Name: technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Wir danken Blake Wu für das Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 und NASA NNX16A069A (JCW) und AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP) unterstützt.

1. Vorbereitung von Medien und Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie das hiPSC-CM-Wartungsmedium vor, indem Sie eine 10-ml-Flasche 50x B27-Ergänzung und 500 ml RPMI 1640-Medium mischen. Lagern Sie das Medium bei 4 °C und verbrauchen Sie es innerhalb eines Monats. Gleichen Sie das Medium vor Gebrauch auf Raumtemperatur (RT) aus.</li>
	<li>Das hiPSC-CM-Seeding-Medium wird durch Mischen von 20 ml Serumersatz und 180 ml hiPSC-CM-Erhaltungsmedium (10% Verdünnung, v/v) hergestellt. Während frisch zubereitetes S...

<ol>
	<li>Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimated+research+and+development+investment+needed+to+bring+a+new+medicine+to+market,+2009-2018.">Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018.</a> Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+broader+view+of+mechanisms+of+drug+cardiotoxicity.">Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity.</a> Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).</li><li>Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+and+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+for+discovery+of+personalized+cardiovascular+drugs+and+therapeutics.">Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics.</a> Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).</li><li>Kaese, S., Verheule, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+electrophysiology+in+mice:+a+matter+of+size.">Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size.</a> Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).</li><li>Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGFRA+signaling+contributes+to+filamin+C-related+arrhythmogenic+cardiomyopathy.">Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy.</a> Science Advances. 8 (8), (2022).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells.">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Kitani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-induced+pluripotent+stem+cell+model+of+trastuzumab-induced+cardiac+dysfunction+in+patients+with+breast+cancer.">Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer.</a> Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).</li><li>Matsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+patient-specific+human+iPSC-cardiomyocytes+predicts+individual+drug+safety+and+efficacy+responses+in+vitro.">Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+measure+contraction,+calcium,+and+action+potential+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Greensmith, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+analysis:+an+Excel+based+program+for+the+analysis+of+intracellular+calcium+transients+including+multiple,+simultaneous+regression+analysis.">Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis.</a> Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).</li><li>Ma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+pathogenicity+of+a+genomic+variant+of+uncertain+significance+using+CRISPR/Cas9+and+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).</li><li>Lam, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+transcriptome+signatures+of+calcium+channel+blockers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+premature+termination+codon+mutation+in+MYBPC3+causes+hypertrophic+cardiomyopathy+via+chronic+activation+of+nonsense-mediated+decay.">A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles.">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li><li>Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvoluting+the+cells+of+the+human+heart+with+iPSC+technology:+cell+types,+protocols,+and+uses.">Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses.</a> Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).</li><li>Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+research:+current+approaches+in+cardiac+differentiation,+maturation+strategies,+and+scalable+production.">Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production.</a> Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).</li><li>Zhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+developmental+cues+for+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (5), 117 (2014).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+cardiac+cells+for+drug+and+toxicity+screening+and+disease+modeling:+what+micro-+electrode-array+analyses+can+tell+us.">hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us.</a> Cells. 8 (11), (2019).</li><li>Ng, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phenotyping+of+heteromeric+human+ether-a-go-go-related+gene+potassium+channel+variants+can+discriminate+pathogenic+from+rare+benign+variants.">High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants.</a> Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).</li><li>Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+patch+clamp+in+drug+discovery:+major+breakthroughs+and+innovation+in+the+last+decade.">Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).</li><li>Kozek, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+discovery+of+trafficking-deficient+variants+in+the+cardiac+potassium+channel+KV11.1.">High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1.</a> Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).</li><li>Heyne, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+functional+effects+of+missense+variants+in+voltage-gated+sodium+and+calcium+channels.">Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels.</a> Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+automated+patch-clamp+platform+for+electrophysiological+and+pharmacological+evaluation+of+hiPSC-CMs.">Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs.</a> Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).</li><li>Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+protects+iPSC-CMs+from+hypercontraction+and+facilitates+automated+patch-clamp+based+electrophysiological+study.">Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study.</a> Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).</li><li>Milligan, C. J., M&#246;ller, C., Gamper, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion Channels: Methods and Protocols. , 171-187 (2013).</li></ol>

