1.3K Views
•
08:40 min
•
October 28th, 2022
DOI :
October 28th, 2022
•0:04
Introduction
1:05
Preparation of Protein Solutions
2:04
Measurement of Protein Concentrations
4:15
Coating of Beads
5:32
Preparing the Motility Mix, Slides for Observation, and Microscopy Observation
6:39
Results: Measuring Protein Concentrations, Analyzing Comet Formation and Bead Velocity
7:53
Conclusion
Transcript
Med en enkel blanding av ingredienser og funksjonaliserte overflater, gjenskaper denne protokollen en vital funksjon av celler, bevegelse drevet av aktinmontering. De biokjemiske og biofysiske mekanismene for kraftproduksjon kan vurderes ved å variere ingrediensblandingen og egenskapene til den funksjonaliserte overflaten. Den største fordelen med denne protokollen er at alle ingrediensene kan kjøpes, så kompetanse innen proteinrensing er ikke nødvendig.
Dette gjør det mulig for ikke-spesialister å bruke dette systemet som et verktøy i sin forskning. Denne protokollen gir en undervisningsmodul på lavere nivå, noe som gir studentene praktisk erfaring med å manipulere proteiner og observere et selvforberedt biologisk system under mikroskopet. De kan kontrollere og variere systemparametere.
Fysisk analyse, for eksempel en Langmuir-ligning, kan kjøres på baner. Begynn med å resuspendere lyofiliserte proteiner. Samle det faste stoffet i bunnen av røret ved pulssentrifugerende proteinpulver ved fire grader Celsius.
Tilsett deretter vann i henhold til produsentens instruksjoner og inkuber på is i minst 15 minutter. Bland forsiktig ved pipettering. Hold den på isen i ytterligere 15 minutter og bland igjen.
Samle løsningen i bunnen av røret ved sentrifugering. Remix, og aliquot på is. For å depolymerisere aktin oligomerer dannet under lyofilisering og frysing, fortynn en aliquot av resuspended aktin åtte ganger i G-buffer pigget med ytterligere ATP, DTT og 10% merket aktin.
La det depolymerisere på is med sporadisk blanding i minst noen dager til en uke før du måler proteinkonsentrasjonen. For å måle proteinkonsentrasjoner av resuspenderte proteiner, må du først lage en BSA-fortynningsserie. Start med å plassere to milliliter og 1,5 milliliter rør i rack som beskrevet i manuskript.
Fyll et 15 milliliter konisk rør til toppen med Bradford Reagent og legg det på is. Ta 200 mikroliter Bradford Reagent og kast den tilbake i det koniske røret for å fukte pipettespissen. Siden oppløsningen er tyktflytende, pipette sakte for å la løsningen komme inn og forlate spissen helt uten å lage bobler.
Deretter bruker du den pre-våte spissen, pipette 200 mikroliter Bradford Reagent inn i hvert av de 1,5 milliliter rørene i stativet. Og returner det gjenværende innholdet i det 15 milliliter koniske røret til flasken. Mål ut vann i de to milliliter rørene i rad en, tre og fem.
Klargjør BSA-fortynningsserien ved å fortynne den kalibrerte BSA-stamløsningen som beskrevet i manuskriptet. Lag deretter serielle fortynninger ved å overføre 900 mikroliter av hver løsning til neste rør. Tilsett 800 mikroliter vann til Bradford Reagent-røret for blankt og start timeren.
Bland 800 mikroliter av hver BSA-standard med 200 mikroliter Bradford Reagent i de tilberedte rørene. Innen fem minutter etter blanding med Bradford-reagenset eller hver standard i en engangskyvette, les deretter absorbansen ved 600 nanometer. Graf de oppnådde absorbansverdiene som en funksjon av kjent BSA-konsentrasjon og oppnå en lineær korrelasjon med en R-verdi på 0,99.
I rørene som inneholder 2000 mikroliter vann, fortynnes resolubiliserte proteiner forsiktig som beskrevet i manuskriptet. Tilsett umiddelbart 800 mikroliter av hver løsning til den tilberedte Bradford Reagent og bland. Les absorbansene i spektrofotometeret innen fem minutter.
