Name: experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Эта работа была поддержана Австралийским национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC; Программный грант No GNT1149990), Австралийский центр исследований вирусологии ВИЧ и гепатита (ACH2), а также подарок от имения Режан Луизы Ланглуа. F.C. признает награду Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) Старшей главной исследовательской стипендии (GNT1135806). Рисунки 1 и 2 были созданы с помощью BioRender.com.

1. Выбор подходящего потока
<ol><li>Следуйте дереву решений, показанному на рисунке 1 , чтобы определить лучший рабочий процесс (поток) (рисунок 2) для используемой экспериментальной установки. Обратитесь к обсуждению для дальнейших комментариев по...

<ol>
	<li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+ORgan+Targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR/Cas+gene+editing.">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+mRNA+vaccines:+A+biotech+and+industrial+perspective.">The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective.</a> npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).</li><li>Press, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo-carrier+interactions+significantly+contribute+to+micellar+conformation+and+biodistribution.">Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution.</a> NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).</li><li>Cevaal, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+T+cell-targeting+nanoparticle+drug+delivery+systems:+Considerations+for+rational+design.">In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design.</a> ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).</li><li>Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-nano+science:+Better+metrics+would+accelerate+progress.">Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress.</a> Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).</li><li>Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+level+of+nanoparticle+uptake+in+mammalian+cells+using+flow+cytometry.">Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry.</a> Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).</li><li>Lozano-Andr&#233;s, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+MESF-bead+based+assignment+of+absolute+fluorescence+values+to+nanoparticles+and+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Schwartz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalization+of+the+MESF+unit+of+fluorescence+intensity.">Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cell-particle+association+in+vitro:+A+quantitative+method+to+compare+particle+performance.">Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance.</a> Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Comfort, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+tracking+analysis+for+the+quantification+and+size+determination+of+extracellular+vesicles.">Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+particle+imaging+for+quantification+of+nano-+and+microparticles.">Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles.</a> Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+Towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISD3:+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems.">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).</li><li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions.">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).</li><li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density.">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature.">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li></ol>

Характеристика взаимодействий между носителями лекарств и клетками становится все более важной в разработке новых систем доставки лекарств. В частности, чтобы обеспечить рациональную оценку и сравнение различных конструкций носителей, абсолютная количественная оценка производител...