Die humane iPSC-Technologie hat sich zu einer leistungsstarken Plattform für die Krankheitsmodellierung und das Arzneimittelscreening entwickelt. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der hiPSC-CM-Kontraktilität, des Feldpotentials, des Aktionspotentials und des Ca2+-Transienten. Dieses Protokoll bietet eine umfassende Charakterisierung der hiPSC-CM-Kontraktilität und Elektrophysiologie. Diese funktionellen Assays wurden in mehreren Publikationen unserer Gruppe 12,13,18,24,25,26,27 an...

Die Entwicklung von Medikamenten ist ein langer und teurer Prozess. Eine Studie über neue therapeutische Medikamente, die zwischen 2009 und 2018 von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zugelassen wurden, berichtete, dass die geschätzten Mediankosten für aktivierte Forschung und klinische Studien 985 Millionen US-Dollar pro Produktbetrugen 1. Arzneimittelinduzierte Kardiotoxizität ist die Hauptursache für Arzneimittelabnutzung und Rückzug vom Markt2. Insbesondere wird Kardiotoxizität unter mehreren Klassen von Therapeutika berichtet3. Daher ist die kardiale Sicherheitsbewertung eine entscheidende Komponente während des Arzneimittelentwicklungsprozesses. Das derzeitige Paradigma für die kardiale Sicherheitsbewertung ist immer noch stark von Tiermodellen abhängig. Speziesunterschiede von der Verwendung von Tiermodellen werden jedoch zunehmend als Hauptursache für ungenaue Vorhersagen für medikamenteninduzierte Kardiotoxizität bei menschlichen Patienten erkannt4. Zum Beispiel unterscheidet sich die Morphologie des kardialen Aktionspotentials zwischen Mensch und Maus aufgrund der Beiträge verschiedener repolarisierender Ströme erheblich5. Darüber hinaus wurden differentielle Isoformen von kardialem Myosin und zirkulären RNAs, die die Herzphysiologie beeinflussen können, bei Spezies 6,7 gut dokumentiert. Um diese Lücken zu schließen, ist es unerlässlich, ein zuverlässiges, effizientes und humanbasiertes Modell für die präklinische kardiale Sicherheitsbewertung zu etablieren.
Die bahnbrechende Erfindung der Technologie für induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) hat beispiellose Plattformen für das Arzneimittelscreening und die Krankheitsmodellierung geschaffen. In den letzten zehn Jahren haben sich Methoden zur Erzeugung humaninduzierter pluripotenter Stammzell-abgeleiteter Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) gut etabliert 8,9. hiPSC-CMs haben großes Interesse an ihren potenziellen Anwendungen in der Krankheitsmodellierung, im medikamenteninduzierten Kardiotoxizitätsscreening und in der Präzisionsmedizin geweckt. Zum Beispiel wurden hiPSC-CMs verwendet, um die pathologischen Phänotypen von Herzerkrankungen zu modellieren, die durch genetische Vererbung verursacht werden, wie das Long-QT-Syndrom10, die hypertrophe Kardiomyopathie 11,12 und die dilatative Kardiomyopathie13,14,15. Folglich wurden wichtige Signalwege identifiziert, die an der Pathogenese von Herzerkrankungen beteiligt sind und Aufschluss über mögliche therapeutische Strategien für eine wirksame Behandlung geben können. Darüber hinaus wurden hiPSC-CMs verwendet, um medikamenteninduzierte Kardiotoxizität im Zusammenhang mit Antikrebsmitteln, einschließlich Doxorubicin, Trastuzumab und Tyrosinkinase-Inhibitoren, zu screenen16,17,18; Strategien zur Milderung der daraus resultierenden Kardiotoxizität werden derzeit untersucht. Schließlich ermöglicht die in hiPSC-CMs zurückgehaltene genetische Information das Screening und die Vorhersage der medikamenteninduzierten Kardiotoxizität sowohl auf individueller als auch auf Bevölkerungsebene19,20. Insgesamt haben sich hiPSC-CMs als unschätzbares Werkzeug für die personalisierte Vorhersage der kardialen Sicherheit erwiesen.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Methoden zur umfassenden und effizienten Untersuchung der funktionellen Eigenschaften von hiPSC-CMs zu etablieren, die für die Anwendung von hiPSC-CMs für die Krankheitsmodellierung, das medikamenteninduzierte Kardiotoxizitätsscreening und die Präzisionsmedizin von großer Bedeutung sind. Hier beschreiben wir eine Reihe von funktionellen Assays zur Beurteilung der funktionellen Eigenschaften von hiPSC-CMs, einschließlich der Messung der Kontraktilität, des Feldpotentials, des Aktionspotentials und der Handhabung von Kalzium (Ca2+) (Abbildung 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B27 supplements</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>E &#38; K Scientific</td>
			<td>EK-27160</td>
			<td>hiPSC-CM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Contraction motion measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Enzymatic dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion&#39;s Integrated Studio (AxIS)</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>navigator software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BF 100-50-10,</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 1 M in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoView 48-well MEA plates</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td>M768-tMEA-48B</td>
			<td>MEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Extracellular matrix medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC 10 USB&#160;patch clamp amplifier</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>89-5000</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F1221</td>
			<td>Ca2+ transient measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hiPSCs</td>
			<td>Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529552</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>hiPSC-CM seeding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH 8&#160;M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DG 4</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td></td>
			<td>Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna-FL automated fluorescence cell counter</td>
			<td>WISBIOMED</td>
			<td>LB-L20001</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro Pro&#160;MEA system</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>MEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular matrix medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10&#160;M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>72068</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Ca2+ transient measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td>hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony SI8000 Cell Motion Imaging System</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td>Contraction motion measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

