Name: experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Bu çalışma Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC; Program Hibe No. GNT1149990), Avustralya HIV ve Hepatit Viroloji Araştırma Merkezi (ACH2) ve Réjane Louise Langlois'in mülkünden bir hediye. FC, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) Kıdemli Baş Araştırma Bursu (GNT1135806) ödülünü kabul eder. Şekil 1 ve Şekil 2 , BioRender.com ile oluşturulmuştur.

1. Uygun akışı seçme
<ol><li>Kullanılan deney düzeni için en iyi iş akışını (akış) belirlemek üzere Şekil 1'de özetlenen karar ağacını izleyin (Şekil 2). Bu akış seçimi hakkında daha fazla yorum için tartışmaya bakın.</li>
	<li>Sitometre Akışını izliyorsanız, 2.1.1-2.2.7 adımlarıyla devam edin. Toplu Akış'ı izliyorsanız 3.1.1.1-3.1.5.7 adımlarıyla devam edin.</li>
</ol><p class="jove_content biglegend"...

<ol>
	<li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine.">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+ORgan+Targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR/Cas+gene+editing.">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+mRNA+vaccines:+A+biotech+and+industrial+perspective.">The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective.</a> npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).</li><li>Press, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo-carrier+interactions+significantly+contribute+to+micellar+conformation+and+biodistribution.">Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution.</a> NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).</li><li>Cevaal, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+T+cell-targeting+nanoparticle+drug+delivery+systems:+Considerations+for+rational+design.">In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design.</a> ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).</li><li>Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-nano+science:+Better+metrics+would+accelerate+progress.">Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress.</a> Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).</li><li>Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+level+of+nanoparticle+uptake+in+mammalian+cells+using+flow+cytometry.">Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry.</a> Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).</li><li>Lozano-Andr&#233;s, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+MESF-bead+based+assignment+of+absolute+fluorescence+values+to+nanoparticles+and+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Schwartz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalization+of+the+MESF+unit+of+fluorescence+intensity.">Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cell-particle+association+in+vitro:+A+quantitative+method+to+compare+particle+performance.">Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance.</a> Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).</li><li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment.">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li><li>Comfort, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+tracking+analysis+for+the+quantification+and+size+determination+of+extracellular+vesicles.">Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+particle+imaging+for+quantification+of+nano-+and+microparticles.">Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles.</a> Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+Towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISD3:+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems.">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).</li><li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions.">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).</li><li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density.">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature.">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li></ol>

İlaç taşıyıcıları ve hücreler arasındaki etkileşimlerin karakterize edilmesi, yeni ilaç dağıtım sistemlerinin geliştirilmesinde giderek daha önemli hale gelmektedir. Spesifik olarak, çeşitli taşıyıcı yapıların rasyonel olarak değerlendirilmesine ve karşılaştırılmasına izin vermek için, söz konusu taşıyıcının hedef ve hedef dışı hücrelerle etkileşime girme performansının mutlak olarak ölçülmesi kritik öneme sahiptir. Bu protokol, bir ilaç taşıyıcısı ile çalışan her...

