Name: experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC; Programbidrag nr GNT1149990), Australian Center for HIV and Hepatitis Virology Research (ACH2), samt en gåva från Réjane Louise Langlois dödsbo. F.C. erkänner utmärkelsen av ett National Health and Medical Research Council (NHMRC) Senior Principal Research Fellowship (GNT1135806). Figur 1 och figur 2 skapades med BioRender.com.

1. Välja lämplig ström
<ol><li>Följ beslutsträdet som beskrivs i bild 1 för att fastställa det bästa arbetsflödet (ström) (bild 2) för den experimentella konfiguration som används. Se diskussionen för ytterligare kommentarer om detta val av ström.</li>
	<li>Om du följer cytometerströmmen fortsätter du med steg 2.1.1-2.2.7. Om du följer massströmmen fortsätter du med stegen 3.1.1.1–3.1.5.7.</li>
</ol><p class="jove_content...

<ol>
	<li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+ORgan+Targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR/Cas+gene+editing.">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+mRNA+vaccines:+A+biotech+and+industrial+perspective.">The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective.</a> npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).</li><li>Press, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo-carrier+interactions+significantly+contribute+to+micellar+conformation+and+biodistribution.">Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution.</a> NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).</li><li>Cevaal, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+T+cell-targeting+nanoparticle+drug+delivery+systems:+Considerations+for+rational+design.">In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design.</a> ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).</li><li>Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-nano+science:+Better+metrics+would+accelerate+progress.">Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress.</a> Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).</li><li>Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+level+of+nanoparticle+uptake+in+mammalian+cells+using+flow+cytometry.">Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry.</a> Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).</li><li>Lozano-Andr&#233;s, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+MESF-bead+based+assignment+of+absolute+fluorescence+values+to+nanoparticles+and+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Schwartz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalization+of+the+MESF+unit+of+fluorescence+intensity.">Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cell-particle+association+in+vitro:+A+quantitative+method+to+compare+particle+performance.">Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance.</a> Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Comfort, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+tracking+analysis+for+the+quantification+and+size+determination+of+extracellular+vesicles.">Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+particle+imaging+for+quantification+of+nano-+and+microparticles.">Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles.</a> Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+Towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISD3:+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems.">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).</li><li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions.">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).</li><li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density.">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature.">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li></ol>

Att karakterisera interaktionerna mellan läkemedelsbärare och celler blir allt viktigare i utvecklingen av nya drug delivery-system. Specifikt, för att möjliggöra rationell utvärdering och jämförelse av olika bärarkonstruktioner, är absolut kvantifiering av bärarens prestanda för att interagera med mål- och off-target-celler kritisk. Detta protokoll beskriver en tvåströmsmetodik som gör det möjligt för alla forskare som arbetar med en läkemedelsbärare att konvertera relativa, semikvantitativa flödesc...