Beregn proteinkonsentrasjoner ved hjelp av den tidligere konstruerte standardkurven. For perlebelegg, forkjøl sentrifugen til fire grader Celsius. Pipette 50 mikroliter Xb buffer i et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør.
Bland perlesuspensjonen med en diameter på 4,5 mikrometer grundig ved virvel og tilsett ni mikroliter av suspensjonen til røret som inneholder Xb-bufferen. Sentrifuger prøvene ved 20.000 G i 10 minutter ved fire grader Celsius. For å belegge perlene, fjern supernatanten forsiktig uten å forstyrre perlene og resuspend perlepelleten i 40 mikroliter to mikromolar SpVCA i Xb-buffer ved forsiktig pipettering.
Agiter nå perlene i tørrblokken ved 1000 o / min i 20 minutter ved 18 grader Celsius. Vask deretter de belagte perlene ved sentrifugering. Fjerne supernatanten og resuspendere perlene i 50 mikroliter kald Xb med 1% BSA.
Etter vasking av perlene, resuspend den belagte perlepelleten i 120 mikroliter kald Xb, 1% BSA. Oppbevares på is i kjøleskap eller kjølerom. Klargjør motilitetsreaksjonsblandingen som beskrevet i manuskriptet.
Bland reaksjonen raskt og start timeren. Se hele motilitetsreaksjonsblandingen på et lysbilde. Dekk den med et deksel på 18 millimeter x 18 millimeter og forsegl dekselet med smeltet VALAP ved hjelp av en liten pensel.
Hvis du vil oppnå gjennomsnittlige forskyvningshastigheter for en hel populasjon av perler, registrerer du fasekontrast eller fluorescerende stillbilder over tid ved å skanne hele lysbildet. Mål kometlengden for hånd og logg verdiene. Plott kometlengden versus tiden.
Hellingen til den lineære passformen er den gjennomsnittlige veksthastigheten. Velg time lapse-filmer i fasekontrastmikroskopi for å evaluere individuelle perlehastigheter. Avhengig av dråpehastigheten og oppløsningen som kreves, ta bilder hvert 1. til 10. sekund.
Bruk sporingsverktøyet til et hvilket som helst bildebehandlingsprogram for å oppnå perlehastigheter og baner. Blanding av BSA-standarder med Bradford Reagent gir en løsning med graderte blå fargetoner. Absorbansverdier plottes i forhold til standard proteinkonsentrasjoner, og den lineære korrelasjonen brukes til å bestemme resuspenderte proteinkonsentrasjoner.
Blanding av SPVCA-kodede perler og motilitetsmedium som inneholder kappeprotein fører til dannelse av aktinskyer i løpet av få minutter. Skypolarisering skjer på omtrent fem minutter og kometproduksjon på 15 til 20 minutter. Aktinkometer fortsetter å forlenge i mange timer, men en jevn hastighet opprettholdes ikke.
Så perlemotilitet evalueres innen en time. Motilitetsblanding med enten kappeprotein eller gelsolin gir kometer på lignende måte. Aktinskyer polariseres for å danne kometer i løpet av de første 20 minuttene av reaksjonen, og kometer forlenges over tid.
Evaluering av kometlengder målt over tid brukes til å beregne forskyvningshastighet. I fravær av kappeaktivitet dannes aktinskyer rundt perler, men kometdannelse forekommer ikke. Forsiktig håndtering og pipettering av proteiner er avgjørende for å lykkes med denne prosedyren, ikke bare ved fremstilling av motilitetsblandingen, men også ved måling av proteinkonsentrasjoner med Bradford-analysen.
Kometdannelse og perlebaner oppnådd med denne protokollen gjør det mulig å forstå den fysiske bevegelsesmekanismen ved hjelp av myk materie og statistisk fysikkanalyse og biofysisk eksperimentering, inkludert kraftmålinger og mikromanipulering.
Denne protokollen beskriver hvordan man produserer aktinkometer på overflaten av perler ved hjelp av kommersielt tilgjengelige proteiningredienser. Slike systemer etterligner de fremspringende strukturer som finnes i celler, og kan brukes til å undersøke fysiologiske mekanismer for kraftproduksjon på en forenklet måte.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved