Name: technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

원고를 교정해 주신 Blake Wu에게 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 및 NASA NNX16A069A (JCW) 및 AHA 박사후 연구원 872244 (GMP)의 지원을 받았습니다.

1. 매체 및 용액 준비
<ol><li>50x B27 보충제 10mL 병과 RPMI 1640 배지 500mL를 혼합하여 hiPSC-CM 유지 배지를 준비합니다. 배지를 4 ° C에 보관하고 한 달 이내에 사용하십시오. 사용하기 전에 매체를 실온(RT)으로 평형화하십시오.</li>
	<li>혈청 대체 배지 20mL와 hiPSC-CM 유지 배지 180mL(10% 희석, v/v)를 혼합하여 hiPSC-CM 파종 배지를 준비합니다. 신선하게 준비된 파종 배지가 선호되지만 4 ° C에서 2 주...

<ol>
	<li>Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimated+research+and+development+investment+needed+to+bring+a+new+medicine+to+market,+2009-2018.">Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018.</a> Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+broader+view+of+mechanisms+of+drug+cardiotoxicity.">Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity.</a> Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).</li><li>Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+and+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+for+discovery+of+personalized+cardiovascular+drugs+and+therapeutics.">Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics.</a> Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).</li><li>Kaese, S., Verheule, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+electrophysiology+in+mice:+a+matter+of+size.">Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size.</a> Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).</li><li>Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+correlations+between+cardiac+isomyosins.+A+comparison+of+electrophoretic+and+immunological+properties.">Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).</li><li>Werfel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+circular+RNAs+in+human,+mouse,+and+rat+hearts.">Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+highly+purified+cardiomyocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+small+molecule-modulated+differentiation+and+subsequent+glucose+starvation.">Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+long+QT+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Chen, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGFRA+signaling+contributes+to+filamin+C-related+arrhythmogenic+cardiomyopathy.">Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy.</a> Science Advances. 8 (8), (2022).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells.">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Kitani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-induced+pluripotent+stem+cell+model+of+trastuzumab-induced+cardiac+dysfunction+in+patients+with+breast+cancer.">Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer.</a> Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).</li><li>Matsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+patient-specific+human+iPSC-cardiomyocytes+predicts+individual+drug+safety+and+efficacy+responses+in+vitro.">Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+measure+contraction,+calcium,+and+action+potential+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Greensmith, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+analysis:+an+Excel+based+program+for+the+analysis+of+intracellular+calcium+transients+including+multiple,+simultaneous+regression+analysis.">Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis.</a> Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).</li><li>Ma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+pathogenicity+of+a+genomic+variant+of+uncertain+significance+using+CRISPR/Cas9+and+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).</li><li>Lam, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+transcriptome+signatures+of+calcium+channel+blockers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+premature+termination+codon+mutation+in+MYBPC3+causes+hypertrophic+cardiomyopathy+via+chronic+activation+of+nonsense-mediated+decay.">A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles.">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li><li>Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvoluting+the+cells+of+the+human+heart+with+iPSC+technology:+cell+types,+protocols,+and+uses.">Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses.</a> Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).</li><li>Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+research:+current+approaches+in+cardiac+differentiation,+maturation+strategies,+and+scalable+production.">Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production.</a> Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).</li><li>Zhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+developmental+cues+for+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (5), 117 (2014).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+cardiac+cells+for+drug+and+toxicity+screening+and+disease+modeling:+what+micro-+electrode-array+analyses+can+tell+us.">hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us.</a> Cells. 8 (11), (2019).</li><li>Ng, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phenotyping+of+heteromeric+human+ether-a-go-go-related+gene+potassium+channel+variants+can+discriminate+pathogenic+from+rare+benign+variants.">High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants.</a> Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).</li><li>Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+patch+clamp+in+drug+discovery:+major+breakthroughs+and+innovation+in+the+last+decade.">Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).</li><li>Kozek, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+discovery+of+trafficking-deficient+variants+in+the+cardiac+potassium+channel+KV11.1.">High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1.</a> Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).</li><li>Heyne, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+functional+effects+of+missense+variants+in+voltage-gated+sodium+and+calcium+channels.">Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels.</a> Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+automated+patch-clamp+platform+for+electrophysiological+and+pharmacological+evaluation+of+hiPSC-CMs.">Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs.</a> Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).</li><li>Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+protects+iPSC-CMs+from+hypercontraction+and+facilitates+automated+patch-clamp+based+electrophysiological+study.">Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study.</a> Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).</li><li>Milligan, C. J., M&#246;ller, C., Gamper, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion Channels: Methods and Protocols. , 171-187 (2013).</li></ol>