Arzneimittelinduzierte Kardiotoxizität ist die Hauptursache für Arzneimittelabnutzung und Rückzug vom Markt. Daher ist die Verwendung geeigneter präklinischer kardialer Sicherheitsbewertungsmodelle ein kritischer Schritt bei der Arzneimittelentwicklung. Derzeit hängt die kardiale Sicherheitsbewertung noch stark von Tierversuchen ab. Tiermodelle sind jedoch aufgrund artspezifischer Unterschiede, insbesondere in Bezug auf kardiale elektrophysiologische Eigenschaften, von einer schlechten translationalen Spezifität für den Menschen geplagt. Daher besteht ein dringender Bedarf, ein zuverlässiges, effizientes und humanbasiertes Modell für die präklinische kardiale Sicherheitsbewertung zu entwickeln. Human-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) haben sich als unschätzbares In-vitro-Modell für das medikamenteninduzierte Kardiotoxizitätsscreening und die Krankheitsmodellierung herausgestellt. hiPSC-CMs können von Personen mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen und verschiedenen Krankheitszuständen erhalten werden, was sie zu einem idealen Surrogat macht, um die medikamenteninduzierte Kardiotoxizität individuell zu beurteilen. Daher müssen Methoden zur umfassenden Untersuchung der funktionellen Merkmale von hiPSC-CMs festgelegt werden. In diesem Protokoll beschreiben wir verschiedene funktionelle Assays, die an hiPSC-CMs bewertet werden können, einschließlich der Messung der Kontraktilität, des Feldpotentials, des Aktionspotentials und der Kalziumhandhabung. Insgesamt hat die Einbeziehung von hiPSC-CMs in die präklinische kardiale Sicherheitsbewertung das Potenzial, die Arzneimittelentwicklung zu revolutionieren.

