Name: technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

We bedanken Blake Wu voor het proeflezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 en NASA NNX16A069A (JCW) en AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

1. Voorbereiding van media en oplossingen
<ol><li>Bereid hiPSC-CM onderhoudsmedium voor door een fles van 10 ml van 50x B27-supplement en 500 ml RPMI 1640-medium te mengen. Bewaar het medium bij 4 °C en gebruik het binnen een maand. Breng het medium voor gebruik in evenwicht tot kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Bereid hiPSC-CM zaaimedium door 20 ml serumvervanging en 180 ml hiPSC-CM onderhoudsmedium (10% verdunning, v/v) te mengen. Hoewel vers bereid zaaimedium de voorkeur heeft, kan het niet langer d...

<ol>
	<li>Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimated+research+and+development+investment+needed+to+bring+a+new+medicine+to+market,+2009-2018.">Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018.</a> Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+broader+view+of+mechanisms+of+drug+cardiotoxicity.">Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity.</a> Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).</li><li>Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+and+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+for+discovery+of+personalized+cardiovascular+drugs+and+therapeutics.">Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics.</a> Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).</li><li>Kaese, S., Verheule, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+electrophysiology+in+mice:+a+matter+of+size.">Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size.</a> Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).</li><li>Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+correlations+between+cardiac+isomyosins.+A+comparison+of+electrophoretic+and+immunological+properties.">Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).</li><li>Werfel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+circular+RNAs+in+human,+mouse,+and+rat+hearts.">Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+highly+purified+cardiomyocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+small+molecule-modulated+differentiation+and+subsequent+glucose+starvation.">Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+long+QT+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Chen, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGFRA+signaling+contributes+to+filamin+C-related+arrhythmogenic+cardiomyopathy.">Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy.</a> Science Advances. 8 (8), (2022).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells.">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Kitani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-induced+pluripotent+stem+cell+model+of+trastuzumab-induced+cardiac+dysfunction+in+patients+with+breast+cancer.">Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer.</a> Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).</li><li>Matsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+patient-specific+human+iPSC-cardiomyocytes+predicts+individual+drug+safety+and+efficacy+responses+in+vitro.">Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+measure+contraction,+calcium,+and+action+potential+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Greensmith, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+analysis:+an+Excel+based+program+for+the+analysis+of+intracellular+calcium+transients+including+multiple,+simultaneous+regression+analysis.">Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis.</a> Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).</li><li>Ma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+pathogenicity+of+a+genomic+variant+of+uncertain+significance+using+CRISPR/Cas9+and+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).</li><li>Lam, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+transcriptome+signatures+of+calcium+channel+blockers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+premature+termination+codon+mutation+in+MYBPC3+causes+hypertrophic+cardiomyopathy+via+chronic+activation+of+nonsense-mediated+decay.">A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles.">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li><li>Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvoluting+the+cells+of+the+human+heart+with+iPSC+technology:+cell+types,+protocols,+and+uses.">Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses.</a> Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).</li><li>Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+research:+current+approaches+in+cardiac+differentiation,+maturation+strategies,+and+scalable+production.">Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production.</a> Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).</li><li>Zhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+developmental+cues+for+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (5), 117 (2014).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+cardiac+cells+for+drug+and+toxicity+screening+and+disease+modeling:+what+micro-+electrode-array+analyses+can+tell+us.">hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us.</a> Cells. 8 (11), (2019).</li><li>Ng, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phenotyping+of+heteromeric+human+ether-a-go-go-related+gene+potassium+channel+variants+can+discriminate+pathogenic+from+rare+benign+variants.">High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants.</a> Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).</li><li>Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+patch+clamp+in+drug+discovery:+major+breakthroughs+and+innovation+in+the+last+decade.">Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).</li><li>Kozek, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+discovery+of+trafficking-deficient+variants+in+the+cardiac+potassium+channel+KV11.1.">High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1.</a> Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).</li><li>Heyne, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+functional+effects+of+missense+variants+in+voltage-gated+sodium+and+calcium+channels.">Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels.</a> Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+automated+patch-clamp+platform+for+electrophysiological+and+pharmacological+evaluation+of+hiPSC-CMs.">Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs.</a> Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).</li><li>Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+protects+iPSC-CMs+from+hypercontraction+and+facilitates+automated+patch-clamp+based+electrophysiological+study.">Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study.</a> Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).</li><li>Milligan, C. J., M&#246;ller, C., Gamper, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion Channels: Methods and Protocols. , 171-187 (2013).</li></ol>