인간 iPSC 기술은 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 위한 강력한 플랫폼으로 부상했습니다. 여기에서는 hiPSC-CM 수축성, 전계자전위, 활동전위 및Ca2+ 과도 상태를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 hiPSC-CM 수축성 및 전기 생리학의 포괄적인 특성화를 제공합니다. 이러한 기능적 분석은 우리 그룹 12,13,18,24,25,26,27의 여러 간행물에 적용되었습니다.<s...

약물 개발은 길고 비용이 많이 드는 과정입니다. 2009년과 2018년 사이에 미국 식품의약국(FDA)에서 승인한 신약 치료에 대한 연구에 따르면 자본화된 연구 및 임상 시험의 예상 중간비용은 제품당 9억 8,500만 달러였습니다1. 약물 유발 심장 독성은 약물 소모 및 시장 철수의 주요 원인입니다2. 특히, 심장 독성은 여러 종류의 치료 약물3에서 보고됩니다. 따라서 심장 안전성 평가는 약물 개발 과정에서 중요한 구성 요소입니다. 심장 안전성 평가를위한 현재의 패러다임은 여전히 동물 모델에 크게 의존합니다. 그러나, 동물 모델의 사용으로부터의 종 차이는 인간 환자에서 약물 유도 심장 독성에 대한 부정확 한 예측의 주요 원인으로 점점 더 인식되고있다4. 예를 들어, 심장 활동 전위의 형태는 상이한 재분극 전류5로부터의 기여로 인해 인간과 마우스 사이에 실질적으로 다르다. 또한, 심장 생리학에 영향을 줄 수있는 심장 미오신 및 원형 RNA의 차등 이소 형은 종 6,7에서 잘 문서화되었습니다. 이러한 격차를 해소하려면 전임상 심장 안전성 평가를 위한 신뢰할 수 있고 효율적이며 인간 기반 모델을 구축하는 것이 필수적입니다.
유도만능줄기세포(iPSC) 기술의 획기적인 발명은 전례 없는 약물 스크리닝 및 질병 모델링 플랫폼을 생성했습니다. 지난 10 년 동안 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)를 생성하는 방법은 잘 확립되었습니다 8,9. hiPSC-CM은 질병 모델링, 약물 유발 심장 독성 스크리닝 및 정밀 의학에서의 잠재적 응용 분야에 큰 관심을 끌었습니다. 예를 들어, hiPSC-CM은 긴 QT 증후군 10, 비대성 심근 병증11,12 및 확장 성 심근 병증13,14,15와 같은 유전 적 유전에 의해 유발되는 심장 질환의 병리학 적 표현형을 모델링하는 데 활용되었습니다. 결과적으로 심장 질환의 발병 기전과 관련된 주요 신호 전달 경로가 확인되어 효과적인 치료를위한 잠재적 인 치료 전략을 밝힐 수 있습니다. 또한, hiPSC-CM은 독소루비신, 트라스투주맙 및 티로신 키나제 억제제16,17,18을 포함한 항암제와 관련된 약물 유도 심장 독성을 스크리닝하는 데 사용되었습니다. 결과적인 심장 독성을 완화하기위한 전략이 조사 중입니다. 마지막으로, hiPSC-CM에 보유 된 유전 정보는 개인 및 인구 수준19,20 모두에서 약물 유발 심장 독성의 스크리닝 및 예측을 가능하게합니다. 종합적으로 hiPSC-CM은 개인화된 심장 안전 예측을 위한 귀중한 도구임이 입증되었습니다.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 hiPSC-CM을 질병 모델링, 약물 유발 심장 독성 스크리닝 및 정밀 의학에 적용하는 데 매우 중요한 hiPSC-CM의 기능적 특성을 포괄적이고 효율적으로 조사하는 방법론을 수립하는 것입니다. 여기에서는 수축성, 전계 전위, 활동 전위 및 칼슘(Ca 2+) 처리 측정을 포함하여 hiPSC-CM의 기능적 특성을 평가하기 위한 일련의 기능 분석에 대해 자세히 설명합니다(그림 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B27 supplements</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>E &#38; K Scientific</td>
			<td>EK-27160</td>
			<td>hiPSC-CM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Contraction motion measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Enzymatic dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion&#39;s Integrated Studio (AxIS)</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>navigator software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BF 100-50-10,</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 1 M in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoView 48-well MEA plates</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td>M768-tMEA-48B</td>
			<td>MEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Extracellular matrix medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC 10 USB&#160;patch clamp amplifier</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>89-5000</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F1221</td>
			<td>Ca2+ transient measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hiPSCs</td>
			<td>Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529552</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>hiPSC-CM seeding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH 8&#160;M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DG 4</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td></td>
			<td>Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna-FL automated fluorescence cell counter</td>
			<td>WISBIOMED</td>
			<td>LB-L20001</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro Pro&#160;MEA system</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>MEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular matrix medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10&#160;M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>72068</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Ca2+ transient measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td>hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony SI8000 Cell Motion Imaging System</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td>Contraction motion measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