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Kontraktionsbewegung, das Feldpotential, das Aktionspotential und der Ca2+ -Transient von hiPSC-CMs gemessen werden. Ein schematisches Diagramm einschließlich der enzymatischen Verdauung, Zellaussaat, Aufrechterhaltung und funktionellen Assay-Leitung ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Bildung der hiPSC-CM-Monoschicht ist für die Messung der Kontraktionsbewegung notwendig (Abbildung 2B). Eine repräsentative Spur...

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Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Human-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) haben sich als vielversprechendes In-vitro-Modell für das medikamenteninduzierte Kardiotoxizitätsscreening und die Krankheitsmodellierung herausgestellt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der Kontraktilität und Elektrophysiologie von hiPSC-CMs.

Technische Anwendungen von Mikroelektrodenarray- und Patch-Clamp-Aufnahmen an humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...

Die kardiale Sicherheitsbewertung ist eine entscheidende Komponente während des Arzneimittelentwicklungsprozesses. Humane iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten haben sich als zuverlässiges, effizientes und humanbasiertes Modell für die präklinische kardiale Sicherheitsbewertung erwiesen. Wir haben Methoden etabliert, um die funktionellen Eigenschaften von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten umfassend zu untersuchen, die von wirklich wichtiger Krankheitsmodellierung, medikamenteninduziertem Cardio-Toxizitäts-Screening und Präzisionsmedizin sind.Die zunehmende Einbeziehung humaner iPSC-abgeleiteter Kardiomyozyten in den standardmäßigen präklinischen Sicherheitsbewertungsprozess hat das Potenzial, die Genauigkeit der Toxizitätsvorhersage der Verbindungen eines Kandidaten zu verbessern. Beginnen Sie mit der Kultivierung der humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten für mindestens 10 Tage, bevor Sie die Messung durchführen. Schalten Sie den Temperaturregler ein und stellen Sie ihn auf 37 Grad Celsius ein.Schalten Sie das Mikroskop, die Kamera und die Kohlendioxidversorgung ein. Füllen Sie den Wassermantel des Plattenhalters mit einer angemessenen Menge sterilen entionisierten Wassers. Legen Sie die 96-Well-Platte auf den Plattenhalter und inkubieren Sie die Zellen mindestens fünf Minuten lang.Öffnen Sie die Ansichtssoftware und stellen Sie die Bildrate der Kamera auf 75 Bilder pro Sekunde und die Video- oder Bildauflösung auf 1024 x 1024 Pixel ein. Wenden Sie die Autofokus- und Autohelligkeitsfunktionen an, nehmen Sie Videos und Bilder von menschlichen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten auf. Platzieren Sie vorsichtig einen acht Mikroliter Tröpfchen extra zellulärer Matrixbeschichtungslösung über die Aufnahmeelektrodenfläche jeder Vertiefung der 48 Mikroelektroden-Array-Platten.Fügen Sie dann drei Milliliter steriles entionisiertes Wasser in den Bereich um die Brunnen hinzu, um die Verdunstung der Beschichtungslösung zu verhindern. Entfernen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze den größten Teil des extrazellulären Matrixmediums von der Vertiefungsoberfläche innerhalb derselben einzelnen Reihe oder Säule, ohne die Elektroden zu berühren. Aussaat von 50.000 Zellen pro Vertiefung in einem acht Mikroliter Tröpfchen Seeding Medium über die Aufzeichnungselektrodenfläche.Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Vertiefungen mit Zellen plattiert sind. Dann inkubieren Sie die Mikroelektroden-Array-Platten in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator. Fügen Sie langsam 150 Mikroliter Seeding Medium in jede Vertiefung der Mikroelektroden-Array-Platten hinzu.