Menselijke iPSC-technologie is naar voren gekomen als een krachtig platform voor ziektemodellering en medicijnscreening. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het meten van hiPSC-CM contractiliteit, veldpotentiaal, actiepotentiaal en Ca2+ transiënt. Dit protocol biedt een uitgebreide karakterisering van hiPSC-CM contractiliteit en elektrofysiologie. Deze functionele assays zijn toegepast in meerdere publicaties van onze groep 12,13,18,24,25,26,27.<sup class="xr...

De ontwikkeling van geneesmiddelen is een lang en duur proces. Een studie van nieuwe therapeutische geneesmiddelen goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) tussen 2009 en 2018 meldde dat de geschatte mediane kosten van gekapitaliseerd onderzoek en klinische proeven $ 985 miljoen per productbedroegen 1. Geneesmiddel-geïnduceerde cardiotoxiciteit is de belangrijkste oorzaak van drugsverloop en terugtrekking uit de markt2. Met name cardiotoxiciteit wordt gemeld onder meerdere klassen van therapeutische geneesmiddelen3. Daarom is cardiale veiligheidsbeoordeling een cruciaal onderdeel tijdens het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen. Het huidige paradigma voor cardiale veiligheidsbeoordeling is nog steeds sterk afhankelijk van diermodellen. Soortverschillen met het gebruik van diermodellen worden echter steeds meer erkend als een primaire oorzaak van onnauwkeurige voorspellingen voor door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteit bij menselijke patiënten4. De morfologie van cardiale actiepotentiaal verschilt bijvoorbeeld aanzienlijk tussen mensen en muizen vanwege de bijdragen van verschillende repolariserende stromen5. Bovendien zijn differentiële isovormen van cardiale myosine en circulaire RNA's die de hartfysiologie kunnen beïnvloeden goed gedocumenteerd bij soort 6,7. Om deze lacunes te overbruggen, is het noodzakelijk om een betrouwbaar, efficiënt en op mensen gebaseerd model op te stellen voor preklinische cardiale veiligheidsbeoordeling.
De baanbrekende uitvinding van geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie (iPSC) heeft ongekende platforms voor geneesmiddelenscreening en ziektemodellering gegenereerd. In het afgelopen decennium zijn methoden om door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) te genereren, goed ingeburgerdgeworden 8,9. hiPSC-CMs hebben grote belangstelling getrokken voor hun potentiële toepassingen in ziektemodellering, door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en precisiegeneeskunde. HiPSC-CM's zijn bijvoorbeeld gebruikt om de pathologische fenotypen van hartaandoeningen veroorzaakt door genetische overerving te modelleren, zoals lange QT-syndroom10, hypertrofische cardiomyopathie11,12 en gedilateerde cardiomyopathie 13,14,15. Bijgevolg zijn belangrijke signaalroutes geïdentificeerd die betrokken zijn bij de pathogenese van hartaandoeningen, die licht kunnen werpen op potentiële therapeutische strategieën voor een effectieve behandeling. Bovendien zijn hiPSC-CM's gebruikt om door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteit geassocieerd met middelen tegen kanker te screenen, waaronder doxorubicine, trastuzumab en tyrosinekinaseremmers 16,17,18; strategieën om de resulterende cardiotoxiciteit te verminderen worden onderzocht. Ten slotte maakt de genetische informatie die wordt bewaard in hiPSC-CMs de screening en voorspelling van door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteit mogelijk op zowel individueel als populatieniveau19,20. Gezamenlijk hebben hiPSC-CMs bewezen een waardevol hulpmiddel te zijn voor gepersonaliseerde cardiale veiligheidsvoorspelling.
Het algemene doel van dit protocol is om methodologieën vast te stellen om de functionele kenmerken van hiPSC-CMs uitgebreid en efficiënt te onderzoeken, die van groot belang zijn bij het toepassen van hiPSC-CM's voor ziektemodellering, door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en precisiegeneeskunde. Hier beschrijven we een reeks functionele testen om de functionele eigenschappen van hiPSC-CM's te beoordelen, inclusief de meting van contractiliteit, veldpotentiaal, actiepotentiaal en calcium (Ca2 +) handling (figuur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B27 supplements</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>E &#38; K Scientific</td>
			<td>EK-27160</td>
			<td>hiPSC-CM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Contraction motion measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Enzymatic dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion&#39;s Integrated Studio (AxIS)</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>navigator software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BF 100-50-10,</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 1 M in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoView 48-well MEA plates</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td>M768-tMEA-48B</td>
			<td>MEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Extracellular matrix medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC 10 USB&#160;patch clamp amplifier</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>89-5000</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F1221</td>
			<td>Ca2+ transient measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hiPSCs</td>
			<td>Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529552</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>hiPSC-CM seeding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH 8&#160;M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DG 4</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td></td>
			<td>Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna-FL automated fluorescence cell counter</td>
			<td>WISBIOMED</td>
			<td>LB-L20001</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro Pro&#160;MEA system</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>MEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular matrix medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10&#160;M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>72068</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Ca2+ transient measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td>hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony SI8000 Cell Motion Imaging System</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td>Contraction motion measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