약물 유발 심장 독성은 약물 소모 및 시장 철수의 주요 원인입니다. 따라서 적절한 전임상 심장 안전성 평가 모델을 사용하는 것은 약물 개발 과정에서 중요한 단계입니다. 현재 심장 안전성 평가는 여전히 동물 연구에 크게 의존하고 있습니다. 그러나 동물 모델은 종 특이적 차이, 특히 심장 전기생리학적 특성 측면에서 인간에 대한 열악한 번역 특이성에 시달리고 있습니다. 따라서, 전임상 심장 안전성 평가를 위한 신뢰할 수 있고, 효율적이며, 인간 기반 모델을 개발하는 것이 시급하다. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)는 약물 유도 심장 독성 스크리닝 및 질병 모델링을위한 귀중한 시험 관 내 모델로 부상했습니다. hiPSC-CM은 다양한 유전적 배경과 다양한 질병 상태를 가진 개인으로부터 얻을 수 있으므로 약물 유발 심장 독성을 개별적으로 평가하는 데 이상적인 대용물입니다. 따라서 hiPSC-CM의 기능적 특성을 종합적으로 조사할 수 있는 방법론을 수립할 필요가 있다. 이 프로토콜에서는 수축성, 전계 전위, 활동 전위 및 칼슘 처리 측정을 포함하여 hiPSC-CM에서 평가할 수 있는 다양한 기능 분석에 대해 자세히 설명합니다. 전반적으로 hiPSC-CM을 전임상 심장 안전성 평가에 통합하면 약물 개발에 혁명을 일으킬 잠재력이 있습니다.

이 프로토콜은 hiPSC-CM의 수축 운동, 전계자전위, 활동전위 및Ca 2+ 과도 상태를 측정하는 방법을 설명합니다. 효소 소화, 세포 파종, 유지 및 기능 분석 전도를 포함하는 개략도가 그림 1에 나와 있습니다. hiPSC-CM 단층의 형성은 수축 운동 측정에 필요합니다(그림 2B). hiPSC-CM의 수축-이완 운동의 대표적인 흔적이 그림 2C에 나?...

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Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)는 약물 유도 심장 독성 스크리닝 및 질병 모델링을위한 유망한 시험관 내 모델로 부상했습니다. 여기에서는 hiPSC-CM의 수축성과 전기 생리학을 측정하기위한 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에 대한 미세 전극 어레이 및 패치 클램프 기록의 기술적 응용

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...