Überprüfen Sie am Tag 10 nach der Beschichtung die Dichte der spontan schlagenden menschlichen iPSC CM-Monoschicht unter einem Mikroskop. Setzen Sie die 48-Well-Mikroelektroden-Array-Platte in das Aufnahmegerät ein. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur 37 Grad Celsius und Kohlendioxid 5% beträgtÖffnen Sie die Navigator-Software.Wählen Sie im Fenster für den Versuchsaufbau die kardiale Echtzeitkonfiguration und Feldpotentialaufzeichnungen aus. Wenden Sie spontane oder pastöse schlagende Konfigurationen an. Legen Sie unter Beat-Erkennungsparameter die Erkennungsschwelle auf 300 Mikrovolt, die minimale Schlagdauer auf 250 Millisekunden und die maximale Schlagdauer auf fünf Sekunden fest.Wählen Sie die Polynomregression für die Berechnung der Feldpotentialdauer aus. Überprüfen Sie, ob das Ausgangssignal der elektrischen Aktivität ausgereift und stabil ist, und erfassen Sie die grundlegenden Herzaktivitäten für ein bis drei Minuten. Führen Sie die Aufnahme 10 Tage nach der Beschichtung durch.Ersetzen Sie das humane iPSC CM-Erhaltungsmedium durch Tyrodenlösung und lassen Sie die Zellen 15 Minuten akklimatisieren. Stecken Sie die Temperatursensoren in die Kammer und legen Sie die 35-Millimeter-Schüssel hinein. Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein.Ziehen Sie die Mikropipetten mit einem Mikropipettenzieher aus Borosilikatglaskapillaren. Füllen Sie die Mikropipetten mit der intrazellulären Lösung und führen Sie sie in den Halter ein, der mit der Kopfstufe des Patchklemmverstärkers verbunden ist. Öffnen Sie die Erfassungssoftware, laden Sie das Aktionspotentialaufzeichnungsprotokoll und wählen Sie die Konfiguration der Spannungsklemme aus.Führen Sie die Mikropipette in die Badlösung ein und wählen Sie geeignete einzelne menschliche iPSC-CMs aus. Stellen Sie die Position der Mikropipette neben der ausgewählten Zelle mit einem Mikromanipulator ein und senken Sie sie. Wenn die Pipettenspitze in die Badelösung eingeführt wird, überprüfen Sie den Pipettenwiderstand am Oszilloskopmonitor.Positionieren Sie die Pipette in der Nähe der Zelle, und die Stromimpulse nehmen leicht ab, um den zunehmenden Dichtungswiderstand widerzuspiegeln. Wenden Sie eine sanfte Absaugung mit Unterdruck an, um den Widerstand zu erhöhen. Dies wird ein Gigasiegel bilden.Wenden Sie dann die Siegelfunktion an. Wenden Sie zusätzliche Absaugung an, um die Membran zu brechen, um eine vollständige Zellaufzeichnungskonfiguration zu erhalten. Wechseln Sie an dieser Stelle über den Verstärkerdialog vom Spannungszangenmodus in den Stromzangenmodus oder keine Stromeinspeisung.Drücken Sie die Aufnahmetaste, um die Aktionspotential-Aufzeichnungsdateien zu generieren und zu speichern. Führen Sie die vorübergehende Kalziummessung mindestens 10 Tage nach der Beschichtung durch. Bereiten Sie frische Tyrode-Lösung und Fura-2 AM-Ladelösung vor.Saugen Sie das menschliche iPSC CM-Wartungsmedium ab und waschen Sie die Kammern zweimal mit Tyrode-Lösung. Tragen Sie 100 Mikroliter Fura-2 AM Ladelösung auf und inkubieren Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie die Fura-2 AM-Ladelösung durch Tyrode-Lösung und inkubieren Sie mindestens fünf Minuten lang, um Fura-2 AM vollständig zu entsternen. Fügen Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das 40-fache Ölimmersionsobjektiv eines inversen Epifluoreszenzmikroskops hinzu.Setzen Sie die Zellkammer in den Tischadapter des Mikroskops ein. Installieren Sie die Kabel des Temperaturreglers an der Badekammer und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein. Installieren Sie die elektrischen Feldstimulationselektroden und stellen Sie die Impulse auf 0,5 Hertz mit einer Dauer von 20 Millisekunden ein.Schalten Sie die ultraschnelle Wellenlängenumschaltlichtquelle ein und stellen Sie sie auf 340 