Name: technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Vi takker Blake Wu for korrekturlæsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 og NASA NNX16A069A (JCW) og AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

1. Forberedelse af medier og løsninger
<ol><li>Forbered hiPSC-CM vedligeholdelsesmedium ved at blande en 10 ml flaske 50x B27 supplement og 500 ml RPMI 1640 medium. Mediet opbevares ved 4 °C og bruger det inden for en måned. Ækvilibrer mediet til stuetemperatur (RT) før brug.</li>
	<li>Der fremstilles hiPSC-CM-såmedium ved at blande 20 ml serumerstatning og 180 ml hiPSC-CM-vedligeholdelsesmedium (10% fortynding, v/v). Mens frisklavet såmedium foretrækkes, kan det opbevares ved 4 °C i højst 2 ...

<ol>
	<li>Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimated+research+and+development+investment+needed+to+bring+a+new+medicine+to+market,+2009-2018.">Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018.</a> Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+broader+view+of+mechanisms+of+drug+cardiotoxicity.">Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity.</a> Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).</li><li>Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+and+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+for+discovery+of+personalized+cardiovascular+drugs+and+therapeutics.">Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics.</a> Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).</li><li>Kaese, S., Verheule, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+electrophysiology+in+mice:+a+matter+of+size.">Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size.</a> Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).</li><li>Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+correlations+between+cardiac+isomyosins.+A+comparison+of+electrophoretic+and+immunological+properties.">Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).</li><li>Werfel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+circular+RNAs+in+human,+mouse,+and+rat+hearts.">Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+highly+purified+cardiomyocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+small+molecule-modulated+differentiation+and+subsequent+glucose+starvation.">Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+long+QT+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Chen, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGFRA+signaling+contributes+to+filamin+C-related+arrhythmogenic+cardiomyopathy.">Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy.</a> Science Advances. 8 (8), (2022).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells.">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Kitani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-induced+pluripotent+stem+cell+model+of+trastuzumab-induced+cardiac+dysfunction+in+patients+with+breast+cancer.">Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer.</a> Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).</li><li>Matsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+patient-specific+human+iPSC-cardiomyocytes+predicts+individual+drug+safety+and+efficacy+responses+in+vitro.">Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+measure+contraction,+calcium,+and+action+potential+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Greensmith, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+analysis:+an+Excel+based+program+for+the+analysis+of+intracellular+calcium+transients+including+multiple,+simultaneous+regression+analysis.">Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis.</a> Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).</li><li>Ma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+pathogenicity+of+a+genomic+variant+of+uncertain+significance+using+CRISPR/Cas9+and+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).</li><li>Lam, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+transcriptome+signatures+of+calcium+channel+blockers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+premature+termination+codon+mutation+in+MYBPC3+causes+hypertrophic+cardiomyopathy+via+chronic+activation+of+nonsense-mediated+decay.">A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles.">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li><li>Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvoluting+the+cells+of+the+human+heart+with+iPSC+technology:+cell+types,+protocols,+and+uses.">Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses.</a> Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).</li><li>Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+research:+current+approaches+in+cardiac+differentiation,+maturation+strategies,+and+scalable+production.">Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production.</a> Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).</li><li>Zhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+developmental+cues+for+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (5), 117 (2014).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+cardiac+cells+for+drug+and+toxicity+screening+and+disease+modeling:+what+micro-+electrode-array+analyses+can+tell+us.">hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us.</a> Cells. 8 (11), (2019).</li><li>Ng, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phenotyping+of+heteromeric+human+ether-a-go-go-related+gene+potassium+channel+variants+can+discriminate+pathogenic+from+rare+benign+variants.">High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants.</a> Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).</li><li>Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+patch+clamp+in+drug+discovery:+major+breakthroughs+and+innovation+in+the+last+decade.">Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).</li><li>Kozek, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+discovery+of+trafficking-deficient+variants+in+the+cardiac+potassium+channel+KV11.1.">High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1.</a> Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).</li><li>Heyne, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+functional+effects+of+missense+variants+in+voltage-gated+sodium+and+calcium+channels.">Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels.</a> Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+automated+patch-clamp+platform+for+electrophysiological+and+pharmacological+evaluation+of+hiPSC-CMs.">Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs.</a> Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).</li><li>Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+protects+iPSC-CMs+from+hypercontraction+and+facilitates+automated+patch-clamp+based+electrophysiological+study.">Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study.</a> Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).</li><li>Milligan, C. J., M&#246;ller, C., Gamper, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion Channels: Methods and Protocols. , 171-187 (2013).</li></ol>

