividindo pela fluorescência por partícula. Para 633 nanômetros de partículas da casca do núcleo de ácido polimetacrílico, a concentração e a intensidade fluorescente por transportadora foram diretamente quantificáveis usando o fluxo do citômetro. Em contraste, as nanopartículas de óxido de ferro super paramagnético de 100 nanômetros eram muito pequenas para serem detectadas individualmente e foram analisadas usando o fluxo a granel.As esferas de quantificação marcadas foram usadas em vários dias para gerar curvas padrão em um citômetro de fluxo. A correlação entre a IFM medida e o valor MESF das contas de quantificação foi linear e amplamente semelhante entre as datas medidas. Experimentos de curso de tempo usando células HeLa fluorescentes marcadas com cápsulas de ácido polimetacrílico de 235 nanômetros de zero a 24 horas mostraram um aumento na IFM ao longo do tempo, indicando que as cápsulas estavam se associando com células HeLa.A diferença na resposta celular aparente aos portadores foi gritante, dependendo da quantificação relativa ou absoluta. A quantificação absoluta foi independente da intensidade da marcação e, portanto, mais comparável. Essas técnicas são a base para uma análise mais profunda e comparação do desempenho das partículas.Estamos entusiasmados com o uso dessas técnicas para parametrizar modelos matemáticos que nos permitirão caracterizar o desempenho das partículas independentemente de qualquer experimento em particular.

Research

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Adaptação do Processo Electrospinning para fornecer três ambientes únicos para um Tri-camadas<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da parede das vias aéreas

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Microambientes sanduíche-como aproveitarar Telemóveis / interações materiais

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Síntese de funcionalizados 10 nm polímero-revestida com partículas de ouro para o direcionamento do endotélio e entrega da droga

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Avaliação global da eficácia e segurança de entrega de droga Placenta-alvo usando três métodos complementares

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Uso do elevado-Throughput Microbioreactor sistema automatizado para produção de IgG1 modelo em células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Purificação e análise de um anticorpo monoclonal de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Um ensaio de liposcopia única baseado em microscopia quantitativa para detectar a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Esclarecimento Primário do Fluido de Cultura Celular Colhida cho usando um separador acústico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...