Name: experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional Australiano de Salud e Investigación Médica (NHMRC; Subvención del programa No. GNT1149990), el Centro Australiano para la Investigación de Virología del VIH y la Hepatitis (ACH2), así como un regalo del patrimonio de Réjane Louise Langlois. F.C. reconoce la concesión de una beca de investigación principal del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC) (GNT1135806). La Figura 1 y la Figura 2 se crearon con BioRender.com.

1. Elegir la transmisión adecuada
<ol><li>Siga el árbol de decisión descrito en la Figura 1 para determinar el mejor flujo de trabajo (flujo) (Figura 2) para la configuración experimental utilizada. Consulte la discusión para obtener más comentarios sobre esta elección de corriente.</li>
	<li>Si sigue el flujo del citómetro, continúe con los pasos 2.1.1-2.2.7. Si sigue la transmisión masiva, continúe con los pasos 3.1.1.1-3.1.5.7.</...

<ol>
	<li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+ORgan+Targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR/Cas+gene+editing.">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+mRNA+vaccines:+A+biotech+and+industrial+perspective.">The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective.</a> npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).</li><li>Press, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo-carrier+interactions+significantly+contribute+to+micellar+conformation+and+biodistribution.">Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution.</a> NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).</li><li>Cevaal, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+T+cell-targeting+nanoparticle+drug+delivery+systems:+Considerations+for+rational+design.">In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design.</a> ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).</li><li>Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-nano+science:+Better+metrics+would+accelerate+progress.">Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress.</a> Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).</li><li>Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+level+of+nanoparticle+uptake+in+mammalian+cells+using+flow+cytometry.">Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry.</a> Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).</li><li>Lozano-Andr&#233;s, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+MESF-bead+based+assignment+of+absolute+fluorescence+values+to+nanoparticles+and+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Schwartz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalization+of+the+MESF+unit+of+fluorescence+intensity.">Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cell-particle+association+in+vitro:+A+quantitative+method+to+compare+particle+performance.">Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance.</a> Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Comfort, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+tracking+analysis+for+the+quantification+and+size+determination+of+extracellular+vesicles.">Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+particle+imaging+for+quantification+of+nano-+and+microparticles.">Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles.</a> Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+Towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISD3:+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems.">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).</li><li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions.">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).</li><li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density.">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature.">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li></ol>

La caracterización de las interacciones entre los portadores de fármacos y las células es cada vez más importante en el desarrollo de nuevos sistemas de administración de fármacos. Específicamente, para permitir la evaluación racional y la comparación de varias construcciones de portadores, la cuantificación absoluta del rendimiento de dicho portador para interactuar con las células objetivo y fuera del objetivo es crítica. Este protocolo describe una metodología de dos flujos que permite a cualquier investi...