Дизайн конструкций доставки лекарств, которые демонстрируют специфическое, спроектированное поведение в зависимости от того, с каким типом клеток они сталкиваются, привлек значительный исследовательский интерес. Потенциальные конструкции доставки лекарств или «носители» включают липидные составы, нано-выращенные неорганические вещества, полимерные сборки, внеклеточные везикулы, функционализированные бактериальные клетки или модифицированные вирусы. Все они могут проявлять специфичность органов, тканей или клеток из-за физических свойств, свойств поверхности или инженерных химических функционализаций, таких как присоединение антител 1,2.
Почти вездесущим шагом в оценке носителей in vitro является инкубация клеток с суспензией, содержащей указанный носитель, нагруженный лекарственными средствами. После инкубации производительность носителя измеряется с помощью функционального считывания характеристик лекарственного груза, например, эффективности трансфекции или токсичности. Функциональные показания полезны, поскольку они являются последующим показателем эффективности носителя. Однако для более сложных конструкций доставки лекарств становится все более важным выйти за рамки функциональных показаний и отдельно количественно оценить степень взаимодействия носителя с интересующей клеткой. Для этого есть несколько причин.
Во-первых, растет интерес к открытию (и итеративному совершенствованию) «платформенных» технологий перевозчика, которые могут перевозить различные грузы. Например, липидные наночастицы (LNP), предназначенные для инкапсуляции РНК, могут обменивать одну последовательность РНК на другую с несколькими оговорками3. Таким образом, чтобы итеративно улучшить технологию перевозчика, крайне важно количественно оценить ее производительность независимо от функциональности груза. Во-вторых, функциональные показания могут быть непростыми для интересующего груза, что ставит под угрозу способность быстро итерировать и оценивать составы носителей. В то время как можно выполнить оптимизацию in vitro с использованием модельного груза с простым функциональным считыванием (например, флуоресценцией), изменение груза может изменить биологическую реакцию на носитель4 и, таким образом, может не дать репрезентативных результатов. В-третьих, многие носители предназначены для взаимодействия и поглощения определенным типом клеток. Такая способность носителя к наведению может и должна быть дифференцирована от выполнения его терапевтического наведения на грузовой пост. Чтобы продолжить пример LNP, груз РНК может быть чрезвычайно мощным, но если LNP не может связываться с клеткой, быть интернализованным и высвобождать РНК, никакого последующего функционального эффекта не будет наблюдаться. Это может быть проблемой, особенно для носителей, предназначенных для нацеливания на труднотрансфецируемые типы клеток, такие как Т-клетки5. И наоборот, LNP может нацеливаться чрезвычайно эффективно, но груз РНК может не функционировать. Последующий анализ, который просто измеряет функциональность груза, не сможет различить эти две ситуации, что усложнит разработку и оптимизацию систем доставки лекарств перевозчиком.
В этой работе обсуждается вопрос о том, как абсолютно количественно оценить ассоциацию носителей. Ассоциация — это термин, который относится к экспериментально измеренной степени взаимодействия между носителем и клеткой. Ассоциация не дифференцирует мембранное связывание и интернализацию - носитель может быть связан, потому что он связан с поверхностью клетки или потому, что клетка усвоила его. Ассоциация обычно измеряется как часть экспериментов по инкубации клеточных носителей. Исторически сложилось так, что ассоциация была зарегистрирована либо в произвольных флуоресцентных единицах (обычно «средняя интенсивность флуоресценции» или MFI), либо как «процентная ассоциация», метрики, ограничения которых ранее обсуждались6. Короче говоря, эти измерения не сопоставимы между экспериментами, лабораториями и носителями лекарств из-за различий в экспериментальных протоколах, настройках проточного цитометра и интенсивности маркировки различных носителей. Были предприняты усилия по преодолению первого путем калибровки цитометра, тем самым преобразуя относительную меру МФО в абсолютно количественную меру флуоресценции7. Однако этот метод не учитывает изменчивость интенсивности маркировки различных носителей и, таким образом, не позволяет проводить рациональное сравнение различных характеристик носителей в целевой ячейке выбора8.
Здесь показано, как практически преобразовать относительные, произвольные флуоресцентные единицы в абсолютную количественную метрику «числа носителей на клетку», выполнив небольшое количество дополнительных экспериментов по характеризации. Если требуется другая метрика концентрации носителя (например, масса носителя на ячейку или объем носителя на ячейку), ее легко преобразовать из носителей на ячейку, при условии, что была сделана характеристика носителя. Для краткости и во избежание жаргона слово «носитель» используется в этой работе для обозначения обширного ассортимента конструкций доставки лекарств. Эти методы количественной оценки одинаково применимы, независимо от того, применяются ли они к наноинженерной частице золота или биоинженерным бактериям.
Несколько фактов позволяют преобразовать произвольные флуоресцентные единицы в носители на ячейку. Во-первых, измеренная интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации флуорофора9 (или флуоресцентно меченого носителя), при условии, что флуоресценция находится в пределах обнаружения прибора, а настройки прибора одинаковы. Таким образом, если флуоресценция носителя и флуоресценция образца известны, можно определить, сколько носителей присутствует в этом образце, если все измерения были выполнены в одних и тех же условиях. Однако, особенно для небольших носителей, может оказаться невозможным измерить флуоресценцию носителей, автофлуоресценцию клеток и флуоресценцию, связанную с клетками-носителями, на одном приборе с теми же настройками. В этом случае существует второе требование, позволяющее осуществлять преобразование между измеренной флуоресценцией на одном приборе и измеренной флуоресценцией на другом. Для этого может быть установлена стандартная кривая концентрации флуорофора для измерения интенсивности флуоресценции на обоих приборах, используя преимущества стандарта9 «Молекулы эквивалентного растворимого фторхрома» (MESF). Это позволяет измерять флуоресценцию носителя навалом навалом на нецитометре, измерение, которое может быть выполнено на носителях любого размера или характеристики. Когда такая количественная оценка навалом производится на суспензии носителя известной концентрации, количество носителей на ячейку образца может быть вновь рассчитано.
Хотя эта работа демонстрирует процесс измерения ассоциации носителей (определяемой измеренной интенсивностью флуоресценции), аналогичный протокол может быть выполнен для других измерений взаимодействия между клетками и носителями (например, экспериментальный протокол, который дифференцирует интернализованные и мембранно-связанные носители). Кроме того, этот протокол был бы в значительной степени таким же, если бы ассоциация измерялась с помощью нефлуоресцентного анализа (например, с помощью массовой цитометрии).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20347</td>
			<td>pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apogee A50 Microflow</td>
			<td>Apogee</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>Tecan Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td>Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum MESF kits Alexa Fluor 647</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>647</td>
			<td>Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation

Основной компонент разработки систем доставки лекарств касается того, как усиливать или ослаблять взаимодействия с конкретными типами клеток. Например, химиотерапевтический препарат может быть функционализирован антителом для усиления связывания с раковыми клетками («нацеливание») или функционализирован полиэтиленгликолем, чтобы помочь избежать распознавания иммунных клеток («скрытность»). Даже на клеточном уровне оптимизация связывания и поглощения лекарственного носителя является сложной проблемой биологического дизайна. Таким образом, важно отделить то, насколько сильно новый носитель взаимодействует с клеткой, от функциональной эффективности груза перевозчика после доставки в эту ячейку.
Продолжая химиотерапевтический пример, «насколько хорошо он связывается с раковой клеткой» является отдельной проблемой от «насколько хорошо он убивает раковую клетку». Количественные анализы in vitro для последних хорошо известны и обычно полагаются на измерение жизнеспособности. Тем не менее, большинство опубликованных исследований по взаимодействиям между клетками и носителями являются качественными или полуколичественными. Как правило, эти измерения основаны на флуоресцентной маркировке носителя и, следовательно, сообщают о взаимодействиях с клетками в относительных или произвольных единицах. Однако эта работа может быть стандартизирована и сделана абсолютно количественной с небольшим количеством экспериментов по характеристике. Такая абсолютная количественная оценка ценна, поскольку она облегчает рациональное, меж- и внутриклассовое сравнение различных систем доставки лекарств - наночастиц, микрочастиц, вирусов, конъюгатов антитело-лекарство, инженерных терапевтических клеток или внеклеточных везикул.
Кроме того, количественная оценка является предпосылкой для последующих мета-анализов или подходов к моделированию in silico . В этой статье представлены видеоруководства, а также дерево решений о том, как достичь количественной оценки in vitro для систем доставки лекарств-носителей, которые учитывают различия в размере носителя и способе маркировки. Кроме того, обсуждаются дополнительные соображения по количественной оценке передовых систем доставки лекарств. Это призвано служить ценным ресурсом для улучшения рациональной оценки и проектирования для следующего поколения медицины.

Как обсуждалось ранее, различные типы носителей лекарств требуют использования различных методов для абсолютной количественной оценки ассоциации клеточных носителей. Например, 633 нм дисульфид-стабилизированные частицы поли(метакриловой кислоты) (PMASH) ядра-оболочки являются бол...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Продемонстрирован рабочий процесс для абсолютной количественной оценки взаимодействий между лекарственными средствами и клетками-носителями с использованием проточной цитометрии, чтобы обеспечить лучшую рациональную оценку новых систем доставки лекарств. Этот рабочий процесс применим к носителям лекарств любого типа.

Экспериментальная количественная оценка взаимодействий между системами доставки лекарств и клетками in vitro: руководство по доклинической наномедицинской оценке