Geneesmiddel-geïnduceerde cardiotoxiciteit is de belangrijkste oorzaak van drugsverloop en terugtrekking uit de markt. Daarom is het gebruik van geschikte preklinische cardiale veiligheidsbeoordelingsmodellen een cruciale stap tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen. Momenteel is de beoordeling van de cardiale veiligheid nog steeds sterk afhankelijk van dierstudies. Diermodellen worden echter geplaagd door een slechte translationele specificiteit voor mensen als gevolg van soortspecifieke verschillen, met name in termen van cardiale elektrofysiologische kenmerken. Er is dus dringend behoefte aan de ontwikkeling van een betrouwbaar, efficiënt en op mensen gebaseerd model voor preklinische cardiale veiligheidsbeoordeling. Door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) zijn naar voren gekomen als een waardevol in vitro model voor door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en ziektemodellering. hiPSC-CMs kunnen worden verkregen van personen met verschillende genetische achtergronden en verschillende zieke aandoeningen, waardoor ze een ideaal surrogaat zijn om door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteit individueel te beoordelen. Daarom moeten methodologieën worden vastgesteld om de functionele kenmerken van hiPSC-CMs uitgebreid te onderzoeken. In dit protocol beschrijven we verschillende functionele assays die kunnen worden beoordeeld op hiPSC-CM's, waaronder de meting van contractiliteit, veldpotentiaal, actiepotentiaal en calciumbehandeling. Over het algemeen heeft de integratie van hiPSC-CM's in preklinische cardiale veiligheidsbeoordeling het potentieel om een revolutie teweeg te brengen in de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Dit protocol beschrijft hoe de contractiebeweging, veldpotentiaal, actiepotentiaal en Ca2+ transiënt van hiPSC-CMs kunnen worden gemeten. Een schematisch diagram met de enzymatische spijsvertering, celzaaiing, onderhoud en functionele testgeleiding is weergegeven in figuur 1. De vorming van de hiPSC-CM monolaag is noodzakelijk voor de contractiebewegingsmeting (figuur 2B). Een representatief spoor van de contractie-relaxatiebeweging van hiPSC-CMs is ...

Watch this Scientific Journal Video about Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM's) zijn naar voren gekomen als een veelbelovend in vitro model voor door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en ziektemodellering. Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de contractiliteit en elektrofysiologie van hiPSC-CM's.

Technische toepassingen van micro-elektrode array en patchklemopnamen op door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...