Hangi hücre tipiyle karşılaştıklarına bağlı olarak spesifik, tasarlanmış davranış sergileyen ilaç dağıtım yapılarının tasarımı, önemli araştırma ilgisini çekmiştir. Potansiyel ilaç dağıtım yapıları veya "taşıyıcılar" arasında lipit formülasyonları, nano-yetiştirilen inorganikler, polimerik montajlar, hücre dışı veziküller, işlevselleştirilmiş bakteri hücreleri veya modifiye virüsler bulunur. Bunların hepsi, fiziksel özellikler, yüzey özellikleri veya antikor eki1,2 gibi mühendislik kimyasal işlevlerine bağlı olarak organ, doku veya hücre özgüllüğü gösterebilir.
İn vitro taşıyıcı değerlendirmesinde neredeyse her yerde bulunan bir adım, söz konusu ilaç yüklü taşıyıcıyı içeren bir süspansiyonla hücreleri inkübe etmektir. Kuluçka sonrası, taşıyıcı performansı, ilaç kargosunun performansının, örneğin transfeksiyon verimliliği veya toksisitesinin işlevsel bir okuması ile ölçülür. İşlevsel okumalar, taşıyıcı etkinliğinin aşağı akış ölçüsü oldukları için yararlıdır. Bununla birlikte, daha karmaşık ilaç dağıtım yapıları için, fonksiyonel okumaların ötesine geçmek ve ilgilenilen hücre ile taşıyıcı etkileşiminin derecesini ayrı ayrı ölçmek giderek daha önemlidir. Bunun birkaç nedeni var.
İlk olarak, çeşitli yükleri taşıyabilen "platform" taşıyıcı teknolojilerini keşfetmeye (ve yinelemeli olarak iyileştirmeye) artan ilgi var. Örneğin, RNA'yı kapsüllemek için tasarlanmış lipit nanopartikülleri (LNP'ler), birkaç uyarı3 ile bir RNA dizisini diğeriyle değiştirebilir. Bu nedenle, taşıyıcı teknolojisini yinelemeli olarak geliştirmek için, kargo işlevselliğinden bağımsız olarak performansını ölçmek çok önemlidir. İkincisi, fonksiyonel okumalar, taşıyıcı formülasyonlarını hızlı bir şekilde yineleme ve değerlendirme yeteneğinden ödün vererek, ilgilenilen kargo için basit olmayabilir. Basit bir fonksiyonel okuma (örneğin, floresan) ile bir model kargo kullanarak in vitro optimizasyon yapılabilirken, kargonun değiştirilmesi bir taşıyıcı4'e biyolojik tepkiyi değiştirebilir ve bu nedenle temsili sonuçlar vermeyebilir. Üçüncüsü, birçok taşıyıcı belirli bir hücre tipi ile etkileşime girmek ve bunlar tarafından ele geçirilmek üzere tasarlanmıştır. Bir taşıyıcının bu hedefleme yeteneği , terapötik kargo sonrası hedeflemesinin performansından ayırt edilebilir ve edilmelidir. LNP örneğine devam etmek için, bir RNA kargosu son derece güçlü olabilir, ancak LNP hücreye bağlanamazsa, içselleştirilemez ve RNA'yı serbest bırakamazsa, aşağı akış fonksiyonel etkisi gözlenmez. Bu, özellikle T hücreleri5 gibi transfekte edilmesi zor hücre tiplerini hedeflemeyi amaçlayan taşıyıcılar için bir sorun olabilir. Tersine, bir LNP son derece etkili bir şekilde hedefleyebilir, ancak RNA kargosu çalışmayabilir. Sadece kargo işlevselliğini ölçen bir aşağı akış testi, bu iki durum arasında ayrım yapamaz, böylece taşıyıcı ilaç dağıtım sistemlerinin geliştirilmesini ve optimizasyonunu zorlaştırır.
Bu çalışmada, taşıyıcı ilişkisinin kesin olarak nasıl ölçüleceği tartışılmıştır. İlişkilendirme, bir taşıyıcı ile bir hücre arasındaki deneysel olarak ölçülen etkileşim derecesini ifade eden bir terimdir. İlişkilendirme, membran bağlama ve içselleştirme arasında ayrım yapmaz – bir taşıyıcı, hücre yüzeyine bağlı olduğu veya hücre onu içselleştirdiği için ilişkili olabilir. İlişkilendirme genellikle hücre taşıyıcı inkübasyon deneylerinin bir parçası olarak ölçülür. Tarihsel olarak, ilişkilendirme ya keyfi floresan birimlerinde (tipik olarak "medyan floresan yoğunluğu" veya MFI) ya da sınırlamaları daha önce tartışılan metrikler olan "yüzde ilişkisi" olarak bildirilmiştir6. Kısacası, bu ölçümler deneysel protokoller, akış sitometresi ayarları ve farklı taşıyıcıların etiketleme yoğunluklarındaki farklılıklar nedeniyle deneyler, laboratuvarlar ve ilaç taşıyıcıları arasında karşılaştırılamaz. Sitometreyi kalibre ederek birincisinin üstesinden gelmek için çaba sarf edilmiştir, böylece MFI'nin göreceli ölçüsünü kesinlikle nicel bir floresan7 ölçüsüne dönüştürmüştür. Bununla birlikte, bu yöntem çeşitli taşıyıcıların etiketleme yoğunluğundaki değişkenliği hesaba katmaz ve bu nedenle,8. seçimin hedef hücresindeki çeşitli taşıyıcı performanslarının rasyonel olarak karşılaştırılmasına izin vermez.