Nanometer und 380 Nanometer schnellen Schaltmodus ein. Wenden Sie eine Belichtungszeit von 20 Millisekunden für beide Wellenlängen und eine Aufnahmezeit von 20 Sekunden an. Nehmen Sie das Video auf, das Echtzeitänderungen von Kalzium transient widerspiegelt, und exportieren Sie die Daten zur Analyse in eine Tabelle.Humane iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten-Monoschicht wurde für die Messung der Kontraktionsbewegung verwendet. Die Analyse einer Spur der Kontraktionsrelaxationsbewegung mit der Analysesoftware erkannte den Kontraktionsbeginn, den Kontraktionspeak, das Kontraktionsende, den Relaxationspeak und das Relaxationsende. Die vollständige Abdeckung der humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten-Monoschicht wurde auf allen Elektroden innerhalb der Mikroelektroden-Array-Platten beobachtet.Die von jeder Elektrode aufgezeichneten reifen Wellenformen reflektierten das Herzfeldpotential mit identifizierbaren Eigenschaften. Nach der Analyse wurden Schlagperiode, Feldpotentialdauer und Spikeamplitude ermittelt. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen im aktuellen Klemmmodus zeichneten die spontanen Aktionspotentiale einzelner Kardiomyozyten auf.Nach der Analyse wurden mehrere Parameter, einschließlich der Amplitude, des maximalen diastolischen Potentials und der Aktionspotentialdauer, erhalten. Nach der Analyse der Kalziumbildgebung wurde das Verhältnis von F340 zu F380 im Laufe der Zeit erhalten, und rohe Spuren stimulierter Kalziumtransienten wurden aufgetragen. Zusätzlich wurden Parameter wie Amplitude, diastolisches Kalzium und Kalziumzerfall Tau erhalten.Es ist wichtig, die humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten zu verwenden, die sich in guten Schlagbedingungen befinden, sowie die hohe Reinheit der humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten sicherzustellen. Dieses Protokoll umfasst vier spezifische Techniken zur Untersuchung der kardiomyozyten Funktionalität von humanen iPSC, anderer Konfiguration oder automatischer Untersuchung, ob kardiale Ionenströme untersucht werden sollen, die eine entscheidende Rolle bei der kardialen

Research

JoVE Journal

Medicine

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Formation of Human Prostate Epithel Mit Tissue Rekombination von Nagetier Urogenitalsinus Mesenchym und menschlichen Stammzellen

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Forschung

Medizin

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Gewebe-Simulation Phantoms zur Bestimmung der potentiellen Near-Infrarot-Fluoreszenz-Imaging-Anwendungen in Brustkrebschirurgie

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multi-Elektroden-Array Recordings of Human Epileptische Postoperative Rindengewebe

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten: Effiziente Integration freie Neuprogrammierung der Urin-abgeleiteten Zellen

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Eine schnelle und effiziente Erzeugung von rekombinanten humanen pluripotenten Stammzellen durch Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch in der<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Gezielte und selektive Behandlung von pluripotenten Stammzellen abgeleitet darum mit externen Strahl Strahlung in einem kleinen Tier-Modell

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Sarkomere-Verkürzung von pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten unter Verwendung fluoreszierender Sarkomere-Proteine.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Gerichtete Induktion retinaler Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung der Sinoatrialknoten-Feuerrate zur Identifizierung intrinsischer Herzschrittmacherfehler bei Mäusen

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...