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Этот протокол предоставляет количественные данные о том, как системы-носители взаимодействуют с клетками. Количественные данные являются ключевыми для проектирования и оптимизации. Это позволяет нам перейти от биологических вопросов «да» или «нет» к тому, сколько вопросов.Этот метод полезен для преобразования результатов доклинических показателей носителей лекарств, которые были качественными, в количественные результаты. И это работает, даже когда вы характеризуете своего носителя в другой системе, чем вы характеризуете свои клетки. Может потребоваться несколько итераций, чтобы найти оптимальное разбавление носителей, которые попадают в линейные или количественные диапазоны нано-стороны.Не торопитесь, чтобы найти правильные условия. Для начала установите проточную ячейку на лазерный модуль. Медленно промывайте проточную ячейку со скоростью 0,1 миллилитра в секунду одним миллилитром дистиллированной воды.Если пузырьки образуются внутри проточной ячейки, частично втяните суспензию, чтобы объединить пузырь с интерфейсом воздух-жидкость, прежде чем продолжить. Затем зафиксируйте весь лазерный модуль на месте внутри прибора. Запустите камеру примерно на полпути через промывку.Обязательно подтвердите, что мусор носителя вымыт. Выберите захват, чтобы открыть вкладку настроек захвата, и нажмите кнопку Запустить камеру. Привод системы с помощью одного миллилитра воздуха.Если на экране видны статические носители, очистите проточную ячейку в соответствии с инструкциями производителя. Подготовьте носители к анализу отслеживания наночастиц, убедившись, что носители хорошо подвешены с помощью ультразвука или вихря, в зависимости от задействованной системы носителей. Разбавляют носители в воде для получения по меньшей мере от 0,6 до одного миллилитра каждого образца с концентрацией носителя от 1x10 до седьмого и от 1x10 до девятого носителя на миллилитр.Выньте лазерный модуль и поместите его в вертикальное положение. Опустите первый образец носителя в шприц на один миллилитр и прикрепите шприц к входному отверстию трубки. Затем осторожно загрузите образец в проточную ячейку.Если пузырьки образуются внутри проточной ячейки, частично втяните суспензию, чтобы объединить пузырь с интерфейсом воздух-жидкость, прежде чем продолжить. Убедитесь, что вся проточная ячейка заполнена жидкостью, затем приостановите загрузку. Отрегулируйте фокусировку камеры, если это необходимо, чтобы визуализировать отдельные носители.Выполняйте грубые настройки фокусировки с помощью вращающейся ручки с правой стороны инструмента. Внесите более точные изменения, выбрав вкладку оборудование. Измените фокус, отрегулировав ползунок фокусировки.Чтобы убедиться в отсутствии перенасыщения, выберите оптимальный уровень камеры, отрегулировав ползунок на вкладке захвата. Если прибор оснащен этим аксессуаром, загрузите шприц, содержащий образец носителя, в шприцевой насос. На вкладке СОП выберите стандартное измерение, чтобы сделать пять снимков по 30 секунд каждый.Введите имя базового файла и при желании добавьте дополнительную информацию о примере, нажав кнопку «Дополнительно», которая откроет модальный диалог с различными вариантами. Нажмите создать и запустить сценарий и подождите, пока появится всплывающее окно с просьбой предоставить пример. Если используется шприцевой насос, выберите вкладку оборудования, а затем вкладку шприцевого насоса.Установите нужную скорость инфузии и настаивайте на прессе. Если не используется шприцевой насос, вручную продвиньте образец. Во всплывающем окне нажмите кнопку ОК, чтобы начать запись.После каждого из пяти захватов, когда снова появится расширенный образец, убедитесь, что образец все еще движется через проточную ячейку. Затем нажмите кнопку ОК, чтобы продолжить следующий захват. На вкладке «Процесс» настройте ползунок порога обнаружения между четырьмя и восемью, чтобы правильно определить различные носители, видимые на экране.Вы можете настроить усиление экрана, чтобы облегчить визуализацию, это не повлияет на последующий анализ. Во всплывающем окне нажмите ok, чтобы начать анализ отслеживания. Следите за ходом анализа, нажав на анализ в одной вкладке анализа.После завершения анализа найдите запрос на экспорт настроек. Убедитесь, что выбран параметр Включить PDF и включить сводку эксперимента. Выберите любые другие форматы экспорта по желанию.В разделе результатов экспорта данных в формате PDF для обеспечения надежности измеренной концентрации убедитесь, что измеренная концентрация носителя составляет от 1x10 до седьмого и от 1x10 до девятого носителя на миллилитр, и проверьте наличие любых сообщений об ошибках или сообщений с предупреждением под результатом измерения концентрации. Повторите процедуру два или более раз с различными разбавлениями из запаса и убедитесь, что концентрация каждого образца попадает в линейный диапазон прибора. Рассчитайте концентрацию носителей запаса, как описано в тексте рукописи.