Burada, göreceli, keyfi floresan birimlerinden "hücre başına taşıyıcı sayısının" mutlak nicel metriğine pratik olarak nasıl dönüştürüleceği, az sayıda ek karakterizasyon deneyi yapılarak gösterilmiştir. Başka bir taşıyıcı konsantrasyonu metriği istenirse (örneğin, hücre başına taşıyıcı kütle veya hücre başına taşıyıcı hacim), taşıyıcı karakterizasyonu yapılmış olması koşuluyla, hücre başına taşıyıcılardan dönüştürmek kolaydır. Kısalık ve jargondan kaçınmak için, "taşıyıcı" kelimesi bu çalışmada ilaç dağıtım yapılarının geniş çeşitliliğine atıfta bulunmak için kullanılmıştır. Bu niceleme teknikleri, nano mühendislik ürünü bir altın parçacığına veya biyo-mühendislik ürünü bir bakteriye uygulanıp uygulanmadığına bakılmaksızın eşit derecede uygulanabilir.
Birkaç gerçek, keyfi floresan birimlerinden hücre başına taşıyıcılara dönüşümü mümkün kılar. İlk olarak, ölçülen floresan yoğunluğu, floresanın cihazın algılama sınırları içinde olduğu ve enstrümantasyon ayarlarının aynı olduğu varsayılarak, bir florofor9'un (veya floresan olarak etiketlenmiş bir taşıyıcının) konsantrasyonu ile orantılıdır. Böylece, bir taşıyıcının floresansı ve bir numunenin floresansı biliniyorsa, tüm ölçümler aynı ayarlar ve koşullar altında gerçekleştirilmişse, o numunede kaç taşıyıcının bulunduğu belirlenebilir. Bununla birlikte, özellikle küçük taşıyıcılar için, aynı cihazda aynı aletlerde taşıyıcı floresansı, hücre otofloresansını ve taşıyıcılarla ilişkili hücre floresansını aynı ayarlarla ölçmek mümkün olmayabilir. Bu durumda, bir cihazda ölçülen floresan ile başka bir cihazda ölçülen floresan arasında dönüştürme yapmayı mümkün kılmak için ikinci bir gereklilik vardır. Bunu yapmak için, Eşdeğer Çözünür Florokrom Molekülleri (MESF) standart9'dan yararlanarak, her iki cihazdaki floresan yoğunluğunu ölçmek için standart bir florofor konsantrasyonu eğrisi oluşturulabilir. Bu daha sonra, taşıyıcı floresansının sitometre olmayan bir sitometre üzerinde toplu olarak ölçülmesine izin verir, bu da herhangi bir boyut veya özellikteki taşıyıcılar üzerinde yapılabilecek bir ölçümdür. Bu tür bir kütle miktarı, bilinen konsantrasyondaki bir taşıyıcı süspansiyonunda yapıldığında, bir numunenin hücresi başına düşen taşıyıcı sayısı, bir kez daha, hesaplanabilir.
Bu çalışma, taşıyıcı ilişkisini ölçme sürecini gösterirken (ölçülen floresan yoğunluğu ile belirlendiği gibi), hücre-taşıyıcı etkileşiminin diğer ölçümleri için benzer bir protokol gerçekleştirilebilir (örneğin, içselleştirilmiş ve membrana bağlı taşıyıcıları ayırt eden deneysel bir protokol). Ek olarak, eğer ilişki floresan olmayan bir tahlille (örneğin, kütle sitometrisi yoluyla) ölçülürse, bu protokol büyük ölçüde aynı olacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20347</td>
			<td>pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apogee A50 Microflow</td>
			<td>Apogee</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software</td>
			<td></td>
			<td>Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>Tecan Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td>Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum MESF kits Alexa Fluor 647</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>647</td>
			<td>Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental quantification of interactions between drug delivery systems and cells in vitro: a guide for preclinical nanomedicine evaluation