El diseño de construcciones de administración de fármacos que exhiben un comportamiento específico y diseñado dependiendo del tipo de célula que encuentren ha atraído un interés sustancial de la investigación. Las posibles construcciones o "portadores" de administración de fármacos incluyen formulaciones lipídicas, inorgánicos nanocultivados, ensamblajes poliméricos, vesículas extracelulares, células bacterianas funcionalizadas o virus modificados. Todos estos pueden exhibir especificidad de órganos, tejidos o células debido a propiedades físicas, propiedades de superficie o funcionalizaciones químicas diseñadas como la unión de anticuerpos 1,2.
Un paso casi omnipresente en la evaluación in vitro de portadores es incubar células con una suspensión que contenga dicho portador cargado de fármaco. Después de la incubación, el rendimiento del transportista se mide a través de una lectura funcional del rendimiento de la carga de drogas, por ejemplo, la eficiencia de la transfección o la toxicidad. Las lecturas funcionales son útiles, ya que son una medida posterior de la efectividad del operador. Sin embargo, para construcciones de administración de fármacos más complejas, es cada vez más importante ir más allá de las lecturas funcionales y cuantificar por separado el grado de interacción del portador con la célula de interés. Hay algunas razones para esto.
En primer lugar, existe un creciente interés en descubrir (y mejorar iterativamente) tecnologías de transporte de "plataforma", que pueden transportar una variedad de carga. Por ejemplo, las nanopartículas lipídicas (LNP) diseñadas para encapsular ARN pueden intercambiar una secuencia de ARN por otra con pocas advertencias3. Por lo tanto, para mejorar iterativamente la tecnología del transportista, es fundamental cuantificar su rendimiento independientemente de la funcionalidad de la carga. En segundo lugar, las lecturas funcionales pueden no ser sencillas para la carga de interés, comprometiendo la capacidad de iterar y evaluar rápidamente las formulaciones de los portadores. Si bien se podría realizar una optimización in vitro utilizando una carga modelo con una lectura funcional directa (por ejemplo, fluorescencia), cambiar la carga puede cambiar la respuesta biológica a un transportista4 y, por lo tanto, puede no producir resultados representativos. En tercer lugar, muchos portadores están diseñados para interactuar y ser absorbidos por un tipo de célula específico. Esa capacidad de fijación de objetivos de un transportista puede y debe diferenciarse del rendimiento de su carga terapéutica posterior a la focalización. Para continuar con el ejemplo de LNP, una carga de ARN podría ser extremadamente potente, pero si la LNP no puede unirse a la célula, ser internalizada y liberar el ARN, no se observará ningún efecto funcional aguas abajo. Esto puede ser un problema particularmente para los portadores destinados a atacar tipos de células difíciles de transfectar, como las células T5. Por el contrario, un LNP podría apuntar de manera extremadamente efectiva, pero la carga de ARN podría no funcionar. Un ensayo posterior que solo mide la funcionalidad de la carga no podrá diferenciar entre estas dos situaciones, lo que complicará el desarrollo y la optimización de los sistemas de administración de medicamentos portadores.
En este trabajo, se discute cómo cuantificar absolutamente la asociación de portadores. Asociación es un término que se refiere al grado de interacción medido experimentalmente entre un portador y una célula. La asociación no diferencia entre la unión a la membrana y la internalización: un portador puede estar asociado porque está unido a la superficie celular o porque la célula lo ha internalizado. La asociación se mide comúnmente como parte de los experimentos de incubación de portadores celulares. Históricamente, la asociación ha sido reportada ya sea en unidades fluorescentes arbitrarias (típicamente "intensidad de fluorescencia mediana" o MFI) o como "asociación porcentual", métricas cuyas limitaciones han sido discutidas previamente6. En resumen, estas mediciones no son comparables entre experimentos, laboratorios y portadores de fármacos debido a las diferencias en los protocolos experimentales, la configuración del citómetro de flujo y las intensidades de etiquetado de diferentes portadores. Se han hecho esfuerzos para superar el primero calibrando el citómetro, convirtiendo así la medida relativa de MFI en una medida absolutamente cuantitativa de fluorescencia7. Sin embargo, este método no tiene en cuenta la variabilidad en la intensidad del etiquetado de varios portadores y, por lo tanto, no permite la comparación racional de varios rendimientos de portadores en una celda objetivo de elección8.
Aquí, cómo convertir prácticamente de unidades fluorescentes relativas y arbitrarias a la métrica cuantitativa absoluta del "número de portadores por célula" se demuestra realizando un pequeño número de experimentos de caracterización adicionales. Si se desea otra métrica de concentración de portador (por ejemplo, masa portadora por celda o volumen portador por celda), es fácil convertir de portadores por celda, siempre que se haya realizado la caracterización del portador. Para abreviar y evitar la jerga, la palabra "portador" se usa dentro de este trabajo para referirse a la amplia variedad de construcciones de administración de medicamentos. Estas técnicas de cuantificación son igualmente aplicables, ya sea que se apliquen a una partícula de oro de nanoingeniería o a una bacteria de bioingeniería.
Algunos hechos permiten la conversión de unidades fluorescentes arbitrarias a portadores por célula. Primero, la intensidad de fluorescencia medida es proporcional a la concentración de un fluoróforo9 (o un portador marcado con fluorescencia), suponiendo que la fluorescencia está dentro de los límites de detección del instrumento y los ajustes de instrumentación son los mismos. Por lo tanto, si se conocen la fluorescencia de un portador y la fluorescencia de una muestra, se puede determinar cuántos portadores están presentes en esa muestra si todas las mediciones se realizaron bajo los mismos ajustes y condiciones. Sin embargo, especialmente para portadores más pequeños, puede que no sea posible medir la fluorescencia del portador, la autofluorescencia celular y la fluorescencia asociada a la célula con portadores en el mismo instrumento con la misma configuración. En este caso, existe un segundo requisito para que sea posible convertir entre la fluorescencia medida en un instrumento y la fluorescencia medida en otro. Para ello, se puede establecer una curva estándar de concentración de fluoróforos para medir la intensidad de fluorescencia en ambos instrumentos, aprovechandoel estándar 9 de Moléculas de fluorocromo soluble equivalente (MESF). Esto permite la medición de la fluorescencia del portador a granel en un no citómetro, una medición que se puede hacer en portadores de cualquier tamaño o característica. Cuando dicha cuantificación a granel se realiza en una suspensión portadora de concentración conocida, se puede calcular una vez más el número de portadores por celda de una muestra.
Si bien este trabajo demuestra el proceso para medir la asociación de portadores (según lo determinado por la intensidad de fluorescencia medida), se podría realizar un protocolo análogo para otras medidas de interacción célula-portador (por ejemplo, un protocolo experimental que diferencie los portadores internalizados y unidos a la membrana). Además, este protocolo sería en gran medida el mismo si la asociación se midiera a través de un ensayo no fluorescente (por ejemplo, a través de citometría de masas).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20347</td>
			<td>pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apogee A50 Microflow</td>
			<td>Apogee</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>Tecan Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td>Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum MESF kits Alexa Fluor 647</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>647</td>
			<td>Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation

Un componente importante del diseño de sistemas de administración de fármacos se refiere a cómo amplificar o atenuar las interacciones con tipos específicos de células. Por ejemplo, un quimioterapéutico podría funcionalizarse con un anticuerpo para mejorar la unión a las células cancerosas ("dirigido") o funcionalizarse con polietilenglicol para ayudar a evadir el reconocimiento de células inmunes ("sigilo"). Incluso a nivel celular, optimizar la unión y la absorción de un portador de fármacos es un problema complejo de diseño biológico. Por lo tanto, es valioso separar la fuerza con la que un nuevo portador interactúa con una célula de la eficacia funcional de la carga de un transportista una vez entregada a esa célula.
Para continuar con el ejemplo quimioterapéutico, "qué tan bien se une a una célula cancerosa" es un problema separado de "qué tan bien mata una célula cancerosa". Los ensayos cuantitativos in vitro para estos últimos están bien establecidos y generalmente se basan en la medición de la viabilidad. Sin embargo, la mayoría de las investigaciones publicadas sobre las interacciones célula-portador son cualitativas o semicuantitativas. En general, estas mediciones se basan en el etiquetado fluorescente del portador y, en consecuencia, informan interacciones con las células en unidades relativas o arbitrarias. Sin embargo, este trabajo puede estandarizarse y hacerse absolutamente cuantitativo con un pequeño número de experimentos de caracterización. Tal cuantificación absoluta es valiosa, ya que facilita las comparaciones racionales, inter e intraclase de varios sistemas de administración de fármacos: nanopartículas, micropartículas, virus, conjugados anticuerpo-fármaco, células terapéuticas diseñadas o vesículas extracelulares.
Además, la cuantificación es un requisito previo para los metanálisis posteriores o los enfoques de modelado in silico . En este artículo, se presentan videoguías, así como un árbol de decisión sobre cómo lograr la cuantificación in vitro para los sistemas de administración de medicamentos portadores, que tienen en cuenta las diferencias en el tamaño del portador y la modalidad de etiquetado. Además, se discuten otras consideraciones para la evaluación cuantitativa de los sistemas avanzados de administración de fármacos. Esto pretende servir como un recurso valioso para mejorar la evaluación racional y el diseño para la próxima generación de medicamentos.

Como se discutió anteriormente, los diferentes tipos de portadores de fármacos requieren el uso de diferentes técnicas para la cuantificación absoluta de la asociación célula-portador. Por ejemplo, las partículas de núcleo de poli(ácido metacrílico) estabilizado con disulfuro (PMASH) de 633 nm son lo suficientemente grandes y densas para su detección con un citómetro de flujo sensible. Como tal, estas partículas se marcaron fluorescentemente, luego se cerraron y se contaron utilizando la dispersi?...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Se demuestra un flujo de trabajo para la cuantificación absoluta de las interacciones fármaco-célula portadora utilizando citometría de flujo para permitir una mejor evaluación racional de nuevos sistemas de administración de fármacos. Este flujo de trabajo es aplicable a portadores de medicamentos de cualquier tipo.