Готовят свободный или конъюгированный раствор фторхрома со свободным или антителом, как описано в тексте рукописи. Рассчитайте концентрацию исходного раствора из концентрации, молекулярной массы и числа Авогадро, как показано в уравнении. Затем выполняют последовательное разбавление красителя в разбавителе носителя для получения стандартных образцов кривой.Затем добавьте образец носителя на измерительную пластину и измерьте флуоресценцию с помощью считывателя микропластин. Сгенерируйте стандартную кривую, как описано в текстовой рукописи. Рассчитать абсолютную интенсивность флуоресценции на носитель путем деления объемной флуоресценции на концентрацию носителя.Настройте проточный цитометр для окончательного эксперимента с несущей ячейкой, определив оптимальные настройки напряжения PMT в соответствующих каналах. Запустите отрицательный контрольный образец, где клетки не инкубируются с носителями, чтобы определить фоновую флуоресценцию. Подготовьте и повторно приостановите шарики количественного определения проточной цитометрии.Используйте тот же буфер, что и для образцов ячеек. Если популяции бусин предоставляются отдельно, соберите их вместе. Запустите шарик количественного определения проточной цитометрии и образцы клеток-носителей, чтобы определить интенсивность флуоресценции на клетку.Запустите шарики количественного определения проточного цитометра для создания стандартной кривой, преобразующей абсолютную интенсивность флуоресценции в MFI. Используйте это для расчета теоретической МФО носителей, как описано в тексте рукописи. Запустите образцы клеточных носителей, чтобы определить интенсивность флуоресценции на клетку каждого образца.Наконец, рассчитайте количество носителей на ячейку для каждого образца, вычитая фоновую флуоресценцию из измеренной флуоресценции образца, а затем деление на флуоресценцию на частицу. Для частиц ядра полиметакриловой кислоты длиной 633 нанометра концентрация и интенсивность флуоресценции на носитель поддавались непосредственной количественной оценке с использованием потока цитометра. Напротив, 100-нанометровые суперпарамагнитные наночастицы оксида железа были слишком малы для индивидуального обнаружения и анализировались с использованием объемного потока.Маркированные бусины количественного определения использовались в течение нескольких дней для генерации стандартных кривых на проточном цитометре. Корреляция между измеренной МФО и значением MESF бусин количественного определения была линейной и в целом аналогичной между измеренными датами. Эксперименты с использованием флуоресцентных меченых клеток HeLa с капсулами полиметакриловой кислоты 235 нанометров от нуля до 24 часов показали увеличение MFI с течением времени, что указывает на то, что капсулы ассоциировались с клетками HeLa.Разница в кажущемся клеточном ответе на носителей была резкой, в зависимости от относительной или абсолютной количественной оценки. Абсолютная количественная оценка не зависела от интенсивности маркировки и, следовательно, была более сопоставимой. Эти методы являются основой для более глубокого анализа и сравнения характеристик частиц.Мы рады использовать эти методы для параметризации математических моделей, которые позволят нам охарактеризовать производительность частиц независимо от какого-либо конкретного эксперимента.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Модели и методы для оценки Перевозка системам по наркотикам Доставка по клеточные барьеры

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Адаптация процесса электропрядения чтобы обеспечить три уникальных условиях для Tri-слоистые<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель дыхательных путях стены

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Сэндвич-как микросреды, чтобы использовать Cell / Материал взаимодействий

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Синтез функционализированных 10-Нм полимерным покрытием частиц золота для ориентации эндотелия и доставки лекарств

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Всеобъемлющая оценка эффективности и безопасности препарата плаценты целевой доставки с помощью трех взаимодополняющих методов

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Использование высокопроизводительного автоматизированная система Microbioreactor для производства модель IgG1 в клетках Чо

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Очистка и аналитика моноклонального антитела от китайских яичников хомяка с помощью автоматизированной системы микробиореактора

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Количественная флуоресценция на основе однолипосомы анализ для обнаружения композиционной неоднородности между отдельными липосомы

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Первичное осветление cho Harvested Cell Culture Fluid с помощью акустического сепаратора

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...