İlaç dağıtım sistemlerinin tasarlanmasının önemli bir bileşeni, belirli hücre tipleriyle etkileşimlerin nasıl artırılacağı veya azaltılacağı ile ilgilidir. Örneğin, bir kemoterapi, kanser hücrelerine bağlanmayı arttırmak için bir antikor ile işlevselleştirilebilir ("hedefleme") veya bağışıklık hücresi tanımadan kaçınmaya yardımcı olmak için polietilen glikol ile işlevselleştirilebilir ("gizlilik"). Hücresel düzeyde bile, bir ilaç taşıyıcısının bağlanmasını ve alımını optimize etmek karmaşık bir biyolojik tasarım problemidir. Bu nedenle, yeni bir taşıyıcının bir hücreyle ne kadar güçlü etkileşime girdiğini, bir taşıyıcının kargosunun o hücreye teslim edildikten sonraki işlevsel etkinliğinden ayırmak değerlidir.
Kemoterapötik örneğe devam etmek gerekirse, "bir kanser hücresine ne kadar iyi bağlandığı", "bir kanser hücresini ne kadar iyi öldürür" den ayrı bir sorundur. İkincisi için kantitatif in vitro testler iyi kurulmuştur ve genellikle canlılığın ölçülmesine dayanır. Bununla birlikte, hücre-taşıyıcı etkileşimleri üzerine yayınlanan araştırmaların çoğu kalitatif veya yarı kantitatiftir. Genel olarak, bu ölçümler taşıyıcının floresan etiketlemesine dayanır ve sonuç olarak, göreceli veya keyfi birimlerdeki hücrelerle etkileşimleri bildirir. Bununla birlikte, bu çalışma standartlaştırılabilir ve az sayıda karakterizasyon deneyi ile kesinlikle nicel hale getirilebilir. Bu tür mutlak niceleme, çeşitli ilaç dağıtım sistemlerinin (nanopartiküller, mikropartiküller, virüsler, antikor-ilaç konjugatları, mühendislik terapötik hücreleri veya hücre dışı veziküller) rasyonel, sınıflar arası ve sınıflar arası karşılaştırmalarını kolaylaştırdığı için değerlidir.
Ayrıca, niceleme, sonraki meta-analizler veya in silico modelleme yaklaşımları için bir ön koşuldur. Bu makalede, taşıyıcı ilaç dağıtım sistemleri için in vitro nicelemenin nasıl sağlanacağına dair bir karar ağacının yanı sıra, taşıyıcı boyut ve etiketleme yöntemindeki farklılıkları dikkate alan video kılavuzları sunulmaktadır. Ek olarak, gelişmiş ilaç dağıtım sistemlerinin nicel değerlendirmesi için daha fazla husus tartışılmaktadır. Bunun, yeni nesil tıp için rasyonel değerlendirme ve tasarımı geliştirmek için değerli bir kaynak olarak hizmet etmesi amaçlanmıştır.