Human iPSC-teknologi er opstået som en stærk platform for sygdomsmodellering og lægemiddelscreening. Her beskriver vi en detaljeret protokol til måling af hiPSC-CM-kontraktilitet, feltpotentiale, handlingspotentiale og Ca2+ forbigående. Denne protokol giver en omfattende karakterisering af hiPSC-CM kontraktilitet og elektrofysiologi. Disse funktionelle assays er blevet anvendt i flere publikationer fra vores gruppe 12,13,18,24,25,26,27....

Lægemiddeludvikling er en lang og dyr proces. En undersøgelse af nye terapeutiske lægemidler godkendt af US Food and Drug Administration (FDA) mellem 2009 og 2018 rapporterede, at de anslåede medianomkostninger ved kapitaliseret forskning og kliniske forsøg var $ 985 millioner pr. Produkt1. Lægemiddelinduceret kardiotoksicitet er den hyppigste årsag til nedslidning af lægemidler og tilbagetrækning fra markedet2. Især rapporteres kardiotoksicitet blandt flere klasser af terapeutiske lægemidler3. Derfor er vurdering af hjertesikkerhed en afgørende komponent under lægemiddeludviklingsprocessen. Det nuværende paradigme for vurdering af hjertesikkerhed er stadig meget afhængigt af dyremodeller. Artsforskelle fra brugen af dyremodeller anerkendes imidlertid i stigende grad som en primær årsag til unøjagtige forudsigelser for lægemiddelinduceret kardiotoksicitet hos humane patienter4. For eksempel adskiller morfologien af hjertehandlingspotentiale sig væsentligt mellem mennesker og mus på grund af bidragene fra forskellige repolariserende strømme5. Derudover er differentielle isoformer af hjertemyosin og cirkulære RNA'er, der kan påvirke hjertefysiologien, veldokumenterede blandt art 6,7. For at bygge bro over disse huller er det bydende nødvendigt at etablere en pålidelig, effektiv og menneskebaseret model for præklinisk hjertesikkerhedsvurdering.
Den banebrydende opfindelse af induceret pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) har genereret hidtil usete lægemiddelscreenings- og sygdomsmodelleringsplatforme. I løbet af det sidste årti er metoder til at generere menneskeskabte pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) blevet veletablerede 8,9. hiPSC-CM'er har tiltrukket stor interesse for deres potentielle anvendelser inden for sygdomsmodellering, lægemiddelinduceret kardiotoksicitetsscreening og præcisionsmedicin. For eksempel er hiPSC-CM'er blevet brugt til at modellere de patologiske fænotyper af hjertesygdomme forårsaget af genetisk arv, såsom langt QT-syndrom10, hypertrofisk kardiomyopati 11,12 og dilateret kardiomyopati13,14,15. Derfor er der identificeret vigtige signalveje, der er impliceret i patogenesen af hjertesygdomme, som kan kaste lys over potentielle terapeutiske strategier for effektiv behandling. Desuden er hiPSC-CM'er blevet brugt til at screene lægemiddelinduceret kardiotoksicitet forbundet med kræftmidler, herunder doxorubicin, trastuzumab og tyrosinkinasehæmmere16,17,18; Strategier til at afbøde den resulterende kardiotoksicitet er ved at blive undersøgt. Endelig giver den genetiske information, der opbevares i hiPSC-CM'er, mulighed for screening og forudsigelse af lægemiddelinduceret kardiotoksicitet på både individ- og befolkningsniveau19,20. Samlet set har hiPSC-CM'er vist sig at være et uvurderligt værktøj til personlig forudsigelse af hjertesikkerhed.
Det overordnede mål med denne protokol er at etablere metoder til omfattende og effektivt at undersøge de funktionelle egenskaber ved hiPSC-CM'er, som er af stor betydning for anvendelse af hiPSC-CM'er til sygdomsmodellering, lægemiddelinduceret kardiotoksicitetsscreening og præcisionsmedicin. Her beskriver vi en række funktionelle assays for at vurdere de funktionelle egenskaber ved hiPSC-CM'er, herunder måling af kontraktilitet, feltpotentiale, handlingspotentiale og calcium (Ca2+) håndtering (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B27 supplements</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>E &#38; K Scientific</td>
			<td>EK-27160</td>
			<td>hiPSC-CM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Contraction motion measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Enzymatic dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion&#39;s Integrated Studio (AxIS)</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>navigator software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BF 100-50-10,</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 1 M in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoView 48-well MEA plates</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td>M768-tMEA-48B</td>
			<td>MEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Extracellular matrix medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC 10 USB&#160;patch clamp amplifier</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>89-5000</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F1221</td>
			<td>Ca2+ transient measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hiPSCs</td>
			<td>Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529552</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>hiPSC-CM seeding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH 8&#160;M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DG 4</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td></td>
			<td>Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna-FL automated fluorescence cell counter</td>
			<td>WISBIOMED</td>
			<td>LB-L20001</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro Pro&#160;MEA system</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>MEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular matrix medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10&#160;M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>72068</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Ca2+ transient measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td>hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony SI8000 Cell Motion Imaging System</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td>Contraction motion measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