Cardiale veiligheidsbeoordeling is een cruciaal onderdeel tijdens het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen. Menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten hebben bewezen een betrouwbaar, efficiënt en op mensen gebaseerd model te zijn voor preklinische cardiale veiligheidsbeoordeling. We hebben methodologieën opgesteld om het functionele kenmerk van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten uitgebreid te onderzoeken, die van echt belangrijke ziektemodellering, door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en precisiegeneeskunde zijn.De groeiende opname van van humane iPSC afgeleide cardiomyocyten in het standaard preklinische veiligheidsevaluatieproces heeft het potentieel om de nauwkeurigheid van toxiciteitsvoorspelling van de verbindingen van een kandidaat te verbeteren. Begin met het kweken van de menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten gedurende ten minste 10 dagen voordat de meting wordt uitgevoerd. Zet de temperatuurregelaar aan en zet deze op 37 graden.Schakel de microscoop, camera en kooldioxidetoevoer in. Vul de watermantel van de plaathouder met een geschikte hoeveelheid steriel gedeïoniseerd water. Plaats de 96 putplaat op de plaathouder en incubeer de cellen gedurende ten minste vijf minuten.Open de weergavesoftware en stel de framesnelheid van de camera in op 75 frames per seconde en de video- of beeldresolutie op 1024 x 1024 pixels. Pas de autofocus- en automatische helderheidsfuncties toe, neem video's en afbeeldingen op van menselijke iPSC afgeleide cardiomyocyten. Plaats voorzichtig een druppeltje van acht microliter extra cellulaire matrixcoatingoplossing over het opname-elektrodegebied van elke put van de 48 goed micro-elektrode arrayplaten.Voeg vervolgens drie milliliter steriel gedeïoniseerd water toe aan het gebied rond de putten om verdamping van de coatingoplossing te voorkomen. Verwijder met behulp van een pipetpunt van 200 microliter het grootste deel van het extra cellulaire matrixmedium van het putoppervlak binnen dezelfde enkele rij of kolom zonder de elektroden aan te raken. Zaai 50.000 cellen per putje in een druppeltje van acht microliter zaaimedium over het opname-elektrodegebied.Herhaal dit totdat alle putten zijn verguld met cellen. Incubeer vervolgens de micro-elektrode arrayplaten in een bevochtigde celkweekincubator. Voeg langzaam 150 microliter zaaimedium toe aan elk putje van de micro-elektrode arrayplaten.Controleer op dag 10 na het plateren de dichtheid van spontane kloppende menselijke iPSC CM-monolaag onder een microscoop. Plaats de 48-putjes micro-elektrode arrayplaat in het opname-instrument. Zorg ervoor dat de temperatuur 37 graden celsius is en koolstofdioxide 5% Open de navigatorsoftware.Selecteer in het experimentele installatievenster cardiale real-time configuratie en veld potentiële opnames. Pas spontane of plak kloppende configuraties toe. Stel in beatdetectieparameters de detectiedrempel in op 300 microvolt, de minimale slagtijd op 250 milliseconden en de maximale slagtijd op vijf seconden.Selecteer polynomiale regressie voor de berekening van de potentiële duur van het veld. Controleer of het basislijn elektrische activiteitssignaal volwassen en stabiel is en verkrijg de baseline cardiale activiteiten gedurende één tot drie minuten. Voer de opname 10 dagen na de beplating uit.Vervang het menselijke iPSC CM-onderhoudsmedium door de oplossing van tyrode en laat de cellen gedurende 15 minuten acclimatiseren. Plaats de temperatuursensoren in de kamer en plaats de schotel van 35 millimeter erin. Stel de temperatuur in op 37 graden.Trek de micropipetetten uit borosilicaatglasvaten met behulp van een micropipettrekker. Vul de micropipetjes met de intracellulaire oplossing en plaats ze in de houder die is aangesloten op de koptrap van de patchklemversterker. Open de acquisitiesoftware, laad het opnameprotocol voor actiepotentialen en selecteer de configuratie van de spanningsklem.Plaats de micropipet in de badoplossing en selecteer de juiste iPSC-CM's voor één mens. Pas de positie van de micropipet naast de geselecteerde cel aan en verlaag deze met behulp van een micromanipulator. Wanneer de pipetpunt in de badoplossing wordt ingebracht, controleert u op de pipetweerstand op de oscilloscoopmonitor.Plaats de pipet dicht bij de cel en de stroompulsen zullen iets afnemen om de toenemende weerstand van de afdichting weer te geven. Breng zachte zuigkracht met onderdruk aan om de weerstand te verhogen. Dit zal een gigaseal vormen.Pas vervolgens de sealfunctie toe. Pas extra zuigkracht toe om het membraan te breken om een hele celopnameconfiguratie te krijgen. Schakel op dit punt over van de spanningsklemmodus naar de huidige klemmodus of geen stroominjectie met