Utformningen av drug delivery-konstruktioner som uppvisar specifikt, designat beteende beroende på vilken celltyp de möter har väckt stort forskningsintresse. Potentiella läkemedelsleveranskonstruktioner eller "bärare" inkluderar lipidformuleringar, nanoodlade oorganiska ämnen, polymera sammansättningar, extracellulära vesiklar, funktionaliserade bakterieceller eller modifierade virus. Alla dessa kan uppvisa organ-, vävnads- eller cellspecificitet på grund av fysikaliska egenskaper, ytegenskaper eller konstruerade kemiska funktionaliseringar såsom antikroppsfäste 1,2.
Ett nästan allestädes närvarande steg i in vitro-bärarutvärdering är att inkubera celler med en suspension som innehåller nämnda läkemedelsbelastade bärare. Efter inkubation mäts bärarprestanda via en funktionell avläsning av läkemedelslastens prestanda, till exempel transfektionseffektivitet eller toxicitet. Funktionella avläsningar är användbara, eftersom de är ett nedströms mått på bärarens effektivitet. För mer komplexa läkemedelsleveranskonstruktioner blir det emellertid allt viktigare att gå bortom funktionella avläsningar och separat kvantifiera graden av bärarinteraktion med cellen av intresse. Det finns några anledningar till detta.
För det första ökar intresset för att upptäcka (och iterativt förbättra) "plattformsteknik", som kan bära en mängd olika laster. Till exempel kan lipidnanopartiklar (LNP) som är utformade för att kapsla in RNA byta ut en RNA-sekvens mot en annan med få försiktighetsåtgärder3. För att iterativt förbättra bärartekniken är det därför viktigt att kvantifiera dess prestanda oberoende av lastfunktionaliteten. För det andra kanske funktionella avläsningar inte är enkla för lasten av intresse, vilket äventyrar förmågan att snabbt iterera och utvärdera bärarformuleringar. Medan man kan utföra in vitro-optimering med hjälp av en modelllast med en enkel funktionell avläsning (till exempel fluorescens), kan byte av last ändra det biologiska svaret på en bärare4 och kan därför inte ge representativa resultat. För det tredje är många bärare utformade för att interagera med och tas upp av en specifik celltyp. En sådan målinriktningsförmåga hos ett transportföretag kan och bör särskiljas från prestandan hos dess terapeutiska laststolpeinriktning. För att fortsätta LNP-exemplet kan en RNA-last vara extremt potent, men om LNP inte kan binda till cellen, internaliseras och frigöra RNA kommer ingen nedströms funktionell effekt att observeras. Detta kan vara ett problem särskilt för bärare som är avsedda att rikta in sig på svårtransfekta celltyper, såsom T-celler5. Omvänt kan en LNP rikta in sig extremt effektivt, men RNA-lasten kanske inte fungerar. En nedströmsanalys som bara mäter lastfunktionalitet kommer inte att kunna skilja mellan dessa två situationer, vilket komplicerar utvecklingen och optimeringen av carrier drug delivery-system.
I detta arbete diskuteras hur man absolut kvantifierar bärarförening . Association är en term som hänvisar till den experimentellt uppmätta graden av interaktion mellan en bärare och en cell. Association skiljer inte mellan membranbindning och internalisering - en bärare kan vara associerad eftersom den är bunden till cellytan eller för att cellen har internaliserat den. Associering mäts vanligtvis som en del av cellbärarinkubationsexperiment. Historiskt sett har association rapporterats antingen i godtyckliga fluorescerande enheter (vanligtvis "median fluorescensintensitet" eller MFI) eller som "procentassociation", mätvärden vars begränsningar tidigare har diskuterats6. Kort sagt, dessa mätningar är inte jämförbara mellan experiment, laboratorier och läkemedelsbärare på grund av skillnader i experimentella protokoll, flödescytometerinställningar och märkningsintensiteter hos olika bärare. Ansträngningar har gjorts för att övervinna den förra genom att kalibrera cytometern och därigenom omvandla det relativa måttet på MFI till ett absolut kvantitativt mått på fluorescens7. Denna metod tar emellertid inte hänsyn till variationen i märkningsintensiteten hos olika bärare och tillåter således inte en rationell jämförelse av olika bärarprestanda i en målcell som valts8.
Här, hur man praktiskt konverterar från relativa, godtyckliga fluorescerande enheter till det absoluta kvantitativa måttet för "antal bärare per cell" demonstreras genom att utföra ett litet antal ytterligare karakteriseringsexperiment. Om ett annat mått på bärarkoncentration önskas (t.ex. bärarmassa per cell eller bärarvolym per cell) är det enkelt att konvertera från bärare per cell, förutsatt att bärarkarakterisering har gjorts. För korthet och för att undvika jargong används ordet "bärare" inom detta arbete för att hänvisa till det stora sortimentet av läkemedelsleveranskonstruktioner. Dessa kvantifieringstekniker är lika tillämpliga, oavsett om de tillämpas på en nanokonstruerad guldpartikel eller en biokonstruerad bakterie.
Några fakta möjliggör omvandling från godtyckliga fluorescerande enheter till bärare per cell. För det första är den uppmätta fluorescensintensiteten proportionell mot koncentrationen av en fluorofor9 (eller en fluorescerande märkt bärare), förutsatt att fluorescensen ligger inom instrumentets detektionsgränser och instrumenteringsinställningarna är desamma. Således, om fluorescensen hos en bärare och fluorescensen hos ett prov är kända, kan man bestämma hur många bärare som finns i det provet om alla mätningar utfördes under samma inställningar och förhållanden. Men särskilt för mindre bärare kanske det inte är möjligt att mäta bärarfluorescens, cellautofluorescens och cellassocierad fluorescens med bärare på samma instrument med samma inställningar. I detta fall finns det ett andra krav på att göra det möjligt att konvertera mellan uppmätt fluorescens på ett instrument och uppmätt fluorescens på ett annat. För att göra detta kan en standardkurva för fluoroforkoncentrationen fastställas för att mäta fluorescensintensiteten på båda instrumenten och dra nytta av molekylerna av ekvivalent löslig fluorokrom (MESF) standard9. Detta möjliggör sedan mätning av bärarfluorescensen i bulk på en icke-cytometer, en mätning som kan göras på bärare av vilken storlek eller egenskap som helst. När en sådan bulkkvantifiering görs på en bärarsuspension med känd koncentration kan antalet bärare per cell i ett prov återigen beräknas.
Medan detta arbete visar processen för att mäta bärarassociation (som bestäms av uppmätt fluorescensintensitet), kan ett analogt protokoll utföras för andra mått på cellbärarinteraktion (t.ex. ett experimentellt protokoll som skiljer internaliserade och membranbundna bärare). Dessutom skulle detta protokoll vara i stort sett detsamma om associationen mättes genom en icke-fluorescerande analys (till exempel genom masscytometri).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20347</td>
			<td>pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apogee A50 Microflow</td>
			<td>Apogee</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>Tecan Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td>Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum MESF kits Alexa Fluor 647</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>647</td>
			<td>Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation

En viktig komponent i utformningen av drug delivery-system handlar om hur man förstärker eller dämpar interaktioner med specifika celltyper. Till exempel kan en kemoterapeutisk funktionaliseras med en antikropp för att förbättra bindningen till cancerceller ("inriktning") eller funktionaliseras med polyetylenglykol för att undvika immuncellsigenkänning ("stealth"). Även på cellnivå är optimering av bindningen och upptaget av en läkemedelsbärare ett komplext biologiskt designproblem. Således är det värdefullt att skilja hur starkt en ny bärare interagerar med en cell från den funktionella effekten av en bärares last när den väl levererats till den cellen.
För att fortsätta det kemoterapeutiska exemplet är "hur väl det binder till en cancercell" ett separat problem från "hur bra det dödar en cancercell". Kvantitativa in vitro-analyser för de senare är väl etablerade och är vanligtvis beroende av att mäta viabiliteten. Den mesta publicerade forskningen om cellbärarinteraktioner är dock kvalitativ eller semikvantitativ. I allmänhet är dessa mätningar beroende av fluorescerande märkning av bäraren och rapporterar följaktligen interaktioner med celler i relativa eller godtyckliga enheter. Detta arbete kan dock standardiseras och göras absolut kvantitativt med ett litet antal karakteriseringsexperiment. Sådan absolut kvantifiering är värdefull, eftersom den underlättar rationella, inter- och intraklassjämförelser av olika läkemedelsleveranssystem-nanopartiklar, mikropartiklar, virus, antikropps-läkemedelskonjugat, konstruerade terapeutiska celler eller extracellulära vesiklar.
Dessutom är kvantifiering en förutsättning för efterföljande metaanalyser eller in silico-modelleringsmetoder . I den här artikeln presenteras videoguider, liksom ett beslutsträd för hur man uppnår in vitro-kvantifiering för carrier drug delivery-system, som tar hänsyn till skillnader i bärarstorlek och märkningsmodalitet. Dessutom diskuteras ytterligare överväganden för kvantitativ bedömning av avancerade drug delivery-system. Detta är avsett att fungera som en värdefull resurs för att förbättra rationell utvärdering och design för nästa generations medicin.

Som diskuterats tidigare kräver olika läkemedelsbärartyper användning av olika tekniker för absolut kvantifiering av cellbärarassociation. Till exempel är 633 nm disulfidstabiliserade poly(metakrylsyra) (PMASH) kärnskalpartiklar stora och täta nog för detektion med användning av en känslig flödescytometer. Som sådan märktes dessa partiklar fluorescerande, sedan gated och räknades med hjälp av sidovinkelljusspridning (SALS, analogt med SSC), liksom lämplig fluorescerande kanal (<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Ett arbetsflöde demonstreras för absolut kvantifiering av läkemedelsbärar-cellinteraktioner med hjälp av flödescytometri för att möjliggöra bättre rationell utvärdering av nya drug delivery-system. Detta arbetsflöde är tillämpligt på läkemedelsbärare av vilken typ som helst.

Experimentell kvantifiering av interaktioner mellan läkemedelsleveranssystem och celler in vitro: En guide för preklinisk nanomedicinsk utvärdering

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Detta protokoll ger kvantitativa data om hur bärarsystem interagerar med celler. Kvantitativa data är nyckeln till konstruktion och optimering. Det gör att vi kan gå från ja eller nej biologiska frågor, till hur mycket frågor.Denna teknik är användbar för att omvandla resultat från preklinisk läkemedelsbärarprestanda, som var kvalitativa, till kvantitativa resultat. Och detta fungerar även när du karakteriserar din bärare på ett annat system än du karakteriserar dina celler. Det kan ta några iterationer att hitta den optimala bärarutspädningen som faller inom nanosidans linjära eller kvantitativa intervall.Ta dig tid att hitta rätt förutsättningar. För att börja, montera flödescellen på lasermodulen. Spola långsamt flödescellen med en hastighet av 0,1 milliliter per sekund med en milliliter destillerat vatten.Om det bildas bubblor i flödescellen, dra delvis tillbaka suspensionen för att slå samman bubblan med luft-vätskegränssnittet innan du fortsätter. Lås sedan hela lasermodulen på plats inuti instrumentet. Starta kameran ungefär halvvägs genom spolning.Var noga med att bekräfta att bärarskräpet tvättas ut. Välj inspelning för att öppna fliken inspelningsinställningar och klicka på starta kameran. Kör systemet med en milliliter luft.Om några statiska bärare är synliga på skärmen, rengör flödescellen enligt tillverkarens instruktioner. Förbered bärarna för nanopartikelspårningsanalys genom att se till att bärarna är väl upphängda via ultraljudsbehandling eller virvel, beroende på vilket bärarsystem som är inblandat. Späd bärarna i vatten för att förbereda minst 0,6 till en milliliter av varje prov med en bärarkoncentration mellan 1x10 till den sjunde och 1x10 till den nionde bäraren per milliliter.Ta ut lasermodulen och placera den upprätt. Släpp det första bärarprovet i en spruta på en milliliter och fäst sprutan på rörinloppet. Ladda sedan provet försiktigt i flödescellen.Om det bildas bubblor i flödescellen, dra tillbaka suspensionen delvis för att slå samman bubblan med luft-vätskegränssnittet innan du fortsätter. Se till att hela flödescellen är fylld med vätska och pausa sedan belastningen. Justera kamerafokus om det behövs för att visualisera enskilda bärare.Gör grova fokusjusteringar med den roterande ratten på instrumentets högra sida. Gör finare justeringar genom att välja fliken Maskinvara. Ändra fokus genom att justera fokusreglaget.För att säkerställa att det inte finns någon övermättnad, välj den optimala kameranivån genom att justera skjutreglaget på inspelningsfliken. Om instrumentet är utrustat med detta tillbehör, ladda sprutan som innehåller bärarprovet i sprutpumpen. Under fliken SOP väljer du standardmätning för att ta fem bilder på 30 sekunder vardera.Ange basfilnamn och lägg till ytterligare exempelinformation om så önskas genom att klicka på den avancerade knappen som öppnar en modal dialog med olika val. Tryck på skapa och kör skript och vänta tills ett popup-fönster visas som ber om att skicka ett exempel. Om du använder sprutpumpen väljer du fliken Hårdvara och sedan fliken Sprutpump.Ställ in önskad infusionshastighet och tryck infusera. Om du inte använder sprutpumpen, avancera provet manuellt. I popup-fönstret väljer du OK för att börja fånga.Efter var och en av de fem fångsterna, när det avancerade exemplet dyker upp igen, kontrollera att provet fortfarande rör sig genom flödescellen. Välj sedan OK för att fortsätta med nästa inspelning. På processfliken justerar du detekteringströskelreglaget mellan fyra och åtta för att korrekt identifiera distinkta bärare som är synliga på skärmen.Du kan justera skärmförstärkningen för att underlätta visualiseringen, det påverkar inte nedströmsanalysen. I popup-fönstret trycker du på okej för att initiera spårningsanalys. Övervaka analysförloppet genom att klicka på analysen på en enda analysflik.När analysen är klar letar du efter en exportinställningsprompt som ska visas. Bekräfta att sammanfattningen inkludera PDF och inkludera experiment är markerad. Välj andra exportformat efter behov.I resultatavsnittet i PDF-dataexporten, för att säkerställa att den uppmätta koncentrationen är tillförlitlig, kontrollera att den uppmätta bärarkoncentrationen är mellan 1x10 och den sjunde och 1x10 till den nionde bäraren per milliliter och kontrollera om det finns eventuella felmeddelanden eller varningsmeddelanden under koncentrationsmätningsresultatet. Upprepa proceduren två eller flera