심장 안전성 평가는 약물 개발 과정에서 중요한 구성 요소입니다. 인간 iPSC 유래 심근 세포는 전임상 심장 안전성 평가를위한 신뢰할 수 있고 효율적이며 인간 기반 모델로 입증되었습니다. 우리는 매우 중요한 질병 모델링, 약물 유도 심장 독성 검사 및 정밀 의학의 인간 iPSC 유래 심근 세포의 기능적 특성을 종합적으로 조사하기위한 방법론을 수립했습니다.인간 iPSC 유래 심근 세포가 표준 전임상 안전성 평가 프로세스에 점점 더 많이 통합됨에 따라 후보 화합물의 독성 예측의 정확성을 향상시킬 가능성이 있습니다. 측정을 수행하기 전에 적어도 10일 동안 인간 iPSC 유래 심근세포를 배양함으로써 시작한다. 온도 컨트롤러를 켜고 섭씨 37도로 설정하십시오.현미경, 카메라 및 이산화탄소 공급을 켭니다. 플레이트 홀더의 워터 재킷에 적절한 양의 멸균 탈이온수를 채웁니다. 96 웰 플레이트를 플레이트 홀더 상에 놓고, 세포를 적어도 5분 동안 배양한다.보기 소프트웨어를 연 다음 카메라 프레임 속도를 초당 75프레임으로 설정하고 비디오 또는 이미지 해상도를 1024 x 1024픽셀로 설정합니다. 자동 초점 및 자동 밝기 기능을 적용하고 인간 iPSC 유래 심근 세포의 비디오 및 이미지를 녹화합니다. 8 마이크로 리터 방울의 여분의 세포 매트릭스 코팅 용액을 48 웰 미세 전극 어레이 플레이트의 각 웰의 기록 전극 영역 위에 조심스럽게 놓습니다.그런 다음 코팅 용액 증발을 방지하기 위해 웰 주변 영역에 3 밀리리터의 멸균 탈 이온수를 첨가하십시오. 200 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 전극을 건드리지 않고 동일한 단일 행 또는 컬럼 내의 웰 표면에서 대부분의 추가 세포 매트릭스 배지를 제거합니다. 시드 50, 000 세포를 기록 전극 영역 위에 8 마이크로리터의 시드 배지 액적에 넣는다.모든 웰이 셀로 도금 될 때까지 반복하십시오. 그런 다음 미세전극 어레이 플레이트를 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 배양합니다. 미세 전극 어레이 플레이트의 각 웰에 150 마이크로 리터의 파종 매체를 천천히 첨가합니다.도금 후 10일째에 현미경으로 자발적으로 박동하는 인간 iPSC CM 단층의 밀도를 확인합니다. 48웰 미세전극 어레이 플레이트를 녹음기에 놓습니다. 온도가 섭씨 37도이고 이산화탄소가 5%탐색기 소프트웨어를 엽니다.실험 설정 창에서 심장 실시간 구성 및 현장 전위 기록을 선택합니다. 자발적 또는 붙여넣기 박동 구성을 적용합니다. 비트 감지 매개 변수에서 감지 임계값을 300마이크로볼트로, 최소 박동 기간을 250밀리초로, 최대 박동 기간을 5초로 설정합니다.필드 전위 기간 계산을 위해 다항식 회귀를 선택합니다. 기준선 전기 활동 신호가 성숙하고 안정적인지 확인하고 1-3분 동안 기준선 심장 활동을 획득합니다. 도금 후 10일 후에 녹음을 수행합니다.인간 iPSC CM 유지 배지를 tyrode의 용액으로 교체하고 세포가 15분 동안 적응하도록 합니다. 챔버에 온도 센서를 삽입하고 35mm 접시를 안에 넣습니다. 온도를 섭씨 37도까지 조정하십시오.마이크로 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관에서 마이크로 피펫을 당깁니다. 마이크로 피펫에 세포 내 용액을 채우고 패치 클램프 증폭기의 헤드 스테이지에 연결된 홀더에 삽입합니다. 수집 소프트웨어를 열고 활동 전위 기록 프로토콜을 로드한 다음 전압 클램프 구성을 선택합니다.마이크로 피펫을 수조 용액에 삽입하고 적절한 단일 인간 iPSC CM을 선택합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 선택한 셀 옆에 있는 마이크로 피펫의 위치를 조정하고 내립니다. 피펫 팁을 수조 용액에 삽입하면 오실로스코프 모니터에서 피펫 저항을 확인하십시오.피펫을 셀 가까이에 놓으면 전류 펄스가 약간 감소하여 증가하는 밀봉 저항을 반영합니다. 저항을 높이기 위해 음압으로 부드럽게 흡입하십시오. 이것은 기가 씰을 형성 할 것입니다.그런 다음 씰 기능을 적용하십시오. 추가 흡입을 적용하여 멤브레인을 깨뜨려 전체 셀 기록 구성을 얻습니다. 이 시점에서 전압 클램프 모드에서 전류 클램프 모드로 전환하거나 증폭기 대화 상자를 사용하여 전류 주입 없음으로 전환합니다.녹화 버튼을 눌러 활동 전위 녹화 파일을 생성하고 저장합니다. 도금 후 최소 10일 후에 칼슘 과도 측정을 수행합니다. 신선한 티로드의 용액과 Fura-2 AM 로딩 용액을 준비하십시오.인간 iPSC CM 유지 매체를 흡인하고 tyrode의 용액으로 챔버를 두 번 세척합니다. 100 마이크로 리터의 Fura-2 AM 로딩 용액을 적용하고 실온에서 10 분 동안 배양합니다. Fura-2 AM 로딩 용액을 tyrode의 용액으로 교체하고 Fura-2 AM의 완전한 탈에스테르화를 위해 최소 5분 동안 배양합니다. 도립 에피형광 현미경의 40x 오일 이멀젼 대물렌즈에 액침 오일 한 방울을 추가합니다.현미경의 스테이지 어댑터에 세포실을 놓습니다. 온도 컨트롤러 와이어를 욕조 챔버에 설치하고 섭씨 37도로 설정합니다. 전기장 자극 전극을 설치하고 펄스를 0.5Hz로 설정하고 20밀리초 동안 펄스를 설정합니다.초고속 파장 스위칭 광원을 켜고 340나노미터 및 380나노미터 고속 스위칭 모드로 설정합니다. 두 파장 모두에 대해 20밀리초의 노출 시간과 20초의 기록 시간을 적용합니다. 과도 칼슘의 실시간 변화를 반영하는 비디오를 녹화하고 분석을 위해 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.인간 iPSC 유래 심근세포 단분자층을 수축 운동 측정에 사용하였다. 분석기 소프트웨어를 사용하여 수축 이완 운동의 흔적을 분석한 결과, 수축 시작, 수축 피크, 수축 종료, 이완 피크 및 이완 종료가 검출되었습니다. 인간 iPSC 유래 심근세포 단분자층의 전체 커버리지는 미세전극 어레이 플레이트 내의 모든 전극 상에서 관찰되었다.각 전극에 의해 기록 된 성숙한 파형은 식별 가능한 특성을 가진 심장 전위를 반영했습니다. 분석 후, 비트 기간, 전위 지속 시간 및 스파이크 진폭이 얻어졌다. 전류 클램핑 모드에서의 전체 세포 패치 클램프 기록은 단일 심근 세포의 자발적인 활동 전위를 기록했습니다.분석 후, 진폭, 최대 이완기 전위 및 활동 전위 지속 시간을 포함한 여러 매개 변수가 얻어졌습니다. 칼슘 영상의 분석 후, 시간 경과에 따른 F380 비율에 의한 F340을 얻었고, 자극 된 칼슘 과도 현상의 원시 흔적을 플롯했다. 또한 진폭, 이완기 칼슘 및 칼슘 붕괴 타우와 같은 매개 변수가 얻어졌습니다.양호한 박동 조건에 있는 인간 iPSC 유래 심근세포를 사용하는 것은 물론, 인간 iPSC 유래 심근세포의 고순도를 보장하는 것이 중요하다. 이 프로토콜은 인간 iPSC 유래 심근 세포 기능, 다른 구성 또는 심장에서 중요한 역할을하는 심장 이온 전류를 연구할지 여부를 연구하는 4 가지 특정 기술을 포함합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