Cuantificación experimental de las interacciones entre los sistemas de administración de fármacos y las células in vitro: una guía para la evaluación preclínica de nanomedicina

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Este protocolo proporciona datos cuantitativos sobre cómo los sistemas portadores interactúan con las células. Los datos cuantitativos son clave para la ingeniería y la optimización. Nos permite pasar de preguntas biológicas de sí o no, a cuántas preguntas.Esta técnica es útil para convertir los resultados del rendimiento preclínico del portador del fármaco, que fueron cualitativos, en resultados cuantitativos. Y esto funciona incluso cuando caracterizas a tu portador en un sistema diferente al que caracterizas tus células. Puede tomar algunas iteraciones encontrar la dilución portadora óptima que caiga dentro de los rangos lineales o cuantitativos del lado nano.Tómese su tiempo para encontrar las condiciones adecuadas. Para comenzar, monte la celda de flujo en el módulo láser. Enjuague lentamente la celda de flujo a una velocidad de 0.1 mililitros por segundo con un mililitro de agua destilada.Si se forman burbujas dentro de la celda de flujo, retraiga parcialmente la suspensión para fusionar la burbuja con la interfaz aire-líquido antes de continuar. Luego bloquee todo el módulo láser en su lugar dentro del instrumento. Inicie la cámara aproximadamente a la mitad del enjuague.Asegúrese de confirmar que los residuos del portador se hayan lavado. Seleccione captura para abrir la pestaña Configuración de captura y haga clic en iniciar cámara. Impulse el sistema con un mililitro de aire.Si hay portadores estáticos visibles en la pantalla, limpie la celda de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Prepare los portadores para el análisis de seguimiento de nanopartículas, asegurándose de que los portadores estén bien suspendidos mediante sonicación o vórtice, dependiendo del sistema portador involucrado. Diluir los portadores en agua para preparar al menos 0.6 a un mililitro de cada muestra con una concentración de portador entre 1x10 a la séptima y 1x10 a la novena portadora por mililitro.Saque el módulo láser y colóquelo en posición vertical. Coloque la primera muestra portadora en una jeringa de un mililitro y conecte la jeringa a la entrada del tubo. Luego cargue cuidadosamente la muestra en la celda de flujo.Si se forman burbujas dentro de la celda de flujo, retraiga la suspensión parcialmente para fusionar la burbuja con la interfaz aire-líquido antes de continuar. Asegúrese de que toda la celda de flujo esté llena de líquido, luego detenga la carga. Ajuste el enfoque de la cámara si es necesario para visualizar portadores individuales.Realice ajustes de enfoque grueso con la perilla giratoria en el lado derecho del instrumento. Realice ajustes más finos seleccionando la pestaña de hardware. Cambie el enfoque ajustando el control deslizante de enfoque.Para asegurarse de que no haya sobresaturación, seleccione el nivel óptimo de la cámara ajustando el control deslizante dentro de la pestaña de captura. Si el instrumento está equipado con este accesorio, cargue la jeringa que contiene la muestra portadora en la bomba de la jeringa. En la pestaña SOP, seleccione la medición estándar para realizar cinco capturas de 30 segundos cada una.Ingrese el nombre del archivo base y, si lo desea, agregue información de muestra adicional haciendo clic en el botón avanzado que abrirá un diálogo modal con varias opciones. Presione crear y ejecutar script y espere a que aparezca una ventana emergente que le pida que avance la muestra. Si utiliza la bomba de jeringa, seleccione la pestaña de hardware y, a continuación, la pestaña de bomba de jeringa.Ajuste la velocidad de infusión deseada y presione la infusión. Si no está utilizando la bomba de jeringa, avance manualmente la muestra. En la ventana emergente, seleccione Aceptar para comenzar a capturar.Después de cada una de las cinco capturas, cuando vuelva a aparecer la muestra avanzada por favor, compruebe que la muestra sigue moviéndose a través de la celda de flujo. A continuación, seleccione Aceptar para continuar con la siguiente captura. En la pestaña de proceso, ajuste el control deslizante del umbral de detección entre cuatro y ocho para identificar correctamente los distintos portadores visibles en la pantalla.Puede ajustar la ganancia de la pantalla para ayudar a la visualización, no afectará el análisis posterior. En la ventana emergente, presione OK para iniciar el análisis de seguimiento. Supervise el progreso del análisis haciendo clic en el análisis en la pestaña de análisis único.Una vez finalizado el análisis, busque que aparezca un mensaje de configuración de exportación. Confirme que la opción incluir PDF e incluir resumen del experimento está seleccionada. Seleccione cualquier otro formato de exportación que desee.En la sección de resultados de la exportación de datos PDF, para asegurarse de que la concentración medida es fiable, verifique que la concentración portadora medida esté entre 1x10 a la séptima y 1x10 a la novena portadora por mililitro y compruebe si hay mensajes de error o mensajes de precaución debajo del resultado de la medición de concentración. Repita el procedimiento dos o más veces con diferentes