Lægemiddelinduceret kardiotoksicitet er den førende årsag til nedslidning af lægemidler og tilbagetrækning fra markedet. Derfor er brug af passende prækliniske modeller til vurdering af hjertesikkerhed et kritisk skridt under lægemiddeludvikling. I øjeblikket er hjertesikkerhedsvurdering stadig meget afhængig af dyreforsøg. Dyremodeller er imidlertid plaget af dårlig translationel specificitet for mennesker på grund af artsspecifikke forskelle, især med hensyn til hjerteelektrofysiologiske egenskaber. Der er således et presserende behov for at udvikle en pålidelig, effektiv og menneskebaseret model til præklinisk hjertesikkerhedsvurdering. Humaninducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) er opstået som en uvurderlig in vitro-model til lægemiddelinduceret kardiotoksicitetsscreening og sygdomsmodellering. hiPSC-CM'er kan fås fra personer med forskellig genetisk baggrund og forskellige syge tilstande, hvilket gør dem til en ideel surrogat til at vurdere lægemiddelinduceret kardiotoksicitet individuelt. Derfor er det nødvendigt at etablere metoder til omfattende undersøgelse af hiPSC-CM'ers funktionelle egenskaber. I denne protokol beskriver vi forskellige funktionelle assays, der kan vurderes på hiPSC-CM'er, herunder måling af kontraktilitet, feltpotentiale, handlingspotentiale og calciumhåndtering. Samlet set har inkorporeringen af hiPSC-CM'er i præklinisk hjertesikkerhedsvurdering potentialet til at revolutionere lægemiddeludviklingen.

Denne protokol beskriver, hvordan man måler sammentrækningsbevægelsen, feltpotentialet, handlingspotentialet og Ca2+ forbigående hiPSC-CM'er. Et skematisk diagram, der inkluderer enzymatisk fordøjelse, cellesåning, vedligeholdelse og funktionel assayledning, er vist i figur 1. Dannelsen af hiPSC-CM-monolaget er nødvendig for sammentrækningsbevægelsesmålingen (figur 2B). Et repræsentativt spor af hiPSC-CM'ernes sammentræknings-afslapningsbe...

Watch this Scientific Journal Video about Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Humaninducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) er opstået som en lovende in vitro-model til lægemiddelinduceret kardiotoksicitetsscreening og sygdomsmodellering. Her beskriver vi en protokol til måling af kontraktilitet og elektrofysiologi af hiPSC-CM'er.

Tekniske anvendelser af mikroelektrodearray- og patch-klemmeoptagelser på humaninducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...