설치류 비뇨 부비동 간엽 및 인간 줄기 세포의 조직 재조합을 사용하여 인간의 전립선 상피의 형성

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

연구

의학

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

유방암 수술의 잠재적 인 근적외선 형광 이미징 응용 프로그램을 평가하는 팬텀을 조직 시뮬레이션

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

인간의 간질 수술 후 두피 조직의 다중 전극 어레이 레코딩

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

근육 영양 장애 환자에서 유도 만능 줄기 세포의 생성 : 소변 유래 세포의 효율적인 통합이없는 프로그램을 다시

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

에서 재조합 효소 중재 카세트 교환에 의해 재조합 인간 다 능성 줄기 세포의 신속하고 효율적인 생성<em&gt; AAVS1</em&gt; 로커스

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

만능 줄기 세포 유래 Teratomas 외부 빔 방사선을 사용 하 여 작은 동물 모델에서의 타겟 및 선택적 치료

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

형광 태그 사코레 단백질을 사용하여 다능줄기 세포 유래 심근 세포의 Sarcomere 단축.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

인간 만능 줄기 세포에서 망막 오가노이드의 지시 유도

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

중고심 노드 발사 속도의 마이크로 전극 어레이 기록으로 마우스의 본질적인 심장 페이스메이킹 결함을 식별합니다.

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...