diluciones de la cepa, y asegúrese de que la concentración de cada muestra caiga dentro del rango lineal del instrumento. Calcule la concentración de portadores de existencias como se describe en el texto manuscrito.Prepare la solución de fluorocromo libre o conjugada con anticuerpos como se describe en el texto manuscrito. Calcule la concentración de la solución madre a partir de la concentración, el peso molecular y el número de Avogadro como se muestra en la ecuación. Luego realice una dilución en serie del tinte en el diluyente portador para generar muestras de curva estándar.Luego agregue la muestra portadora a la placa de medición y mida la fluorescencia usando un lector de microplacas. Genere la curva estándar como se describe en el texto manuscrito. Calcule la intensidad absoluta de fluorescencia por portador dividiendo la fluorescencia a granel por la concentración de portador.Configure el citómetro de flujo para el experimento final de la celda portadora determinando los ajustes óptimos de voltaje PMT en los canales relevantes. Ejecute una muestra de control negativo donde las células no se incuben con portadores para determinar la fluorescencia de fondo. Preparar y volver a suspender las perlas de cuantificación de citometría de flujo.Utilice el mismo búfer que se utiliza para las muestras de células. Si las poblaciones de cuentas se proporcionan por separado, juntelas juntas. Ejecute el cordón de cuantificación de citometría de flujo y las muestras de células portadoras para determinar la intensidad de fluorescencia por célula.Ejecute las perlas de cuantificación del citómetro de flujo para generar una curva estándar, convirtiendo la intensidad fluorescente absoluta en MFI. Utilice esto para calcular la IMF teórica de los portadores como se describe en el texto manuscrito. Ejecute las muestras de portadores celulares para determinar la intensidad fluorescente por celda de cada muestra.Finalmente, calcule el número de portadores por celda para cada muestra restando la fluorescencia de fondo de la fluorescencia medida de la muestra y luego dividiendo por la fluorescencia por partícula. Para partículas de núcleo de ácido polimetacrílico de 633 nanómetros, la concentración y la intensidad fluorescente por portador se cuantificaron directamente utilizando la corriente del citómetro. En contraste, las nanopartículas de óxido de hierro súper paramagnético de 100 nanómetros eran demasiado pequeñas para detectarlas individualmente y se analizaron utilizando la corriente a granel.Las perlas de cuantificación etiquetadas se utilizaron en varios días para generar curvas estándar en un citómetro de flujo. La correlación entre la IMF medida y el valor MESF de las perlas de cuantificación fue lineal y ampliamente similar entre las fechas medidas. Los experimentos de curso de tiempo utilizando células HeLa marcadas con fluorescencia con cápsulas de ácido polimetacrílico de 235 nanómetros de cero a 24 horas mostraron un aumento en la MFI con el tiempo, lo que indica que las cápsulas se asociaban con células HeLa.La diferencia en la respuesta celular aparente a los portadores fue marcada, dependiendo de la cuantificación relativa o absoluta. La cuantificación absoluta fue independiente de la intensidad del etiquetado y, por lo tanto, más comparable. Estas técnicas son la base para un análisis más profundo y una comparación del rendimiento de las partículas.Estamos entusiasmados con el uso de estas técnicas para parametrizar modelos matemáticos que nos permitirán caracterizar el rendimiento de las partículas independientemente de cualquier experimento en particular.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modelos y métodos para evaluar el transporte de Drug Delivery Systems a través de barreras celulares

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Investigación

Bioingeniería

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adaptación del Proceso Electrohilado para proporcionar tres ambientes únicos para un Tri-capa<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la pared de la vía aérea

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Microentornos-Sandwich como para aprovechar Celulares / Materiales Interacciones

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Síntesis de funcionalizados 10 nm recubierto de polímero partículas de oro para apuntar el endotelio y el suministro de medicamentos

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Evaluación integral de la efectividad y seguridad de la entrega de drogas orientada a Placenta utilizando tres métodos complementarios

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Microbioreactor uso de alto rendimiento automático para la producción de IgG1 modelo en células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Purificación y análisis de un anticuerpo monoclonal de células de ovario de hámster chino utilizando un sistema automatizado de microbiorreactores

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Un ensayo de liposomio único basado en microscopía de fluorescencia cuantitativa para detectar la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Clarificación primaria del fluido de cultivo celular cosechado con CHO utilizando un separador acústico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...