Daha önce tartışıldığı gibi, farklı ilaç taşıyıcı tipleri, hücre-taşıyıcı ilişkisinin mutlak niceliği için farklı tekniklerin kullanılmasını gerektirir. Örneğin, 633 nm disülfür stabilize poli (metakrilik asit) (PMASH) çekirdek kabuk parçacıkları, hassas bir akış sitometresi kullanılarak tespit edilebilecek kadar büyük ve yoğundur. Bu nedenle, bu parçacıklar floresan olarak etiketlendi, daha sonra yan açılı ışık saçılması (SALS, SSC'ye benzer) ve uygun floresan...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation at JoVE.com

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Yeni ilaç dağıtım sistemlerinin daha rasyonel değerlendirilmesini sağlamak için akış sitometrisi kullanılarak ilaç taşıyıcı-hücre etkileşimlerinin mutlak ölçümü için bir iş akışı gösterilmiştir. Bu iş akışı, her türlü ilaç taşıyıcısı için geçerlidir.

İlaç Dağıtım Sistemleri ve Hücreler Arasındaki Etkileşimlerin Deneysel Ölçümü In Vitro: Preklinik Nanotıp Değerlendirmesi İçin Bir Kılavuz

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Bu protokol, taşıyıcı sistemlerin hücrelerle nasıl etkileşime girdiğine dair nicel veriler sağlar. Kantitatif veriler, mühendislik ve optimizasyon için anahtardır. Evet veya hayır biyolojik sorulardan, ne kadar soruya geçmemizi sağlar.Bu teknik, kalitatif olan preklinik ilaç taşıyıcı performansından elde edilen sonuçları kantitatif sonuçlara dönüştürmek için yararlıdır. Ve bu, taşıyıcınızı hücrelerinizi karakterize ettiğinizden farklı bir sistemde karakterize ettiğinizde bile çalışır. Nano tarafın doğrusal veya kantitatif aralıklarına giren optimum taşıyıcı seyreltmesini bulmak için birkaç yineleme gerekebilir.Doğru koşulları bulmak için zaman ayırın. Başlamak için, akış hücresini lazer modülüne monte edin. Akış hücresini saniyede 0,1 mililitre hızında bir mililitre damıtılmış su ile yavaşça yıkayın.Akış hücresi içinde kabarcıklar oluşursa, devam etmeden önce kabarcığı hava-sıvı arayüzü ile birleştirmek için süspansiyonu kısmen geri çekin. Ardından tüm lazer modülünü cihazın içindeki yerine kilitleyin. Kamerayı kızarma işleminin yaklaşık yarısına kadar çalıştırın.Taşıyıcı kalıntıların yıkandığını onayladığınızdan emin olun. Yakalama ayarları sekmesini açmak için yakala'yı seçin ve kamerayı başlat'ı tıklatın. Sistemi bir mililitre hava ile çalıştırın.Ekranda herhangi bir statik taşıyıcı görünüyorsa, akış hücresini üreticinin talimatlarına göre temizleyin. İlgili taşıyıcı sisteme bağlı olarak, taşıyıcıların sonikasyon veya vorteks yoluyla iyi bir şekilde askıya alınmasını sağlayarak taşıyıcıları nanopartikül izleme analizi için hazırlayın. Her numunenin en az 0,6 ila bir mililitresini, mililitre başına 1x10 ila yedinci ve 1x10 ila dokuzuncu taşıyıcılar arasında bir taşıyıcı konsantrasyonu ile hazırlamak için taşıyıcıları suda seyreltin.Lazer Modül'ü çıkarın ve dik olarak yerleştirin. İlk taşıyıcı numuneyi bir mililitrelik bir şırıngaya bırakın ve şırıngayı tüp girişine takın. Ardından numuneyi dikkatlice akış hücresine yükleyin.Akış hücresi içinde kabarcıklar oluşursa, devam etmeden önce kabarcığı hava-sıvı arayüzü ile birleştirmek için süspansiyonu kısmen geri çekin. Tüm akış hücresinin sıvı ile dolu olduğundan emin olun, ardından yüklemeyi duraklatın. Tek tek taşıyıcıları görselleştirmek için gerekirse kamera odağını ayarlayın.Cihazın sağ tarafındaki dönen düğme ile kaba odak ayarlamaları yapın. Donanım sekmesini seçerek daha ince ayarlamalar yapın. Netleme kaydırıcısını ayarlayarak odağı değiştirin.Aşırı doygunluk olmadığından emin olmak için, yakalama sekmesindeki kaydırıcıyı ayarlayarak en uygun kamera düzeyini seçin. Cihaz bu aksesuarla donatılmışsa, taşıyıcı numuneyi içeren şırıngayı şırınga pompasına yükleyin. SÇP sekmesi altında, her biri 30 saniyelik beş yakalama yapmak için standart ölçümü seçin.Temel dosya adını girin ve isterseniz, çeşitli seçeneklerle kalıcı bir diyalog açacak olan gelişmiş düğmeye tıklayarak ek örnek bilgileri ekleyin. Komut dosyası oluştur ve çalıştır'a basın ve lütfen örneği ilerletmenizi isteyen bir açılır pencerenin görünmesini bekleyin. Şırınga pompasını kullanıyorsanız, donanım sekmesini ve ardından şırınga pompası sekmesini seçin.İstenilen infüzyon hızını ayarlayın ve demlemeye basın. Şırınga pompasını kullanmıyorsanız, numuneyi manuel olarak ilerletin. Açılır pencerede, yakalamaya başlamak için Tamam'ı seçin.Beş yakalamanın her birinden sonra, lütfen gelişmiş örnek açılır penceresi yeniden göründüğünde, numunenin akış hücresinde hala hareket edip etmediğini kontrol edin. Ardından bir sonraki yakalamaya devam etmek için Tamam'ı seçin. İşlem sekmesinde, ekranda görünen farklı taşıyıcıları doğru şekilde tanımlamak için algılama eşiği kaydırıcısını dört ile sekiz arasında ayarlayın.Ekran kazancını görselleştirmeye yardımcı olacak şekilde ayarlayabilirsiniz, bu aşağı akış analizini etkilemez. Açılır pencerede, izleme analizini başlatmak için Tamam'a basın. Tek analiz sekmesindeki analize tıklayarak analiz ilerlemesini izleyin.Analiz tamamlandığında, dışa aktarma ayarları isteminin görünmesine bakın. PDF'yi dahil et ve deneme özetini dahil et'in seçili olduğunu onaylayın. İstediğiniz gibi diğer dışa aktarma biçimlerini seçin.PDF veri dışa aktarımının sonuçlar bölümünde, ölçülen konsantrasyonun güvenilir olduğundan emin olmak için, ölçülen taşıyıcı konsantrasyonunun mililitre başına 1x10 ila yedinci ve 1x10 ila dokuzuncu taşıyıcılar arasında olduğunu doğrulayın ve konsantrasyon ölçüm sonucunun altında herhangi bir hata mesajı veya uyarı mesajı olup olmadığını kontrol edin. Prosedürü stoktan farklı seyreltmelerle iki veya daha fazla kez tekrarlayın ve her numunenin konsantrasyonunun cihazın doğrusal aralığına düştüğünden emin olun. Metin makalesinde açıklandığı gibi stok taşıyıcı konsantrasyonunu hesaplayın.Serbest veya antikor konjuge florokrom çözeltisini metin yazısında açıklandığı şekilde hazırlayın. Stok çözeltisinin konsantrasyonunu, denklemde gösterildiği gibi konsantrasyondan, moleküler ağırlıktan ve Avogadro sayısından hesaplayın. Ardından, standart eğri numuneleri oluşturmak için taşıyıcı seyrelticideki boyanın seri seyreltilmesini gerçekleştirin.Ardından taşıyıcı numuneyi ölçüm plakasına ekleyin ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak floresan ölçün. Metin makalesinde açıklandığı gibi standart eğriyi oluşturun. Toplu floresanı taşıyıcı konsantrasyonuna bölerek taşıyıcı başına mutlak floresan yoğunluğunu hesaplayın.