behulp van het versterkerdialoogvenster.Druk op de opnameknop om de potentiële opnamebestanden voor actie te genereren en op te slaan. Voer de calciumtransiënte meting ten minste 10 dagen na het plateren uit. Bereid verse tyrode's oplossing en Fura-2 AM laadoplossing.Aspirateer het menselijke iPSC CM-onderhoudsmedium en was de kamers tweemaal met de oplossing van tyrode. Breng 100 microliter Fura-2 AM laadoplossing aan en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vervang de Fura-2 AM laadoplossing door tyrode's oplossing en incubeer gedurende ten minste vijf minuten voor volledige ontsterving van Fura-2 AM. Voeg een druppel dompelolie toe aan het 40x olie-onderdompelingsdoel van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop.Plaats de celkamer in de podiumadapter van de microscoop. Installeer de draden van de temperatuurregelaar in de badkamer en stel deze in op 37 graden Celsius. Installeer de elektroden voor elektrische veldstimulatie en stel de pulsen in op 0,5 hertz met een duur van 20 milliseconden.Schakel de ultrasnelle golflengte schakelende lichtbron in en stel deze in op 340 nanometer en 380 nanometer snelle schakelmodus. Pas een belichtingstijd van 20 milliseconden toe voor beide golflengten en een opnametijd van 20 seconden. Neem de video op die real-time veranderingen van calciumtransiënt weergeeft, exporteer de gegevens naar een spreadsheet voor analyse.Humane iPSC afgeleide cardiomyocyten monolaag werd gebruikt voor de contractiebewegingsmeting. Analyse van een spoor van de contractie-relaxatiebeweging met behulp van de analyzersoftware detecteerde het begin van de weeën, de contractiepiek, het contractie-einde, de ontspanningspiek en het ontspanningseinde. Volledige dekking van de menselijke iPSC afgeleide cardiomyocyten monolaag werd waargenomen op alle elektroden in de micro-elektrode arrayplaten.De volwassen golfvormen die door elke elektrode werden geregistreerd, weerspiegelden het cardiale veldpotentiaal met identificeerbare kenmerken. Na analyse werden de beatperiode, de duur van het veldpotentiaal en de spike-amplitude verkregen. Whole cell patch clamp opnames in de huidige klemmodus registreerden de spontane actiepotentialen van enkele cardiomyocyten.Na analyse werden verschillende parameters verkregen, waaronder de amplitude, de maximale diastolische potentiaal en de duur van de actiepotentiaal. Na de analyse van calciumbeeldvorming werd F340 door F380-verhouding in de loop van de tijd verkregen en werden ruwe sporen van gestimuleerde calciumtransiënten uitgezet. Bovendien werden parameters zoals amplitude, diastolisch calcium en calciumverval tau verkregen.Het is belangrijk om de menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten te gebruiken die zich in goede kloppende omstandigheden bevinden, en om de hoge zuiverheid van de menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten te garanderen. Dit protocol omvat vier specifieke technieken om menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocytenfunctionaliteit, andere configuratie of automatische onderzoek naar cardiale ionische stromen te bestuderen die een cruciale rol spelen in cardiale

Research

JoVE Journal

Medicine

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Vorming van menselijke prostaat epitheel behulp Tissue recombinatie van knaagdieren Urogenital Sinus Mesenchym en menselijke stamcellen

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Tissue-simuleren Phantoms voor de beoordeling van potentiële nabij-infrarood fluorescentie beeldvorming Toepassingen in Borstkanker Chirurgie

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multi-electrode array Opnamen van Human Epileptische Postoperatieve Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van spierdystrofie patiënten: Efficiënte-Integratie gratis herprogrammeren van Urine-afgeleide cellen

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Snelle en efficiënte generatie van recombinant humaan pluripotente stamcellen door Recombinase-gemedieerde Cassette Exchange in de<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Gerichte en selectieve behandeling van pluripotente stamcel afkomstige Teratomas met behulp van externe Beam straling in een kleine-dier-Model

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Sarcomere Verkorting van Pluripotente Stamcel-Afgeleide Cardiomyocyten met behulp van Fluorescerende-Tagged Sarcomere Eiwitten.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Gerichte inductie van retinale organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

Micro-elektrode array-opname van de vuursnelheid van de sinoatriale knoop om intrinsieke cardiale pacemakingdefecten bij muizen te identificeren

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...