Vurdering af hjertesikkerhed er en afgørende komponent under lægemiddeludviklingsprocessen. Human iPSC-afledte kardiomyocytter har vist sig at være en pålidelig, effektiv og menneskebaseret model til præklinisk hjertesikkerhedsvurdering. Vi har etableret metoder til omfattende undersøgelse af de funktionelle egenskaber ved humane iPSC-afledte kardiomyocytter, som er af virkelig vigtig sygdomsmodellering, lægemiddelinduceret cardio toksicitetsscreening og præcisionsmedicin.Den voksende inkorporering af humane iPSC-afledte kardiomyocytter i den prækliniske standardsikkerhedsevalueringsproces har potentialet til at forbedre nøjagtigheden af toksicitetsforudsigelse af en kandidats forbindelser. Begynd med at dyrke de humane iPSC-afledte kardiomyocytter i mindst 10 dage, før målingen foretages. Tænd for temperaturregulatoren og indstil den til 37 grader celsius.Tænd for mikroskopet, kameraet og kuldioxidforsyningen. Fyld vandkappen på pladeholderen med en passende mængde sterilt deioniseret vand. Placer 96-brøndpladen på pladeholderen, og inkuber cellerne i mindst fem minutter.Åbn visningssoftwaren, og indstil derefter kameraets billedhastighed til 75 billeder i sekundet og video- eller billedopløsningen til 1024 x 1024 pixels. Anvend autofokus- og autolysstyrkefunktionerne, optag videoer og billeder af humane iPSC-afledte kardiomyocytter. Placer forsigtigt en otte mikroliter dråbe ekstra cellulær matrixbelægningsopløsning over optageelektrodeområdet i hver brønd i de 48 brøndmikroelektrode arrayplader.Tilsæt derefter tre milliliter sterilt deioniseret vand til området omkring brøndene for at forhindre fordampning af belægningsopløsning. Brug en 200 mikroliter pipettespids til at fjerne det meste af det ekstra cellulære matrixmedium fra brøndoverfladen inden for den samme enkelt række eller søjle uden at røre elektroderne. Frø 50.000 celler pr. Brønd i en otte mikroliter dråbe såmedium over optageelektrodeområdet.Gentag, indtil alle brønde er blevet belagt med celler. Derefter inkuberes mikroelektrode arraypladerne i en befugtet cellekulturinkubator. Tilsæt langsomt 150 mikroliter såmedium til hver brønd i mikroelektrode arraypladerne.På dag 10 efter plettering skal du kontrollere tætheden af spontant slående humant iPSC CM-monolag under et mikroskop. Placer 48 brønd mikroelektrode array plade i optageinstrumentet. Sørg for, at temperaturen er 37 grader celsius og kuldioxid er 5% Åbn navigatorsoftwaren.I det eksperimentelle opsætningsvindue skal du vælge hjerte-realtidskonfiguration og feltpotentialeoptagelser. Anvend spontane eller indsæt slående konfigurationer. I slagdetekteringsparametre skal du indstille detektionstærsklen til 300 mikrovolt, minimum slagperiode til 250 millisekunder og maksimal slagperiode til fem sekunder.Vælg polynomisk regression til beregning af feltpotentialevarighed. Kontroller, om det grundlæggende elektriske aktivitetssignal er modent og stabilt, og anskaf de grundlæggende hjerteaktiviteter i et til tre minutter. Udfør optagelsen 10 dage efter plating.Udskift det humane iPSC CM-vedligeholdelsesmedium med tyrodens opløsning, og lad cellerne akklimatisere sig i 15 minutter. Indsæt temperatursensorerne i kammeret, og sæt 35 millimeter skålen indeni. Juster temperaturen til 37 grader celsius.Træk mikropipetterne fra borosilikatglaskapillærer ved hjælp af en mikropipettetrækker. Fyld mikropipetterne med den intracellulære opløsning, og indsæt dem i holderen, der er tilsluttet hovedtrinnet på plasterklemmeforstærkeren. Åbn anskaffelsessoftwaren, indlæs handlingspotentialeoptagelsesprotokollen, og vælg spændingsklemmekonfigurationen.Indsæt mikropipetten i badopløsningen, og vælg passende enkelthumane iPSC CM'er. Juster og sænk mikropipettens position ved siden af den valgte celle ved hjælp af en mikromanipulator. Når pipettespidsen indsættes i badopløsningen, kontrolleres pipettemodstanden på oscilloskopmonitoren.Placer pipetten tæt på cellen, og strømimpulserne vil falde lidt for at afspejle den stigende tætningsmodstand. Påfør skånsomt sug med undertryk for at øge modstanden. Dette vil danne en gigaseal.Anvend derefter tætningsfunktionen. Påfør yderligere sug for at bryde membranen for at få en hel celleoptagelseskonfiguration. På dette tidspunkt skal du skifte fra spændingsklemmetilstand til aktuel klemmetilstand eller ingen strømindsprøjtning ved hjælp af forstærkerdialogen.Tryk på optageknappen for at generere og gemme handlingspotentialeoptagelsesfiler. Udfør calciumtransient måling mindst 10 dage efter plettering. Forbered frisk tyrodes opløsning og Fura-2 AM lasteopløsning.Aspirer det menneskelige iPSC CM-vedligeholdelsesmedium, og vask kamrene med tyrodes opløsning to gange. Påfør 100 mikroliter Fura-2 AM belastningsopløsning og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur. Udskift Fura-2 AM-lasteopløsningen med tyrodes opløsning og inkuber i mindst fem minutter for fuldstændig deesterificering af Fura-2 AM. Tilsæt en dråbe nedsænkningsolie på 40x olienedsænkningsmålet for et omvendt epifluorescensmikroskop.Placer cellekammeret i mikroskopets sceneadapter. Installer temperaturregulatorledningerne på badekammeret, og indstil det til 37 grader celsius. Installer de elektriske feltstimuleringselektroder, og indstil impulserne til 0,5 hertz med en varighed på 20 millisekunder.Tænd for den ultrahøje hastighed bølgelængde skifter lyskilde, og indstil den til 340 nanometer og 380 nanometer hurtig skiftetilstand. Anvend en eksponeringstid på 20 millisekunder for begge bølgelængder og en optagetid på 20 sekunder. Optag videoen, der afspejler realtidsændringer af calciumtransient, eksporter dataene til et regneark til analyse.Human iPSC-afledt kardiomyocytter monolag blev brugt til sammentrækningsbevægelsesmålingen. Analyse af et spor af sammentrækningsafslapningsbevægelsen ved hjælp af analysatorsoftwaren detekterede sammentrækningerne start, sammentrækningstop, sammentrækningsafslutning, afslapningstop og afslapningsafslutning. Fuld dækning af det humane iPSC-afledte kardiomyocytmonolag blev observeret på alle elektroderne i mikroelektrodearraypladerne.De modne bølgeformer, der blev registreret af hver elektrode, reflekterede hjertefeltpotentialet med identificerbare egenskaber. Efter analyse blev der opnået slagperiode, feltpotentialevarighed og spidsamplitude. Optagelser af hele celleplasterklemmer i den aktuelle fastspændingstilstand registrerede de spontane handlingspotentialer for enkelte kardiomyocytter.Efter analyse blev der opnået flere parametre, herunder amplitude, maksimalt diastolisk potentiale og handlingspotentialevarighed. Efter analysen af calciumbilleddannelse blev F340 ved F380-forhold over tid opnået, og rå spor af stimulerede calciumtransienter blev plottet. Derudover blev parametre som amplitude, diastolisk calcium og calciumhenfald tau opnået.Det er vigtigt at bruge de humane iPSC-afledte kardiomyocytter, der er i gode slagforhold, samt at sikre den høje renhed af de humane iPSC-afledte kardiomyocytter. Denne protokol indeholder fire specifikke teknikker til at studere human iPSC-afledt kardiomyocytfunktionalitet, anden konfiguration eller automatisk, om man skal studere hjerteioniske strømme, der spiller en afgørende rolle i hjertet.