gånger med olika utspädningar från stamberedningen och se till att varje provs koncentration ligger inom instrumentets linjära intervall. Beräkna lagerhållarkoncentrationen enligt beskrivningen i textmanuskriptet.Bered den fria eller antikroppskonjugerade fluorokromlösningen enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Beräkna stamlösningens koncentration utifrån koncentrationen, molekylvikten och Avogadros tal som visas i ekvationen. Utför sedan en seriell utspädning av färgämnet i bärarutspädningsmedlet för att generera standardkurvprover.Lägg sedan till bärarprovet på mätplattan och mät fluorescensen med en mikroplattläsare. Generera standardkurvan enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Beräkna den absoluta fluorescensintensiteten per bärare genom att dividera bulkfluorescensen med bärarkoncentrationen.Ställ in flödescytometern för det slutliga bärarcellexperimentet genom att bestämma optimala PMT-spänningsinställningar i relevanta kanaler. Kör ett negativt kontrollprov där cellerna inte inkuberas med bärare för att bestämma bakgrundsfluorescensen. Förbered och åter suspendera flödescytometrikvantiteringspärlorna.Använd samma buffert som används för cellproverna. Om pärlpopulationerna tillhandahålls separat, dra dem ihop. Kör flödescytometrikvantiteringspärlan och bärarcellproverna för att bestämma fluorescensintensiteten per cell.Kör flödescytometerkvantifieringspärlorna för att generera en standardkurva och omvandla den absoluta fluorescerande intensiteten till MFI. Använd detta för att beräkna bärarnas teoretiska MFI enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Kör cellbärarproverna för att bestämma fluorescerande intensitet per cell i varje prov.Slutligen beräkna antalet bärare per cell för varje prov genom att subtrahera bakgrundsfluorescensen från provets uppmätta fluorescens och sedan dividera med fluorescensen per partikel. För 633 nanometer polymetakrylsyrakärnskalpartiklar var koncentrationen och fluorescerande intensiteten per bärare direkt kvantifierbar med hjälp av cytometerströmmen. Däremot var 100 nanometer superparamagnetiska järnoxidnanopartiklar för små för att detektera individuellt och analyserades med hjälp av bulkströmmen.Märkta kvantifieringspärlor användes på flera dagar för att generera standardkurvor på en flödescytometer. Korrelationen mellan det uppmätta MFI och MESF-värdet för kvantifieringspärlorna var linjär och i stort sett lika mellan de uppmätta datumen. Tidsförloppsexperiment med fluorescerande märkta HeLa-celler med 235 nanometer polymetakrylsyrakapslar från noll till 24 timmar visade en ökning av MFI över tid, vilket indikerar att kapslarna associerade med HeLa-celler.Skillnaden i det uppenbara cellulära svaret på bärare var skarp, beroende på relativ eller absolut kvantifiering. Den absoluta kvantifieringen var oberoende av märkningsintensitet och därmed mer jämförbar. Dessa tekniker är grunden för djupare analys och jämförelse av partikelprestanda.Vi är glada över att använda dessa tekniker för att parametrisera matematiska modeller som gör att vi kan karakterisera partikelprestanda oberoende av ett visst experiment.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modeller och metoder för att utvärdera Transport av Drug Delivery System Across Cellular Hinder

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Anpassning av Electro processen med att ge tre unika miljöer för en Tri-lager<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Sandwich liknande mikromiljöer att utnyttja Cell / Material Interaktioner

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Syntesen av Functionalized 10-nm polymerbelagda guldpartiklar för endotel inriktning och Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Omfattande utvärdering av effektiviteten och säkerheten av Placenta-Targeted Drug Delivery med tre kompletterande metoder

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Användning av High-Throughput automatiserat Microbioreactor System för produktion av modell IgG1 i CHO-celler

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Rening och analys av en monoklonal antikropp från äggstocksceller från kinesisk hamster med hjälp av ett automatiserat Mikrobioreaktor system

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

En kvantitativ fluorescensmikroskopi-baserad Singelliposomanalys för att detektera sammansättningen av Inhomogeniteten mellan enskilda Lipoer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primärt förtydligande av CHO skördad cellodlingsvätska med hjälp av en akustisk separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...