İlgili kanallarda optimal PMT voltaj ayarlarını belirleyerek son taşıyıcı hücre deneyi için akış sitometresini kurun. Arka plan floresansını belirlemek için hücrelerin taşıyıcılarla inkübe edilmediği negatif bir kontrol örneği çalıştırın. Akış sitometrisi kantitasyon boncuklarını hazırlayın ve yeniden askıya alın.Hücre örnekleri için kullanılanla aynı arabelleği kullanın. Boncuk popülasyonları ayrı ayrı sağlanmışsa, bunları bir araya getirin. Hücre başına floresan yoğunluğunu belirlemek için akış sitometrisi kantitasyon boncuğu ve taşıyıcı hücre örneklerini çalıştırın.Standart bir eğri oluşturmak için akış sitometresi nicelleştirme boncuklarını çalıştırın ve mutlak floresan yoğunluğunu MFI'ye dönüştürün. Metin makalesinde açıklandığı gibi taşıyıcıların teorik MFI'sini hesaplamak için bunu kullanın. Her numunenin hücre başına floresan yoğunluğunu belirlemek için hücre taşıyıcı numunelerini çalıştırın.Son olarak, arka plan floresanını numunenin ölçülen floresansından çıkararak ve ardından parçacık başına floresana bölerek her numune için hücre başına taşıyıcı sayısını hesaplayın. 633 nanometre Polimetakrilik asit çekirdek kabuk parçacıkları için, taşıyıcı başına konsantrasyon ve floresan yoğunluğu, sitometre akışı kullanılarak doğrudan ölçülebilirdi. Buna karşılık, 100 nanometre süper paramanyetik demir oksit nanopartikülleri ayrı ayrı tespit edilemeyecek kadar küçüktü ve toplu akış kullanılarak analiz edildi.Etiketli kantitasyon boncukları, bir akış sitometresinde standart eğriler oluşturmak için birkaç günde kullanıldı. Ölçülen MFI ile nicelik boncuklarının MESF değeri arasındaki korelasyon doğrusal ve ölçülen tarihler arasında geniş ölçüde benzerdi. Sıfırdan 24 saate kadar 235 nanometre polimetakrilik asit kapsülleri ile floresan etiketli HeLa hücrelerini kullanan zaman kursu deneyleri, kapsüllerin HeLa hücreleri ile ilişkili olduğunu gösteren MFI'da zamanla bir artış gösterdi.Taşıyıcılara karşı görünür hücresel yanıttaki fark, göreceli veya mutlak nicelleştirmeye bağlı olarak keskindi. Mutlak niceleme, etiketleme yoğunluğundan bağımsızdı ve bu nedenle daha karşılaştırılabilirdi. Bu teknikler, partikül performansının daha derin analizi ve karşılaştırılması için temeldir.Bu teknikleri, herhangi bir deneyden bağımsız olarak parçacık performansını karakterize etmemizi sağlayacak matematiksel modelleri parametreleştirmek için kullanmaktan heyecan duyuyoruz.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Elektrospinning Süreci Uyarlama bir Tri-katmanlı için üç Benzersiz ortamlar sağlamak için<em&gt; In Vitro</em&gt; Havayolu Wall Modeli

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Sandviç gibi mikroçevrelerde Hücre / Malzeme Etkileşimleri Harness

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Endotel hedefleme için Functionalized 10-nm polimer kaplı altın parçacıkları ve ilaç dağıtım sentezi

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Kapsamlı değerlendirme etkinliği ve güvenliği üç tamamlayıcı yöntemlerle plasenta hedefli ilaç dağıtım

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Otomatik bir Mikrobioreactor sistemi kullanılarak Çin hamster yumurtlama hücrelerinden bir monoklonal antikor arıtma ve analitik

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Bireysel Lipozomlar Arasındaki Bileşimsel Homojenliği Saptamak için Kantitatif Floresan Mikroskopesi Bazlı Tek Lipozom Testi

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Akustik Ayırıcı Kullanarak CHO Hasat Edilen Hücre Kültürü Sıvısının Birincil Netleştirilmesi

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...