Research

JoVE Journal

Medicine

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Dannelse af humane prostata Epitel Brug Tissue rekombination af Rodent Urogenital Sinus mesenkymet og menneskelige stamceller

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolering og funktionel karakterisering af human Ventrikulær kardiomyocytter fra Fresh Kirurgiske Prøver

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Tissue-simulering Phantoms til vurdering af potentielle nærinfrarøde fluorescensimagografi Applications i Breast Cancer Surgery

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multi-elektrodeformation Optagelser af menneskelige Epileptiske Postoperativ cortexvæv

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Generation af induceret pluripotente stamceller fra Muskelsvindfonden Patienter: Effektiv Integration-fri Omprogrammering af urin afledte celler

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Hurtig og effektiv Generation af rekombinant human pluripotente stamceller ved rekombinase-medieret Cassette Exchange i<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Målrettet og selektiv behandling af pluripotente stamceller-afledt Teratomer ved hjælp af ekstern strålebehandling i et lille dyr Model

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Sarcomere Afkortning af pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter ved hjælp af fluorescerende-tagged Sarcomere proteiner.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Rettet induktion af retinale organoider fra humane pluripotente stamceller

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

Microelectrode Array Registrering af sinoatrial Node Fyring Sats for at identificere iboende hjerte pacemaking defekter i mus

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...